流式細胞術--ppt課件

1、一、一、流式細胞術的概念流式細胞術的概念流式細胞術（流式細胞術（FCM）就是對在高速流動的鞘液包括下的細胞、粒子進行分析和分選的技術，這種細胞或粒子是經(jīng)過特異熒光標記的。其特點是測量速度快，每秒鐘能測數(shù)千個乃至上萬個細胞，且可進行多參數(shù)測量，另一特點是在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，這就是分選技術。 二、流式細胞儀的工作原理 待測細胞被制成單個細胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在清潔氣體的壓力下進入流動室。流動室內(nèi)充滿鞘液，鞘液的作用有二：一是約束樣品使之在噴嘴中心以提高測量精度；二是防止樣品靠近噴孔壁以避免堵塞噴孔。在這種約束作用下，細胞排成單列一個跟隨一個地在鞘液

2、包括下由流動室下面的噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。液柱與入射的高度聚焦的激光束相交，此時，細胞上的熒光染料被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光。在與入射激光和液柱都垂直的方向設置有熒光測量系統(tǒng)，包括透鏡、光闌、濾片、檢測器等，將細胞的熒光信號變成電信號輸出到計算機，用專用軟件進行分析。三、 流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù) 1 前向角散射（FSC）：前向角散射光的強度與細胞的大小有關，也就是說，同一個細胞群體，F(xiàn)SC強的，其細胞大一些，而FSC弱的，其細胞小一些。 2 側(cè)向角散射（SSC）：側(cè)向角散射又稱90散射或大角散射。側(cè)向角散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，對胞內(nèi)較大的顆粒也會有反應。所以，側(cè)向角

3、散射光的強弱可反應細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒的性質(zhì)。 3 熒光強度（FL）：是細胞或細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。通過熒光強度可將同一個細胞群體中的有熒光標記的細胞與無熒光標記的細胞區(qū)分開來，也就是我們通常所說的陽性細胞，也可以將陽性細胞中的高FL的細胞與低FL的細胞區(qū)分開來，也就是可以把強陽性細胞和弱陽性細胞區(qū)分開來。一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。 四、 流式細胞術的應用1細胞細胞DNA含量檢測含量檢測

4、： 細胞固定后用PI染色，因為PI特異性結(jié)合于細胞DNA，熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關系，根據(jù)這個原理，并通過專用的DNA分析軟件，可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。 腫瘤診斷： DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志，細胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學特征。因此，臨床上可利用流式細胞儀進行細胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷、交界性腫瘤診斷和腫瘤細胞學診斷等各方面。 腫瘤預后估計： 異倍體腫瘤惡性度、復發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和死亡率都較二倍體腫瘤高。已有文獻報道，在乳腺、結(jié)腸、直腸、前列腺和膀胱腫瘤中，異倍體和較高的S期

5、百分比都是不良預后的標志。同樣的，在肺癌、頭預部腫瘤、卵巢癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有類似發(fā)現(xiàn)。因此在病理組織學分級、臨床分期等指標基礎上，用流式細胞儀檢測腫瘤DNA倍體能更客觀地預測預后。凋亡： 由于凋亡細胞核酸內(nèi)切酶活化，DNA降解，細胞DNA減少，因而可在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，也就是凋亡峰。檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。 細胞表型的分析得益于單克隆抗體的產(chǎn)生及發(fā)展，現(xiàn)在CD系統(tǒng)已有247種之多。細胞用帶有熒光的單克隆抗體標記后，用流式細胞儀可對其進行檢測分析，可分析出熒光細胞的含量，也可分析出這種陽性細胞的CD分子的相對含量

6、。標記的方法一般用直標法，也可用間標法。熒光探針多為FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、APC等。 2細胞表型分析：細胞表型分析： 淋巴細胞分類： CD3(T細胞，CD4、CD8)、CD19（B細胞）、CD16、CD56（NK細胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細胞增殖病、腫瘤療效觀察與預后判斷、移植免疫檢測等。 造血干/祖細胞計數(shù) 造血干/祖細胞存在于骨髓和外周血中，形態(tài)與淋巴細胞相似，用普通形態(tài)學方法難以識別。由于造血干/祖細胞表面可表達CD34和CD45抗原且具有很高的核酸含量，因而用CD34和CD45單克隆抗體和核酸染料進行三色熒光標記，F(xiàn)CM多參數(shù)分析

7、血液、骨髓和濃縮白細胞懸液中造血干/祖細胞的數(shù)量，對臨床血液病、惡性腫瘤、基因異常等疾病的造血干/祖細胞移植治療有十分重要的意義。 白血病的免疫分型 流式細胞術白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的細胞膜和細胞漿或細胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型時，測量細胞數(shù)一般在1000050000細胞之間，而且快速、特異、準確，重復性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。細胞系的鑒定新建細胞系 新建立的細胞系，進行系列的表型分析，以確定

8、此細胞系的表型。已有細胞系的表型分析 對于已知細胞系，由于多次傳代和培養(yǎng)條件的改變，細胞遺傳信息可能會發(fā)生突變，對其進行表型分析，以檢測該細胞系是否有變異。3 血小板功能分析與血小板病診斷 原理 血小板是由骨髓巨核細胞產(chǎn)生的無核細胞，正常靜止狀態(tài)呈兩面微凸的圓盤狀，平均直徑23m?；罨难“宄什灰?guī)則形狀，表面有大量星狀突起，彼此間常發(fā)生粘附、聚集。血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮功能的分子基礎。 靜止與活化血小板膜糖蛋白分子的種類、含量、結(jié)構(gòu)、功能等顯著不同，一些血小板糖蛋白的分子缺陷常導致血小板止血功能的異常，某些糖蛋白分子在血小板膜上高表達又是血小板被活化的特異性分子標志。當血

9、小板表面結(jié)合有自身抗體時常導致血小板減少。血小板的上述變化，通過用熒光素標記的單克隆抗體結(jié)合流式細胞術，可以敏感、特異、快速的診斷血小板病。血小板檢測指標：質(zhì)膜糖蛋白：CD41/CD61（gpb/a）、 CD42b(GPb/)顆粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。活化：gpb/a復合物活化早期標志物 CD62P活化后期的表面標志血小板抗體（PAIgG）。網(wǎng)織血小板計數(shù)：常用染料為TO。 應用 血小板無力癥診斷： CD41/CD61缺失或異常 巨大血小板綜合征診斷： CD42a/CD42b缺失 免疫性血小板減少性紫癜診斷： PAIgG 血栓前狀態(tài)與血栓性疾病診斷： 血小板活化異常 4 紅細

10、胞疾病診斷 網(wǎng)織紅細胞計數(shù)與應用 網(wǎng)織紅細胞是未完全成熟的紅細胞，胞漿中仍殘留有不同含量的RNA。RNA含量越高，網(wǎng)織紅細胞越幼稚，反之，則接近于成熟紅細胞。網(wǎng)織紅細胞是反映骨髓紅系造血的指針。用熒光染料噻唑橙(Thiazole Orange，TO)可使活體網(wǎng)織紅細胞中RNA染色，用488nm激光激發(fā)后發(fā)射綠色熒光，F(xiàn)CM分析其熒光強度的大小可測量網(wǎng)織紅細胞的數(shù)量和RNA含量。主要用于貧血篩查。 睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)的診斷 紅細胞表面CD59缺失5細胞內(nèi)蛋白的分析：細胞內(nèi)蛋白的分析： 細胞破膜后將細胞內(nèi)某一蛋白成分進行熒光標記，用流式細胞儀進行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽

11、性細胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。并且，結(jié)合細胞表型分析，進行多標記和多參數(shù)分析，可以檢測出含這種蛋白的細胞是屬于哪一種表型的細胞。多用間標法，熒光探針多為FITC。也可以與周期分析結(jié)合起來，分別分析蛋白陽性和蛋白陰性細胞的細胞周期，這在研究功能蛋白對周期的調(diào)控作用是非常有用的工具。 6 可溶性蛋白的檢測： 為最新發(fā)展起來的用于檢測可溶性蛋白的流式細胞技術(CBA)，是將待檢蛋白吸附到微球上，再與熒光探針結(jié)合，測定微球上這種蛋白的熒光強度，與已知微球的熒光強度相比較，求出待測蛋白的含量，分析軟件可自動給出相關方程。 7 分選： 用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，可用于分選的效率較高的儀

12、器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每少鐘300個細胞，而大型機分選速度可達到每秒上萬個細胞，并可做到點對點分選。但分選速度也與細胞中目的細胞的百分率及細胞懸液的密度有關。 FCM的應用，概括成一句話就是 凡是能被熒光素標記的且這種熒光素能被流式細胞儀所配置的激光光源激發(fā)的細胞或顆粒，都可用流式細胞儀檢測。在生物檢測技在生物檢測技術中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。術中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。 縱觀歷史，幾乎沒有哪一門科學技術象流式細胞術這樣凝結(jié)了眾多不同學術背景、不同科研領域的科學家的心血。從流式細胞術的發(fā)明、改進，流式細胞儀的研制、革新，到今天的眾多應用領域的拓展，每一步都

13、是諸如生物學、生物技術、計算機科學、電子工程學、流體力學、激光技術、高等數(shù)學、臨床醫(yī)學、分子生物學、有機化學和物理學等學科知識綜合運用的結(jié)晶。 而現(xiàn)代流式細胞術，更是由于結(jié)合了單克隆抗體技術、定量細胞化學和定量熒光細胞化學的應用，使其在生物學、臨床醫(yī)學、藥物學等眾多研究領域的應用將會越來越廣泛。五、流式樣品的制備中應注意的幾個問題流式樣品的制備中應注意的幾個問題 熒光素和抗體的選擇 熒光素的選擇：現(xiàn)在國內(nèi)引進的大多數(shù)流式細胞儀只裝有一個激光光源，即488nm光源，所以我們在選擇熒光素時要選擇能被488nm激光激發(fā)的熒光素，常用的熒光素有：測細胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD。測細胞蛋白、

14、抗體或抗原：FITC、PE、Per-CP、 PE-CY5、PerCP-CY5.5。測細胞膜電位：Rho-123。測鈣離子：Fluo-3?？贵w的選擇： 一定要選擇商業(yè)化的流式用單克隆抗體，此類抗體在制備過程中有嚴格的質(zhì)控，非特異熒光弱。最好用直標抗體，如果是用間標抗體，二抗的選擇更應嚴格。 樣品的準備 評價一個樣品制備的優(yōu)劣，可有三個評價指標，即細胞的密度，不能低于1106/ml ； 非特異熒光，不超過1；細胞碎片和聚集體，不能出現(xiàn)肉眼可見的團塊。 流式細胞儀對一個樣品提供的結(jié)果是否可信，雖然與儀器操作者的水平有很大關系，但在很大程度上取決于樣品制備的優(yōu)劣。細胞密度太低，影響測試速度并造成測試參

15、數(shù)調(diào)整的困難，尤其是在做DNA分析時，由于細胞太少，勢必要提高樣品的流速，人為地增大了G0/G1期的CV值，影響了結(jié)果的可靠性；非特異熒光強，則造成樣品結(jié)果的假陽性；聚集體增多，尤其是肉眼可見的細胞聚集體，可造成流式細胞儀進樣針的阻塞，影響儀器的性能，碎片可干擾測試結(jié)果，造成結(jié)果分析的困難。 流式樣品制備過程中常見的問題及解決對策 常見問題原 因解決對策細胞密度低制備過程中細胞損失增加離心時間、吸棄上清非特異熒光強抗體不純、死亡細胞多選擇純度高的抗體、用同型對照抗體或雙標記排除非特異熒光碎片多細胞死亡、機械損傷在細胞生長狀態(tài)良好時測試、避免反復吹打細胞聚集消化不完全、酒精固定造成的細胞粘連徹底

16、消化、在用酒精固定細胞時加入終濃度為1.5-3的小牛血清熒光弱靈敏度不夠、抗體加入量不飽和、反應時間短改用生物素-親和素、增加抗體用量、延長反應時間測不出亞二倍體峰凋亡測試方法選擇不當改用原位末端標記或Annexin-V和PI雙標記法 樣品對照 細胞的熒光有自發(fā)熒光、非特異熒光和特異熒光，并且流式細胞術提供的陽性細胞百分比和熒光強度都是相對陰性細胞而言的，所以在樣品制備中樣品對照的設置至關重要。在測DNA時，要設正常細胞對照，即不做任何干預的細胞對照。在檢測細胞膜CD分子和細胞內(nèi)蛋白或細胞因子時，要設同型抗體對照，如果是雙標記或三標記檢測，還要設單標記的陽性對照。 六、流式樣品的制備：細胞細胞

17、DNA分析分析： 用本法可測定細胞周期、細胞倍體和凋亡，在樣品制備中存在的問題主要是細胞的聚集和碎片，建議在固定細胞時加入1.5%-3%小牛血清。 培養(yǎng)的細胞系、體液中分離的有核細胞或分離的組織細胞約1106，離心沉淀后用0.3ml 含5%-10%小牛血清的PBS懸浮，移入1.5ml EP管中，加入0.7ml無水乙醇，置-20固定細胞24小時以上（用本法制備的細胞可在-20保存一周甚至更長的時間）。 3000rpm離心細胞30秒，吸棄上清，用1ml PBS重懸細胞，再離心洗滌細胞一次，吸棄上清，沉淀細胞用100l 1mg/ml RNase A懸浮，3730min以消化RNA，再加入400l 5

18、0g/ml PI，置暗處10min后上機檢測。 結(jié)果分析：流式報告中可給出G0/G1、S、G2/M各期細胞的百分比、凋亡百分比和細胞倍體。細胞表面細胞表面CD分子檢測分子檢測（以小鼠脾細胞CD4、CD8為例）： 小鼠脾臟用注射器芯輕輕研磨，過200目濾網(wǎng)，將細胞濾于含5%小牛血清的PBS中，吸取0.1ml（約1106）置離心管中，加入CD4及CD8抗體（加入量參照供應商的推薦量，一般抗體的加入量為1g /1106/0.1ml ），室溫30min。 加入B-D分司生產(chǎn)的細胞裂解液2ml 室溫裂解RBC 15min，用PBS洗滌細胞兩次，吸棄上清，沉淀用0.5ml PBS懸浮，上機檢測；也可用4%

19、多聚甲醛固定，4避光可保存至少24小時。流式報告中可給出陽性細胞的百分比和熒光強度。 注意兩點：建議使用B-D公司的RBC裂解液。離心后上清一定要吸，不能倒，離心速度控制在1500rpm左右。細胞內(nèi)細胞因子測定：細胞內(nèi)細胞因子測定： 用流式細胞儀測定細胞內(nèi)細胞因子是當前流式細胞術中一種較新的技術。在免疫反應中，細胞因子擔當了重要的角色。幾乎所有的細胞因子均可由各種不同類型的細胞在體外產(chǎn)生。但利用生物測定技術、酶標法或PCR技術不能回答某一特定的細胞因子在體內(nèi)究竟是由哪種細胞產(chǎn)生的，即使將細胞分離制備出來，由于存在污染其它細胞的可能性，結(jié)果仍然缺乏可靠性。 理想的測定技術應使細胞因子的檢測能在可

20、區(qū)分其表型的單細胞中進行，胞內(nèi)細胞因子染色和流式細胞術則可滿足這些要求。即流式細胞術可同時回答某種細胞因子是來源于哪種細胞表型陽性的細胞。 樣品制備：體外刺激誘導細胞使其產(chǎn)生細胞因子；刺激同時加入Monensin（莫能菌素）以中斷胞內(nèi)細胞因子的運輸，使新合成的細胞因子聚積在高爾基體。固定細胞；加入打孔劑使在細胞膜上造成許多小孔（打孔），從而使大分子的細胞因子抗體能透過膜；熒光標記。 常用打孔劑有Saponin、Triton-X 100。 4. 胞漿內(nèi)蛋白的測定 收集細胞（如果是含有紅細胞的有核細胞，則用裂解液去除紅細胞），用含510%的牛血清PBS懸浮，終濃度為70的乙醇固定，固定后洗去酒精，

21、沉淀細胞細胞用0.2Triton-x 100破膜15min，加入一抗（一定要加飽和量）室溫30分鐘，離心洗滌兩次，洗去未結(jié)合的一抗，再加入二抗，室溫30min，洗滌二次，重懸于0.5m l PBS中上機測試。要設不加一抗的陰性對照。也可以不必固定。用這種方法可測周期蛋白、凋亡蛋白、基因表達產(chǎn)物等。5細胞膜電位測定：細胞膜電位測定： Rho-123是線粒體的特異性染料，細胞被染料染色后，可測出細胞的熒光強度，其熒光強度的強弱與細胞膜電位的高低有關，可間接反映出細胞的功能。其方法如下： 取1106細胞用PBS洗一次，再用1ml PBS懸浮，加入2.5mM Rho-123 2l，使其終濃度為5M，室溫作用30min，作用畢，用PBS洗細胞二次，0.5ml PBS重懸細胞，上機測試。由于凋亡和死亡細胞線粒體受損，熒光較弱，而功能正常的細胞熒光較強。在流式報告中的直方圖中可出現(xiàn)兩個峰或一個峰。 Rho-123的另一個用途是用于研究腫瘤細胞的耐藥。6細胞內(nèi)鈣離子測定細胞內(nèi)鈣離子測定以RPMI1640培養(yǎng)基配成濃度大約為1106/ml的細胞懸液，每ml細胞懸液中加入終濃度為15mol/ml Fluo-3/