腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因及產(chǎn)物p糖蛋白檢測(cè)方法進(jìn)展

1、腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因及產(chǎn)物p糖蛋白檢測(cè)方法進(jìn)展    摘要: 腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的多藥耐藥（MDR）是目前腫瘤病人化療失敗的主要原因。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥有多種類型。本文對(duì)Mdr1基因及P糖蛋白（pgp）的生物學(xué)特性及檢測(cè)方法作一綜述。 目前，化療仍然是治療惡性腫瘤的重要手段，盡管化療方案的改進(jìn)及新藥的使用，臨床化療效果越來(lái)越好，但仍然發(fā)現(xiàn)一些患者在化療前后對(duì)某些藥物產(chǎn)生耐藥性，從而影響化療效果。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致腫瘤化療失敗的原因之一是腫瘤對(duì)化療藥物的多藥耐藥。多藥耐藥是指由一種藥物誘發(fā)，對(duì)該藥耐藥的同時(shí)，對(duì)其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制無(wú)關(guān)的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥。多藥耐

2、藥的類型有多種。如Mdr1及其產(chǎn)物pgp的表達(dá)增高，多藥耐藥相關(guān)蛋白基因的擴(kuò)增或表達(dá)增加，DNA拓樸異構(gòu)酶活性增高或性質(zhì)發(fā)生改變，谷胱甘肽解毒系統(tǒng)酶活性增高等。本文就Mdr1和pgp的生物學(xué)特性及檢測(cè)方法作一綜述。 1 多藥耐藥基因1（Mdr1）和P糖蛋白（pgp）的生物學(xué)特性 1.1 Mdr1 MDR基因在人類有二種Mdr1和Mdr2，其中Mdr1與腫瘤的多藥耐藥有關(guān)。Mdr2的功能尚不清楚，但Mdr1和Mdr2基因序列具有較高的同源性。人類Mdr1基因位于第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，含有28個(gè)外顯子，內(nèi)含子與外顯子交界符合經(jīng)典的A/G規(guī)則，全長(zhǎng)為4.5Kb，含有一個(gè)開(kāi)放讀框，編碼1280個(gè)氨基酸多

3、肽，經(jīng)糖基化后形成170KD的pgp1。目前對(duì)Mdr1基因的表達(dá)調(diào)控還處于研究之中。研究表明抗腫瘤藥物、致癌劑、紫外線、熱應(yīng)激等都可使Mdr1基因活化，ras、raf、p53等癌基因也參與Mdr1基因的表達(dá)調(diào)控2，3。有人發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性乳腺癌患者中，Mdr1基因的轉(zhuǎn)錄受Y盒轉(zhuǎn)錄因子（YB-1）的調(diào)節(jié)，而且YB-1的位置與Mdr1基因表達(dá)密切相關(guān)，在對(duì)藥物敏感的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中，YB-1位于胞漿中，而在耐藥細(xì)胞株MCF-7中，YB-1位于細(xì)胞核中，因此認(rèn)為YB-1也參與Mdr1基因的調(diào)控4。 1.2 pgp pgp是由Mdr1基因編碼、其分子量為170KD、由1280個(gè)氨基酸組成的跨膜糖

4、蛋白，由兩個(gè)同源部分組成，兩部分之間的同源性大約為48%，每一部分約含有6個(gè)疏水跨膜區(qū)和一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)ATP供給能量，將親脂性藥物泵出細(xì)胞外。在正常人體的腎上腺、腎、肝、結(jié)腸、胰及腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有Mdr1 pgp的表達(dá)，其生理功能為將細(xì)胞內(nèi)的毒性代謝產(chǎn)物泵出細(xì)胞，對(duì)組織細(xì)胞起保護(hù)作用。在腦組織中，Mdr1 pgp對(duì)維持血腦屏障起重要作用，它可將內(nèi)皮細(xì)胞中的異物（物藥、致癌物等）排列毛細(xì)血管腔而保護(hù)腦組織。在正常人體的造血干細(xì)胞，T、B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞上都有pgp表達(dá)，其生理功能仍不清楚，但研究表明pgp參與人體外周血T淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞因子（如IL-2，IL-4，-IFN）的

5、輸送5，6。Mdr1被克隆并發(fā)現(xiàn)在某些正常組織中表達(dá)后，人們就開(kāi)始對(duì)腫瘤組織中的Mdr1進(jìn)行分析。在腫瘤細(xì)胞中，pgp通過(guò)ATP供能，將長(zhǎng)春新堿、秋水仙素、放線菌素D等藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。 2 Mdr1和pgp的檢測(cè)方法 Mdr1和pgp的檢測(cè)方法主要有兩類，一類是蛋白質(zhì)定法，包括免疫組化法、免疫印跡法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)法等。一類是mRNA測(cè)定法，包括Northen blot、Slot blot、RNA原位雜交法及RT-PCR檢測(cè)法。 2.1 免疫組化法 常用的方法是免疫組化ABC法。冰凍切片常規(guī)處理后，與抗pgp的單克隆抗體孵育，然后加入生物素標(biāo)記的二抗孵育，再加親合素-過(guò)氧化酶

6、復(fù)合物孵育、洗片，最后用含0.03%-0.05%過(guò)氧化氫的DAB液顯色分析結(jié)果。免疫組化法是較傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，由于其操作簡(jiǎn)便，不需要貴重儀器，且可分析腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，因此是目前國(guó)內(nèi)外常用的檢測(cè)方法。由于其特異性和敏感性較低，且需要冰凍組織切片，因此1994年karoly等對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn)，創(chuàng)建了一種新的“免疫組織化學(xué)夾心染色法（LPS）”，此方法直接用福爾馬林固定的組織細(xì)胞，經(jīng)石臘包理、切片、過(guò)氧化氫處理后，與抗pgp的單克隆抗體JSB-1孵育后有序地加三層過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體第一層為過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG f(ab)2，第二層為鼠單克隆過(guò)氧化酶 抗過(guò)氧化酶復(fù)合物，第三層為過(guò)氧化

7、物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG f(ab)2的孵育、洗片、染色、分析結(jié)果。 LPS法直接取組織細(xì)胞固定，不需使用冰凍切片，且因增加了三層過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體，使免疫染色密度增加，結(jié)果更清晰。由于JSB-1抗體對(duì)Mdr1 pgp具有特異性，與Mdr2 pgp無(wú)交叉反應(yīng)，因此提高了LPS法的特異性。以往免疫組化結(jié)果不能進(jìn)行定量分析，此方法在應(yīng)用上受到一定的限制，近年來(lái)由于數(shù)學(xué)顯微圖像分析方法的應(yīng)用，免疫組化結(jié)果可進(jìn)行定量分析，使得免疫組化法更具實(shí)用性7，8。 2.2 免疫印跡分析法 粗膜蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上，用抗pgp單克隆抗體作為一抗，同位素標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，

8、分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。此方法利用抗原抗體的特異反應(yīng)，排除了其它蛋白質(zhì)的干擾，但敏感性較低11。 2.3 流式細(xì)胞儀（FCM）分析法 取單個(gè)核細(xì)胞分裝小管，加入熒光標(biāo)記的抗pgp單克隆抗體進(jìn)行孵育，用熒光標(biāo)記的小鼠IgG作陰性對(duì)照，PBS沖洗除去未給合的熒光抗體后，F(xiàn)CM定量分析，以20%以上細(xì)胞染上熒光者判定為pgp陽(yáng)性。FCM檢測(cè)pgp，取材方便，可直接取腫瘤組織細(xì)胞，骨髓，還可取外周靜脈血，操作簡(jiǎn)便、快速（每秒可測(cè)5000-10000個(gè)所要細(xì)胞）、準(zhǔn)確，能對(duì)pgp進(jìn)行定量分析，適宜批量標(biāo)本檢測(cè)，但由于儀器價(jià)格昂貴，目前只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室可進(jìn)行FCM分析法10。 2.4 Northern Bl

9、ot和Slot Blot檢測(cè)法 用異硫氰酸胍溶液抽提細(xì)胞質(zhì)中RNA，氯化銫溶液進(jìn)行梯度離心，抽提的RNA經(jīng)過(guò)變性、分光光度計(jì)下測(cè)定其濃度，電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上（Slot blot分析法則直接將RNA點(diǎn)在硝酸纖維薄膜上），用50%甲醛、5×Denhardts、5×SSC溶液和DNA模板與放射性標(biāo)記的Mdrl cDNA探針進(jìn)行預(yù)雜交和雜交、放射自顯影后分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。通過(guò)這兩種方法檢測(cè)Mdr1 mRNA較敏感，但不足之處是需要的標(biāo)本量較大，且需用放射性標(biāo)記的探針，會(huì)引起同位素污染。 2.5 RNA原位雜交法 石臘包埋切片按常規(guī)處理后與放射性標(biāo)記的Mdrl cDNA

10、探針進(jìn)行雜交，放射自顯影后進(jìn)行結(jié)果分析。此方法采用完整細(xì)胞作為測(cè)定對(duì)象，能分析Mdr1過(guò)度表達(dá)的個(gè)別細(xì)胞或細(xì)胞亞群，但系手工操作，較難掌握10。 2.6 RT-PCR檢測(cè)法 提取樣本總RNA，合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積一般為25L，含0.1g的模板DNA，20mol/L,4dNTPS,Taq dNA聚合酶10×buffer 5uL,Mdr1基因上下游引物及內(nèi)對(duì)照1微球蛋白（2M）上下游引物各20pmol。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，紫外燈下照像，激光密度掃描儀定量分析。以2M為定量?jī)?nèi)參標(biāo)，以Mdr1/2M的比值大小來(lái)代表Mdr1水平的高低。 RT

11、-PCR產(chǎn)物的絕對(duì)定量很困難，因RNA的提取、純度測(cè)定、cDNA逆轉(zhuǎn)率和PCR擴(kuò)增效率各個(gè)環(huán)節(jié)均影響Mdr1 mRNA定量分析的精確度，因此在檢測(cè)過(guò)程中需要設(shè)內(nèi)對(duì)照，一般選擇與Mdr1基因擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)相似的2M作為內(nèi)參標(biāo)，以Mdr1/2M比值大小來(lái)衡量Mdr1水平的高低，從而消除上述因素引起的定量誤差。由于Mdr1基因的多態(tài)性，在設(shè)計(jì)RT-PCR引物時(shí)要避開(kāi)Mdr1和Mdr2基因結(jié)構(gòu)的同源區(qū)，使引物具有較高的特異性，同時(shí)要使引物位于不同的外顯子上，避免可能污染的基因組DNA擴(kuò)增。RT-PCR檢測(cè)法標(biāo)本用量小、特異性強(qiáng)、敏感性高，同時(shí)可以避免同位素污染。 腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥是造成腫瘤化療失

12、敗的主要原因，而Mdr1/pgp的高表達(dá)又是MDR的主要機(jī)制。許多研究表明Mdr1/pgp與病人治療結(jié)果密切相關(guān)，Mdr1陽(yáng)性病人生存期短，緩解率低，復(fù)發(fā)率高，因此，Mdr1/pgp的分析可作為癌癥治療結(jié)果的預(yù)測(cè)指標(biāo)，也是臨床醫(yī)生制定治療方案的參考依據(jù)。因此，Mdr1/pgp的檢測(cè)有其重要性。Mdr1/pgp檢測(cè)方法有多種，各具其優(yōu)缺點(diǎn) ，對(duì)于高表達(dá)的Mdr1/pgp各種檢測(cè)方法所得的結(jié)果基本一致，對(duì)于低表達(dá)的Mdr1，采用RT-PCR檢測(cè)所得的結(jié)果較可信。由于RT-PCR檢測(cè)方法標(biāo)本用量少，敏感性高，在引物設(shè)計(jì)時(shí)，若避免與Mdr2基因結(jié)構(gòu)的同源區(qū)，具有較高的物異性，同時(shí)又無(wú)同位素污染。因此，

13、RT-PCR檢測(cè)法是目前檢測(cè)多藥耐藥的一種較理想的檢測(cè)方法。   參考文獻(xiàn) 1 Chang J C, Douglas Kazumits U, et al. Journal Biological chemistry,1990;265(1):506 2 Uchiumi T, Kohno K, Tanimura H, et al. Cell Growth differ,1993;4(2):147 3 Hu X F, Slater A, Wall D M, et al. br J Cancer,1995;71(5)931 4 Bargou R C, Jurchott K, Wagener C, et al. Nat Med,1997;3(4):447 5 Karoly Tm Mary M V, Nanct S, et al. amer J Pathol,1996;149(3):385 6 Drach J, Gsur A, Hamilton G, et al.Bloood,1996;88(5):1747 7 Soeni Y, Virkajarvi N, Raunio H, et al. J Clin pathol,1996;49(6):470 8 Kar