水果中諾如病毒檢測(cè)方法的的優(yōu)化

1、Journal of Virological Methods水果中諾如病毒檢測(cè)方法的優(yōu)化Hee-Yeon Kima, In-Shin Kwakc, In-Gyun Hwangc, GwangPyo Koa,b摘要：食品中諾如病毒(NoV)的檢測(cè)對(duì)于食源性諾如病毒引起的爆發(fā)性疾病的研究和預(yù)防至關(guān)重要。然而，目前諾如病毒的檢測(cè)方法還未有得到很好的檢驗(yàn)或優(yōu)化。本研究中，對(duì)不同水果中NoV的洗脫、PEG富集病毒以及使用RT-PCR提取病毒RNA的各種有效的方法皆進(jìn)行了優(yōu)化。首先，對(duì)6種不同的緩沖液進(jìn)行水果表面NoV病毒的洗脫的方法評(píng)估。即將已知量的諾如病毒噴灑于葡萄、草莓、樹莓表面，采用蒸餾水、0.0

2、5M甘氨酸-0.14M NaCl(pH 7.5)、2.9%胰蛋白磷酸肉湯-6%甘氨酸、100 mM Tris HCl(pH 9.5)、50mM甘氨酸-50mM MgCl2(pH 9.5)和3%的牛肉浸出物等6種緩沖液進(jìn)行洗脫，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明：3%的牛肉浸出物對(duì)病毒的洗脫效果最佳。其次，對(duì)檢測(cè)諾如病毒最常用的沉淀劑-PEG分別進(jìn)行了不同分子量、作用時(shí)間和溫度等三個(gè)因素的進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明：PEG 10000，4h，室溫條件為最佳。最后，對(duì)5種不同的RNA提取方法進(jìn)行評(píng)估，表明：QIAamp Viral RNA Mini kit提取效果最佳。采用優(yōu)化后的方法對(duì)不同水果總諾如病毒的檢測(cè)顯

3、示，將近6-80%的NoV病毒粒子可以檢出。關(guān)鍵詞：諾如病毒；胃腸炎；水果；洗脫；PEG沉淀；核酸提取1. 引言食物傳播性病毒感染是人類疾病的重要因素(Mullendore et al., 2001; Myrmelet al., 2000)，NoVs在遺傳和抗原上屬杯狀病毒屬(Rutjes et al., 2006)，為人類非細(xì)菌性腸胃炎的重要的病原體(Mead et al., 1999; Vinje et al., 1997, 2003)。諾如病毒易感染的場(chǎng)所主要有老人院(Calderon-Margalit et al., 2005)、醫(yī)院、游船、學(xué)校、餐館和一些宴席上(Parashar e

4、t al., 1998; Rutjes et al.,2006)。農(nóng)作物成長(zhǎng)階段的水體污染以及食品加工和包裝過程皆可以引起食品感染諾如病毒。諾如病毒感染的典型食物為帶生的、未煮熟的肉或海鮮（如貝類）、方便食品以及水果和蔬菜等具有日常消費(fèi)的食物(Bosch et al., 2001; Daniels et al., 2000; Guevremont et al., 2006; Hutin et al.,1999; Le Guyader et al., 1994; Potasman et al., 2002; Rosenblum et al., 1990; Rutjes et al., 2006)

5、。因?yàn)檫@些食物都缺少熱處理，因此都具有很高的感染風(fēng)險(xiǎn)。然而，由于缺乏合理的檢測(cè)方法以及食物樣品取樣不便等因素使得諾如病毒引起的食物感染很少能被檢測(cè)到(Cliver, 1995)。進(jìn)一步的研究表明，葡萄、草莓和樹莓等許多水果為許多NoV感染的基質(zhì)(Butot et al., 2007; Hill, 2003; Le Guyader et al.,2004)。因此，開發(fā)和優(yōu)化NoV的檢測(cè)方法對(duì)于預(yù)防和調(diào)查NoV的爆發(fā)具有重要意義。但是目前檢測(cè)諾如病毒方法很少，并且限制于某些食物種類，如大部分諾如病毒的檢測(cè)是針對(duì)貝類產(chǎn)品的(Baert et al., 2007; Dubois et al., 200

6、2; Heller et al., 1986; Jaykus et al., 1996; Kingsley and Richards, 2001; Schultz et al., 2007; Shieh et al., 1999; Sunen and Sobsey, 1999)。本研究評(píng)估和優(yōu)化了水果中諾如病毒檢測(cè)的所有步驟，包括水果中病毒的洗脫、采用PEG進(jìn)行病毒的富集以及RNA的提取。本研究旨在于（1）發(fā)現(xiàn)NoV洗脫的最佳緩沖液，（2）PEG沉淀病毒的最佳條件，（3）通過RNA提取對(duì)病毒進(jìn)行洗脫液和沉淀劑進(jìn)行比較。2. 方法與材料2.1糞便樣本和RT-PCR測(cè)定NoV G-4為引起許多食源

7、性疾病爆發(fā)的基因型，檢測(cè)樣本為韓國(guó)疾控中心獲得的感染諾如病毒的糞便，將其進(jìn)行一系列的稀釋后，采用RT-PCR進(jìn)行定量檢測(cè)。移取以10%懸浮于PBS中的糞便稀釋物140L，采用QIAmp Viral RNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行病毒RNA的提取。RT-PCR采用靶點(diǎn)病毒基因的衣殼編碼區(qū)設(shè)計(jì)兩組引物(Isakbaeva et al., 2005)，分別為：G2-SKF和G2-SKR，擴(kuò)增產(chǎn)物為344bp(Kojima et al., 2002)。病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄條件為42，60min，然后95，15min激活Taq酶，94 1min，40 1min，72 1min，共40個(gè)循環(huán)，最后72延

8、伸10min，每個(gè)循環(huán)都設(shè)陰性對(duì)照以控制反應(yīng)過程。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%的含有EB的凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，糞便樣本中NoV/G-4的濃度約4×106 RT-PCR/mL，所有的糞便樣品儲(chǔ)存于-70備用。2.2不同水果中NoV洗脫緩沖液的優(yōu)化本研究共對(duì)6種不同的緩沖液進(jìn)行評(píng)估(Baert et al., 2008; Dubois et al., 2002; Guevremont et al., 2006; Lewis and Metcalf, 1988; Monpoeho et al., 2001;Mullendore et al., 2001)，包括：（1）蒸餾水；（2）3%的牛肉浸出物（

9、pH 7.1）；（3）0.05 M甘氨酸-0.14M NaCl (pH 7.5)；（4）2.9%胰蛋白胨磷酸肉湯-6%甘氨酸；（5）100mM Tris-HCl(pH 9.5)；（6）50mM MgCl2(pH 9.5)。首先，取10 L 4×106 RT-PCR/mL 感染諾如病毒的糞便懸浮液接種到20g新鮮葡萄、草莓或冷凍樹莓中。接種的水果在超凈臺(tái)內(nèi)靜置30 min使得病毒充分吸附，加入上述6種緩沖液，室溫200 rpm孵育5h。隨后加入等體積的氯仿，漩渦震蕩混勻，2000g，4離心10min，取上清液(Monpoeho et al., 2001)。然后加入PEG 8000使得上

10、清液的終濃度為8 %，震蕩混勻，4孵育過夜（不時(shí)震蕩）。12,000g，4離心30min，去上清，加2mL PBS重懸浮沉淀。采用QIAmp Kit試劑盒提取上述懸浮液，然后采用 OneStep PT-PCR kit 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以最后擴(kuò)增出來的病毒含量與接種到水果表面的病毒含量的比值計(jì)算回收率，共做2個(gè)平行。2.3PEG沉淀劑的優(yōu)化對(duì)PEG的優(yōu)化共進(jìn)行了3個(gè)方面，包括：（1）PEG的分子量；（2）PEG沉淀劑作用的時(shí)間；（3）PEG沉淀劑作用的溫度。分別采用蒸餾水、3%牛肉浸提物、0.05M甘氨酸-0.14M NaCl等三種洗脫液加入葡萄、草莓、樹莓三種水果， 200rpm孵育5h。隨后

11、接種10 L NoV病毒糞便懸浮液（4×104 PT-PCR units）于上述洗脫液中。接種的NoV病毒糞便懸浮液混合MW為6000、8000、10000和20000的PEG，使其在病毒糞便懸浮液中的最終濃度為8%，pH為7.2。漩渦震蕩混勻，室溫孵育4h或4過夜。4，12000g離心30min。去上清，2 mL PBS懸浮沉淀。將懸浮物進(jìn)行一系列稀釋，進(jìn)行病毒RNA的提取以及RT-PCR，共做三個(gè)平行。將NoV病毒RNA進(jìn)行10倍稀釋后采用MPN法（最大可能數(shù)）進(jìn)行NoV的定量。將稀釋后的樣品的PT-PCR陽性數(shù)目與陰性數(shù)目參照MPN表計(jì)算病毒RNA濃度和置信限度(De Man,

12、 1983)。病毒的回收率為PT-PCR后的病毒量與樣本中接種的病毒量之比。2.4 RNA提取的優(yōu)化本研究采用5種不同的方法進(jìn)行了病毒RNA的提取分別為：（1）熱釋放法；（2）硅膠膜法QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)；（3）磁珠法(MagExtractor Viral RNA Purification Kit, Toyobo)；（4）TRIzol試劑法；（5）免疫磁珠分離法。待檢的葡萄、草莓、樹莓三種水果中分別接種10 L NoV糞便懸浮液，加入3%的牛肉浸出物進(jìn)行洗脫。洗脫完畢后，加入PEG 10000，4孵育4h。然后采用上述5中方法進(jìn)行病毒RNA（-8

13、0備用）的提取，并取2.5 L的病毒RNA進(jìn)行25 L體系的PT-PCR反應(yīng)，每種方法做三個(gè)平行。采用熱釋放法提取RNA時(shí)，將PEG沉淀物95加熱10min后立即于冰上降溫。 磁珠法等方法提取病毒RNA嚴(yán)格按照MagExtractor Viral RNA Purification Kit試劑盒說明書進(jìn)行。硅膠膜法提取RNA采用QIAamp kit，取140 L RNA加入560 L的異硫氰酸鹽，再加入等體積的96-100%的乙醇進(jìn)行中和，然后用QIAamp Mini Column試劑盒進(jìn)行病毒RNA 的純化。采用TRIzol法提取RNA時(shí)，將PEG沉淀物以2mL的PBS進(jìn)行懸浮，取淀懸浮液30

14、0 L，加入700L的TRIzol試劑，混勻，室溫靜置5min。加入150L的氯仿，震蕩混勻，室溫靜置15min，4，108g離心15min。上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，-20孵育4 h，4 ，10844 g離心30 min，棄濾液。加入1 mL的75 %乙醇洗脫沉淀，晾干后加入15 L無RNA酶的水進(jìn)行溶解。采用免疫磁化分離法提取NoV RNA，將1 mg/mL的免疫磁珠懸浮液震蕩1 min，充分溶解，加入33 L的磁珠顆粒到磁粉顆粒集中管中，作用2 min直至磁珠移至管的一邊，溶液變得澄清。從管的另一邊小心移取去清液，使磁珠呈穩(wěn)定狀態(tài)。加入0.1M Na- PBS（pH

15、7.4）室溫洗脫磁珠三次后，加入1 mL的0.1M Na-PBS（pH 7.4）（含有5-10 L的兔病毒衣殼IgG抗血清），未結(jié)合的抗血清用含有牛血清白蛋白（BSA）的PBS （pH 7.4）4洗脫4次進(jìn)行去除。進(jìn)行免疫磁化分離的病毒洗脫液加入1/10氯仿進(jìn)行萃取，PEG沉淀按上述操作進(jìn)行，并加入1.5 mL PBS進(jìn)行重懸浮。然后將抗體結(jié)合免疫磁珠慢慢加入1.5 mL的上述懸浮液，于MX4混合儀上室溫旋轉(zhuǎn)混合1 h。孵育完成后，采用上述描述的MPC進(jìn)行分離，用含有牛血清白蛋白（BSA）的PBS （pH 7.4）4洗脫3次，以50 L的DEPC處理水進(jìn)行重懸浮后移至Eppendorf 管中備

16、用。2.5 數(shù)據(jù)分析PEG沉淀法比較分析采用方差分析或KruskalWallis非參量檢驗(yàn)。RNA提取方法的比較采用MannWhitney檢驗(yàn)。所有的統(tǒng)計(jì)分析的完成均采用SPSS進(jìn)行分析，差異顯著為p<0.05。3. 結(jié)果3.1洗脫緩沖液采用6種洗脫緩沖液對(duì)葡萄、木霉和草莓表面NoV病毒進(jìn)行洗脫（表1），結(jié)果顯示：總體來講，從葡萄表面洗脫病毒比從草莓表面洗脫病毒的效率高，草莓中NoV的回收率8.5%（最低檢測(cè)限）。采用50mM甘氨酸-50mM MgCl2（pH 9.5）對(duì)葡萄表面進(jìn)行病毒洗脫時(shí)病毒回收率最低，而采用蒸餾水、0.05M甘氨酸-0.14M NaCl（pH 7.5）、2.9%胰

17、蛋白磷酸鹽-6%甘氨酸均低于最低檢測(cè)限（8.5%），其中采用3%的牛肉浸提物對(duì)葡萄和草莓兩種水果病毒洗脫具有最高的病毒回收率。表1 6種不同的洗脫緩沖液對(duì)葡萄和草莓表面NoV的洗脫效率洗脫緩沖液洗脫效率a葡萄草莓蒸餾水21<8.5b3%牛肉浸提物21850.05M甘氨酸-0.14M NaCl（pH 7.5）21<8.52.9%胰蛋白磷酸鹽-6%甘氨酸<8.5100mM Tris-HCl（pH 9.5）218.550mM甘氨酸-50mM MgCl2（pH 9.5）218.5總體平均回收率17.921.3a：洗脫效率為NoV的回收量與NoV的接種量的百分比，洗脫效率表示的為雙份試

18、驗(yàn)樣品的平均值。b：低于最低檢測(cè)限（8.5%）。3.2 PEG沉淀PEG的分子量對(duì)于不同洗脫液后NoV病毒的沉淀效果的影響見表2。四種不同分子量的PEG沉淀劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PEG10,000的病毒回收率最高，為17.8%，PEG6000、PEG8000、PEG20,000的病毒平均回收率分別為：9.2%、15.5%，其中病毒平均回收率范圍為4.3-19.9%，比草莓的檢測(cè)限（2.6%）低草莓的50.4%，樹莓的為6.6-9.4%。PEG分子量的所有試驗(yàn)結(jié)果表明，具有最高回收率的洗脫緩沖液為3%的牛肉浸提物，草莓中病毒回收率最高的為3%牛肉浸提物+ PEG10,000的病毒回收率最高，但其回收

19、率與其他PEG的病毒回收率相比沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（方差分析試驗(yàn)，p=0.67）。表2 PEG分子量對(duì)于不同洗脫緩沖液洗脫后NoV沉淀的影響水果種類洗脫緩沖液aPEG分子量6000800010,00020,000葡萄A3.4b(0.4-17.2)c<2.6(0.4-7.7)7.7(0.9-30.9)3.4(0.4-17.2)B3.4(0.4-17.2)19.7(3.4-100)19.7(3.4-103)19.7(3.4-100)C7.7(0.9-30.9)<2.6(0.4-7.7)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)草莓A12.9(2.6-39.8)6(0.9-19

20、.7)3.4(0.4-17.2)7.7(0.9-30.9)B18(3.4-40.3)79.8(12.9-100)85.8(30.9-100)18(3.4-40.3)C<2.6(0.4-7.7)<2.6(0.4-7.7)<2.6(0.4-7.7)<2.6(0.4-7.7)木莓A18(3.4-100)12.9(2.6-39.8)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)B9.4(2.6-30.9)6(0.9-19.7)9.4(2.6-30.9)3.4(0.4-17.2)C7.7(0.9-30.9)7.7(0.9-30.9)7.7(0.9-30.9)3.4(0.4-

21、17.2)總計(jì)9.215.517.87.2a：A：蒸餾水；B：3%牛肉浸提物；C：0.05M甘氨酸-0.14M NaClb：按初始接種量為100%計(jì)算NoV的回收百分率。c：95%的置信區(qū)間，采用MPN表對(duì)三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)計(jì)算NoV的病毒回收率。PEG沉淀孵育的時(shí)間同樣也影響NoV的病毒回收率，見表3?？傮w來講，4h的PEG孵育時(shí)間優(yōu)于過夜孵育，且無論何種條件下，3%牛肉浸提物為最佳洗脫緩沖液。采用4h孵育時(shí)，分子量低的PEG的病毒回收率較低，采用3%的牛肉浸提物作為洗脫緩沖液時(shí)，PEG6000和PEG8000的病毒回收率分別為12.9%和8.6%，PEG10,000和PEG20,000的病毒回

22、收率為51.9%和58.4%。然而采用過夜進(jìn)行PEG孵育時(shí)，病毒回收率最高的為PEG10,000。KruskalWallis非參數(shù)比較結(jié)果表明，過夜進(jìn)行PEG孵育和4h孵育沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.543)。表3 PEG孵育時(shí)間對(duì)于不同洗脫緩沖液中NoV病毒沉淀的影響PEG MW洗脫液aPEG孵育過夜PEG孵育4h草莓木莓草莓木莓6,000A12.9b(2.6-37.8)c18(3.4-40.3)3.4(0.4-17.2)12.9（2.6-37.8）B18(3.4-40.3)9.4(2.6-30.9)12.9（2.6-37.8）12.9（2.6-37.8）C<2.6(0.4-7.7)

23、7.7(0.9-30.9)18(3.4-40.3)12.9（2.6-37.8）8,000A6(0.9-19.7)12.9(2.6-37.8)3.4(0.4-17.2)7.7(0.9-30.9)B79.8(12.9-100)6（0.9-19.7）7.7(0.9-30.9)9.4(2.6-30.9)C<2.6(0.4-7.7)7.7（0.9-30.9）12.9(2.6-37.8)6(0.9-19.7)10,000A3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)B85.8(30.9-100)9.4(2.6-30.9)18(3.4-40.

24、3)85.8(30.9-100)C<2.6(0.4-7.7)7.7(0.9-30.9)12.9(2.6-37.8)3.4(0.4-17.2)20,000A7.7(0.9-30.9)3.4(0.4-17.2)<2.6(0.4-7.7)12.9(2.6-37.8)B18（3.4-40.3）3.4(0.4-17.2)36.9(6-100)79.8(12.9-100)C<2.6(0.4-7.7)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)總計(jì)20.27.711.930 a: A：蒸餾水；B：3%牛肉浸提物；C：0.05M甘氨酸-0.14M NaClb

25、:按初始接種量為100%計(jì)算NoV的回收百分率。c: 95%的置信區(qū)間，采用MPN表對(duì)三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)計(jì)算NoV的病毒回收率。3.3 RNA提取方法采用5種不同的病毒RNA提取方法獲得得NoV回收率見表4，眾多方法中，QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA的病毒回收率最高，其中葡萄的病毒回收率為80%（采用MPN表指示單位體積初始樣品的最近似數(shù)），其次依次為熱釋放法、免疫磁化分離法、磁珠法和TRIzol法。草莓和木莓的病毒回收率普遍低于葡萄且二者回收率相近，其中采用QIAamp kit法的病毒回收率分別為6%和8%。采用其他的RNA提取方法，病毒回收率的范圍從未檢測(cè)（TRI

26、zol）出到8%（熱釋放法）。一些RNA的提取方法與它們的回收效率有顯著差異（KruskalWallis檢測(cè)，p=0.025）。表現(xiàn)出顯著性差異的有QIAamp kit與Toyobo MagExtractor ki（p=0.046）t和TRIzol法(p=0.05)之間的差異，然而它與熱釋放法和免疫磁化分離法無顯著差異（p>0.05）。表4 不同RNA提取方法對(duì)NoV回收率的影響RNA提取方法水果回收率（%）a（95%置信限度）P值bQIAampViral RNA Mini Kit葡萄80（12.9-100）n/a草莓8（0.9-19.7）木莓6（2.6-9.3）熱釋放法葡萄14（2-4

27、2）0.658草莓8（1-40）木莓6（1-26）Tpyobo Mag Extract葡萄1.8（0.2-7.2）0.046草莓1.8（0.2-7.2）木莓4.2（0.8-9.4）Trizol 試劑法葡萄0.4（0.1-2）0.050草莓1.5（0.3-4.4）木莓<0.3（<0.3）磁珠免疫分離法葡萄8.6（1.4-4.2）0.121草莓3（0.6-8.8）木莓3（0.6-8.8）a：按初始接種量為100%計(jì)算NoV的回收百分率。其回收率通過查三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的MPN表獲得。 b：通過Mann-Whitney實(shí)驗(yàn)評(píng)估p值，以及比較QIAamp Viral RNA Mini Kit和其

28、它核酸提取的方法。4. 討論盡管NoV為引起食源性疾病的重要病原之一，但是其在食物中的檢測(cè)方法的研究尚未成熟。在NoV爆發(fā)的許多案例中，調(diào)查者對(duì)應(yīng)于可疑的食物很少能加以辨別確認(rèn)，原因如下：(Guevremont et al., 2006)（1）可疑食品難以獲得；（2）不能采用常規(guī)方法對(duì)NoV進(jìn)行培養(yǎng)；（3）從食物中富集病毒的方法效率較低(Rutjes et al., 2006)。NoV不能像其它細(xì)菌性食源性病毒一樣可以再培養(yǎng)基中培養(yǎng)和濃縮，它既不能在體外培養(yǎng)也不能在體內(nèi)濃縮。由于這些原因，NoV的檢測(cè)和濃縮需要從被污染的食物中進(jìn)行洗脫后進(jìn)行濃縮。特別典型的是，食品中NoV的含量很低，且存在很多

29、化學(xué)成分對(duì) NoV的檢測(cè)具有抑制作用。眾多的因素表明，優(yōu)化洗脫和濃縮方法對(duì)于食品中NoV的檢測(cè)具有重要意義。典型的NoV檢測(cè)過程包括：洗脫、PEG沉淀濃度、RNA提取和RT-PCR檢測(cè)。針對(duì)NoV的檢測(cè)，多數(shù)研究集中于貝類中NoV的檢測(cè)，然而，水果和蔬菜亦是食源性疾病爆發(fā)性多的種類之一(Butot et al., 2007)，因此從不同水果中評(píng)價(jià)NoV的回收率及其重要。本研究則對(duì)不同水果中NoV的洗脫、濃縮和提取進(jìn)行了優(yōu)化。為檢驗(yàn)洗脫液的洗脫效率，本研究對(duì)已有研究中用到的所有洗脫緩沖液進(jìn)行了檢測(cè)(Baert et al., 2008;Dubois et al., 2002; Guevremon

30、t et al., 2006; Lewis and Metcalf,1988; Monpoeho et al., 2001; Mullendore et al., 2001)。在所檢測(cè)的6種洗脫緩沖液中，3%的牛肉浸提物對(duì)于NoV的洗脫效率最高，可能是其具有高的濃縮蛋白造成的。從目前草莓和速凍樹莓中NoV的洗脫效率的研究顯示，100mM Tris緩沖液的洗脫效率范圍為0.42%-11.2(Butot et al., 2007)，本研究洗脫效率為8.5%，與其研究結(jié)果一致。Tirs緩沖液中加入1%的牛肉浸提物對(duì)草莓和樹莓的病毒洗脫率分別提高了2.2和3.6倍。這個(gè)結(jié)果與目前關(guān)于漿果中牛肉浸提物的

31、特定蛋白可促進(jìn)NoV的洗脫的研究結(jié)果相一致。本研究對(duì)于PEG MW和孵育時(shí)間對(duì)于病毒沉淀的影響首次進(jìn)行了研究，PEG由于其快速和溫和的方法應(yīng)用濃縮病毒，能夠在中性pH值和不含其它化學(xué)物質(zhì)的高離子濃度的溶液中作用(Lewis and Metcalf, 1988)。盡管懷疑增加PEG MW可能會(huì)增加NoV從洗脫液中的回收率，但本研究結(jié)果不支持這個(gè)觀點(diǎn)，且認(rèn)為延長(zhǎng)PEG的孵育時(shí)間對(duì)于提高病毒回收率毫無意義。本研究采用PEG沉淀病毒的回收率為12.4%，低于已有研究的甲肝病毒回收率（13-27%）(Mullendore et al., 2001)，但是高于已有研究的NoV的回收率（1-7%）(Buto

32、t et al., 2007; Rutjes et al., 2006)。這種不同可能是由于洗脫緩沖液中蛋白質(zhì)和其它成分的不同引起的結(jié)果。本研究采用3%牛肉浸提物進(jìn)行病毒洗脫后進(jìn)行PEG沉淀具有很高的效率，可能是由于牛肉浸提物中的高濃縮蛋白促進(jìn)了PRG對(duì)于NoV的絮凝作用。食品中有許多成分對(duì)分子檢測(cè)如PT-PCR具有抑制作用(Lewis and Metcalf, 1988; Schwab and McDevitt, 2003)。這個(gè)問題在漿果（如草莓、木莓等）檢測(cè)中尤為顯著，其主要原因?yàn)闄z測(cè)過程中存在化學(xué)抑制劑和漿果比較低的pH值(Lewis and Metcalf, 1988; Schwab

33、 and McDevitt, 2003)。迄今為止，NoV被認(rèn)為是少量蔬菜和水果中存在的天然病洗脫（21-85%回收）3%牛肉浸提物氯仿提取PEG沉淀（10%-86%回收）PEG10,0000/n 4孵育（草莓）室溫4h孵育（木莓）核酸提?。?-80%回收）QIAamp Viral RNA Mini KitPT-PCR 圖1 水果中NoV的檢測(cè)方法的優(yōu)化和用于病毒檢測(cè)的樣品回收量毒(Calder et al., 2003; Hernández et al., 1997; Kobayashi et al., 2004; Le Guyader et al., 2004)。本研究病毒檢測(cè)的

34、操作過程包括：3%的牛肉浸提物進(jìn)行病毒洗脫、PEG 10,000室溫孵育4h、QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA、水果中NoV的檢測(cè)（圖1）。 已有的研究認(rèn)為牛肉浸提物中含有許多PT-PCR抑制劑(Katayama et al., 2002; Schwab and McDevitt, 2003)，但是在本研究中未發(fā)現(xiàn)有明顯的PT-PCR抑制因子，其原因可能為由病毒RNA提取過程中抑制因子已被有效去除。本研究共評(píng)估了5種NoV中提取RNA的方法，評(píng)價(jià)病毒RNA提取方法的因素包括該提取方法與先前洗脫和濃縮步驟的相容性、從先前病毒顆粒中提取RNA的效率和PT-PCR抑制劑去

35、除的能力。本研究對(duì)沒一種RNA提取方法都進(jìn)行了測(cè)試，其中采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的病毒回收最高，其次為免疫磁化分離法。然而，免疫磁化分離法提取的效率取決于所使用抗-NoV抗體的類型和質(zhì)量，抗體抵抗不同類型的NoV的確認(rèn)試驗(yàn)需進(jìn)行進(jìn)一步研究。盡管本研究采用PT-PCR進(jìn)行NoV的檢測(cè)，但是其他的一些分析檢測(cè)方法，如電鏡檢測(cè)方法或酶聯(lián)免疫方法皆可進(jìn)行使用。眾多NoV檢測(cè)方法中，PT-PCR由于其快速和高靈敏性和特異性，為最通用的檢測(cè)方法。本研究通過一系列稀釋和常規(guī)PT-PCR檢測(cè)進(jìn)行病毒回收率的量化，但是更多的定量方法如實(shí)時(shí)PT-PCR檢測(cè)應(yīng)該用于取代RT-PCR

36、。目前的方法的一個(gè)局限性在于由于分析檢測(cè)不能區(qū)分感染性病毒和非感染性病毒的區(qū)別，故未能提供NoV感染率的相關(guān)信息（Straub et al. (2007)。目前已有一種NoV的體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)，但是該系統(tǒng)的以應(yīng)用比較困難和昂貴，且僅有一部分類型的NoV可以采用該種方法進(jìn)行培養(yǎng)。除此之外，鼠類諾如病毒（MNV）亦可作為人類NoV研究的替代品，MNV容易培養(yǎng)并采用RAW264.7細(xì)胞系進(jìn)行菌斑實(shí)驗(yàn)，該方法可以實(shí)現(xiàn)病毒感染性的量化(Karst et al., 2003;Thackray et al., 2007)。然而，MNV表現(xiàn)為不同的特征，且替代品病毒具有局限性。因此，研究與PT-PCR檢測(cè)相一

37、致的病毒洗脫和濃縮方法具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，尚未有不同NoV感染水果的標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，鑒于NoV在食源性疾病中的重要性，評(píng)價(jià)和優(yōu)化食品中NoV的檢測(cè)方法具有重要意義。本研究中優(yōu)化的NoV檢測(cè)的操作步驟可用于NoV相關(guān)的疾病爆發(fā)性檢測(cè)。該方法對(duì)于食源性疾病的調(diào)查和食品的監(jiān)測(cè)極其重要，下一個(gè)研究方向?yàn)槠渌匾称坊|(zhì)中病毒洗脫和濃縮等操作條件的優(yōu)化。致獻(xiàn)本研究部分基金來自韓國(guó)食品和藥品管理局（授權(quán)#06042）。參考文獻(xiàn)1.Baert, L., Uyttendaele, M., Debevere, J., 2007. Evaluation of two viral extraction m

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