非人靈長(zhǎng)類(lèi)克隆及治療性克隆的機(jī)理研究

1、項(xiàng)目名稱(chēng)：非人靈長(zhǎng)類(lèi)克隆及治療性克隆的機(jī)理研究首席科學(xué)家：周琪 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所起止年限：2006.1至2010.12依托部門(mén)：中國(guó)科學(xué)院一、研究?jī)?nèi)容深入了解在靈長(zhǎng)類(lèi)體細(xì)胞克隆胚分化與去分化過(guò)程中基因與蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)理是本項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。本項(xiàng)目的研究重點(diǎn)包括：1. 完善動(dòng)物克隆技術(shù)，嘗試建立具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的無(wú)性繁殖技術(shù)以改進(jìn)核移植流程，提高克隆效率為主，探討建立非細(xì)胞體系的無(wú)性繁殖技術(shù)的可能性。2體細(xì)胞的去分化探索和發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞中與體細(xì)胞去分化相關(guān)的關(guān)鍵蛋白、化學(xué)物質(zhì)。對(duì)于啟動(dòng)重編程相關(guān)的關(guān)鍵蛋白和化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行深入研究，設(shè)計(jì)調(diào)控基因表達(dá)的主要成分表，控制發(fā)

2、育進(jìn)程。3維持胚胎干細(xì)胞多能性的機(jī)制研究Nanog、Oct4等轉(zhuǎn)錄因子的各個(gè)結(jié)構(gòu)域在行使功能時(shí)發(fā)揮的作用; 以胚胎干細(xì)胞未分化的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子Oct4及Nanog為核心，研究由其調(diào)控的下游基因及其相互關(guān)系。4胚胎的發(fā)育研究細(xì)胞核在細(xì)胞質(zhì)環(huán)境中的三維結(jié)構(gòu)變化，找到細(xì)胞核重編程的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究分化是如何發(fā)生的及基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)過(guò)程，找出決定分化的基因網(wǎng)絡(luò)。 具體回答的問(wèn)題包括：1. 建立有效、經(jīng)濟(jì)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物核移植方法，解決核移植效率低下的問(wèn)題。2. 靈長(zhǎng)類(lèi)克隆胚在重編程過(guò)程中卵母細(xì)胞質(zhì)因子的作用，找到參與體細(xì)胞核移植后重編程過(guò)程的關(guān)鍵蛋白質(zhì)并闡明其在這一過(guò)程中所起的作用。3. 表觀(guān)遺傳修飾印記的消

3、除對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆胚發(fā)育的影響。4. 在胚胎干細(xì)胞維持其多能性的過(guò)程中，重要轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。5. 胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的信號(hào)通路和基因調(diào)控。6. 揭示靈長(zhǎng)類(lèi)基因組的差次表達(dá)模式和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容：1. 對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物卵及早期胚胎生化特性及基因組表觀(guān)遺傳修飾進(jìn)行研究；靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物種間核移植研究；篩選、制備靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物核供體細(xì)胞；建立有效、經(jīng)濟(jì)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物核移植方法。2. 克隆靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物；從克隆胚胎中分離胚胎干細(xì)胞并建系。3. 在胚胎基因組激活過(guò)程中，比較正常胚胎和核移植胚胎基因表達(dá)譜的差異；分析差異表達(dá)基因在核內(nèi)的定位；分離在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中起重要作用的新的轉(zhuǎn)

4、錄因子；研究受精卵和克隆胚在著床前胚胎發(fā)育過(guò)程中基因的表達(dá)和調(diào)控。4. 研究表觀(guān)遺傳修飾印記的消除對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆胚發(fā)育的影響。5. 研究Nanog、Oct4等轉(zhuǎn)錄因子的各個(gè)結(jié)構(gòu)域在行使功能時(shí)發(fā)揮的作用; 以胚胎干細(xì)胞未分化的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子Oct4及Nanog為核心，研究由其調(diào)控的下游100個(gè)基因及其相互關(guān)系；Oct4、Nanog調(diào)控基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究; Oct4,Nanog在胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控研究。6. 采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究成熟卵母細(xì)胞、激活卵母細(xì)胞、受精卵的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，用生物信息學(xué)方法構(gòu)建相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過(guò)比較這些蛋白，或者蛋白磷酸化等差異，獲得其中參與細(xì)胞由分化轉(zhuǎn)為未分

5、化的程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，并對(duì)其蛋白表達(dá)，翻譯后修飾和功能進(jìn)行進(jìn)一步研究。7. 研究在HGF和bFGF條件下，胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的基因表達(dá)差異和HGF和bFGF引起的相應(yīng)受體磷酸化。重點(diǎn)為HGF和bFGF與其受體結(jié)合后引起哪些位點(diǎn)的酪氨酸殘基發(fā)生了磷酸化，以及不同濃度的HGF和bFGF引起磷酸化的強(qiáng)弱。8. 研究導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞分化的信號(hào)通路。包括：HGF和bFGF引起的相應(yīng)受體磷酸化的信號(hào)通路，重點(diǎn)研究Ras，ERK，MAPK，PI3 kinase，PLC-，STAT3，Src，RhoA-ROCK等通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響；脂筏（lipid rafts）在HGF和bFGF存在的條件

6、下，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。Notch和Wnt信號(hào)通路，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化的作用。9. 采用DNA芯片技術(shù)對(duì)恒河猴（Macaca mulatta）正常胚和體細(xì)胞克隆胚不同發(fā)育時(shí)期（從囊胚期、原腸胚、神經(jīng)胚到大腦形成）的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，尋找在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中特征性表達(dá)的基因和基因家族；同時(shí)，比較人和恒河猴胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞前后基因表達(dá)圖譜的差異，揭示參與神經(jīng)系統(tǒng)分化的基因和基因家族。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo):利用核移植手段獲得體細(xì)胞克隆恒河猴，揭示動(dòng)物克隆和治療性克隆研究中的細(xì)胞去分化和分化的分子機(jī)制。五年預(yù)期目標(biāo):1. 建立高效的靈長(zhǎng)類(lèi)核移植方法，克隆恒河猴；從克隆胚胎中分離E

7、S細(xì)胞系；2. 揭示Nanog、Oct4等多能性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及在蛋白水平上的調(diào)控機(jī)制；并確定和克隆它們的下游因子，探討其作用機(jī)制；3. 獲得誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的關(guān)鍵蛋白并闡明其作用機(jī)制；4. 發(fā)現(xiàn)恒河猴體細(xì)胞核移植后早期胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的重要基因及其功能和作用方式；研究遺傳印記對(duì)克隆胚發(fā)育的影響；5. 了解恒河猴胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的主要信號(hào)途徑；6. 篩選在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中特征性表達(dá)的基因和基因家族；7. 培養(yǎng)研究生80-100名。8. 在本領(lǐng)域的國(guó)際代表性學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表60-80篇學(xué)術(shù)論文，其中影響因子高于8的不少于10篇。三、研究方案學(xué)術(shù)思路和技術(shù)途徑：動(dòng)物克隆效率低下的一

8、個(gè)重要原因是由于技術(shù)手段的限制而無(wú)法在研究中形成一個(gè)系統(tǒng)的理論，對(duì)個(gè)別影響因素、個(gè)別蛋白、個(gè)別基因的研究不足以揭示核移植胚胎這樣一個(gè)復(fù)雜的生物系統(tǒng)的運(yùn)行機(jī)制?？寺∨甙l(fā)育是一個(gè)由各種基因、蛋白質(zhì)和其他化學(xué)分子相互作用的復(fù)雜系統(tǒng)的整體行為，對(duì)動(dòng)物克隆和治療性克隆的研究不僅需要認(rèn)識(shí)個(gè)別的基因和蛋白質(zhì)的功能，而且需要了解完整的基因組和蛋白質(zhì)組的活動(dòng)。本項(xiàng)目將細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)、基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)等研究方法相結(jié)合，從基因與蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面，較系統(tǒng)地揭示細(xì)胞分化和去分化的分子機(jī)制；解決靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆的難題，并促進(jìn)治療性克隆的研究和應(yīng)用（見(jiàn)圖2）。圖2， 總體研究方案和課題設(shè)置圖與國(guó)內(nèi)

9、外同類(lèi)研究相比的創(chuàng)新點(diǎn)與特色：與以往同類(lèi)研究相比，本項(xiàng)目采用系統(tǒng)生物的研究策略，應(yīng)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等手段，較系統(tǒng)地研究細(xì)胞分化和去分化的分子機(jī)制。同時(shí)，發(fā)揮我國(guó)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的資源優(yōu)勢(shì)，依靠國(guó)家對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)研究的支持和973項(xiàng)目對(duì)科學(xué)前沿探索的鼓勵(lì)，聯(lián)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域優(yōu)勢(shì)單位的科學(xué)家，利用和整合已有的科學(xué)與技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)學(xué)科交叉、集中優(yōu)勢(shì)，解決動(dòng)物克隆和治療性克隆研究中的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。可行性分析由于本項(xiàng)目采取了系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法和手段，有望較深入地了解分化和去分化的分子機(jī)理，從而能夠突破靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物無(wú)法克隆的瓶頸，得到體細(xì)胞克隆的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。目前項(xiàng)目主要研究人員已在提高靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚胎的

10、發(fā)育率上取得了較好進(jìn)展，并且克隆胚胎能夠表達(dá)關(guān)鍵的胚胎發(fā)育蛋白（NuMA），為本項(xiàng)目取得重大突破奠定了基礎(chǔ)。課題設(shè)置課題名稱(chēng)負(fù)責(zé)人主要承擔(dān)單位經(jīng)費(fèi)比例%非人靈長(zhǎng)類(lèi)克隆研究周琪中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物所21.0非人靈長(zhǎng)類(lèi)克隆胚重編程過(guò)程早期表達(dá)重要基因的克隆及功能研究周琪JeanPaul Renard中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所Unité de Biologie du Développement (INRA-CNRS), Jouy en Josas, France15.5 分離和鑒定體細(xì)胞去分化關(guān)鍵蛋白冷靜南京醫(yī)科大學(xué)17.5維持胚胎干細(xì)胞全能性的機(jī)理研究裴端卿中科院廣

11、州生物醫(yī)藥與健康研究院17.5恒河猴胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的機(jī)制研究宿兵Pierre Savatier中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所Inserm Unité 371Embryonic stem cells: self-renewal and early commitment (INSERM)10.5非人靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中基因組的程序化表達(dá)及早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)分化的分子機(jī)制宿兵中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所18.0課題1.非人靈長(zhǎng)類(lèi)克隆研究主要研究?jī)?nèi)容：1. 靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物早期胚胎主要特征研究1）靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物卵及克隆胚的生物學(xué)特性的研究2）靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆胚胎基因組甲基化研究3）靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物種間核移植研

12、究2. 核供體細(xì)胞的制備和優(yōu)化1）用于核移植的體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的篩選和制備2）靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立和優(yōu)化3. 通過(guò)核移植證明去分化1）靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆2）從克隆胚胎中分離胚胎干細(xì)胞并建系目標(biāo)：建立高效的靈長(zhǎng)類(lèi)核移植方法，克隆恒河猴；從克隆胚胎中分離ES細(xì)胞系課題2. 非人靈長(zhǎng)類(lèi)克隆胚重編程過(guò)程早期表達(dá)重要基因的克隆及功能研究主要研究?jī)?nèi)容：1. 胚胎基因組早期表達(dá)基因的研究 1）早期表達(dá)基因的篩選、鑒定2）早期表達(dá)基因的染色體定位2. 在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用的新的轉(zhuǎn)錄因子的研究1）新的轉(zhuǎn)錄子的分離2）新的轉(zhuǎn)錄子的鑒定及其生物學(xué)功能的研究3. 印記的消除對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆胚發(fā)育

13、的影響1）去甲基化藥物的篩選2）印記的消除對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆胚發(fā)育的影響4. 表觀(guān)遺傳網(wǎng)絡(luò)的研究目標(biāo)：發(fā)現(xiàn)恒河猴體細(xì)胞核移植后早期胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的重要基因及其功能和作用方式；研究遺傳印記對(duì)克隆胚發(fā)育的影響課題3. 分離和鑒定體細(xì)胞去分化關(guān)鍵蛋白主要研究?jī)?nèi)容：1. 卵母細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜研究1）樣品采集2）蛋白表達(dá)譜及分析3）建立蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)研究2. 重編程過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白1）數(shù)據(jù)采集和分析2）篩選重編程過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白3）分析這些關(guān)鍵蛋白在重編程過(guò)程中的作用目標(biāo)：獲得誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的關(guān)鍵蛋白并闡明其作用機(jī)制課題4.維持胚胎干細(xì)胞全能性的機(jī)理研究主要研究?jī)?nèi)容：1. Oct4 和

14、Nanog的結(jié)構(gòu)與功能的研究 1）研究Oct4和Nanog的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域2）各功能性結(jié)構(gòu)域與胚胎干多能性或分化的相關(guān)性研究3）篩選能夠調(diào)節(jié)Oct4和Nanog表達(dá)的蛋白2. Nanog和Oct4調(diào)控的下游基因的研究1）篩選胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞差異表達(dá)的基因2）Oct4 和Nanog下游基因的鑒定3）克隆與胚胎干細(xì)胞多能性相關(guān)的基因3. Nanog和Oct4表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究1）Nanog和Oct4啟動(dòng)子的克隆2）鑒別在胚胎干細(xì)胞中特異性調(diào)控Nanog和Oct4表達(dá)的順式作用元件3）尋找其他與Oct4或Nanog啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子目標(biāo)：揭示Nanog、Oct4等

15、多能性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及在蛋白水平上的調(diào)控機(jī)制；并確定和克隆它們的下游因子，探討其作用機(jī)制課題5. 恒河猴胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的機(jī)制研究主要研究?jī)?nèi)容：1. 恒河猴胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的分子調(diào)控機(jī)制和信號(hào)通路的研究1）HGF 或 bFGF 與BMP信號(hào)在恒河猴胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中的相互作用的研究2）HGF 或bFGF激活的下游信號(hào)通路的研究3）脂筏對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響4）Wnt信號(hào)在神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中的作用2.鑒定對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和分化起重要作用的基因目標(biāo):了解恒河猴胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的主要信號(hào)途徑課題6.非人靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中基因組的程序化表達(dá)及早期中

16、樞神經(jīng)系統(tǒng)分化的分子機(jī)制主要研究?jī)?nèi)容：采用DNA芯片技術(shù)對(duì)恒河猴（Macaca mulatta）正常胚和體細(xì)胞克隆胚不同發(fā)育時(shí)期（從囊胚期、原腸胚、神經(jīng)胚到大腦形成）的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，尋找在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中特征性表達(dá)的基因和基因家族；同時(shí)，比較人和恒河猴胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞前后基因表達(dá)圖譜的差異，揭示參與神經(jīng)系統(tǒng)分化的基因和基因家族;建立非人靈長(zhǎng)類(lèi)（恒河猴）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期各個(gè)重要發(fā)育時(shí)期的基因組表達(dá)圖譜，篩選各個(gè)發(fā)育時(shí)期特異表達(dá)的基因和基因家族，揭示靈長(zhǎng)類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育在基因表達(dá)水平的分子機(jī)制。目標(biāo)：篩選出在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中特征性表達(dá)的基因和基因家族四、年度計(jì)劃年度研

17、究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1. 靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物卵及克隆胚的生物學(xué)特性的研究2. 靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物卵及克隆胚胎基因組甲基化研究3. 恒河猴胚胎早期表達(dá)基因的篩選、鑒定及染色體定位4. 收集成熟卵母細(xì)胞、活化卵母細(xì)胞和受精卵，在現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立和完善保障本項(xiàng)目順利實(shí)施的相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)5. 研究Oct4和Nanog的轉(zhuǎn)錄激活、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，并在細(xì)胞水平上探討各功能性結(jié)構(gòu)域與胚胎干細(xì)胞多能性或分化的相關(guān)性6. HGF和bFGF在誘導(dǎo)獼猴胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程的信號(hào)通路及其與BMP信號(hào)通路的關(guān)系7. HGF和bFGF所激活的下游信號(hào)途徑的研究8. 恒河猴正常神經(jīng)

18、細(xì)胞和體細(xì)胞克隆方法獲得的胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)譜的比較1. 確定卵母細(xì)胞骨架成分的分布，并測(cè)出一些細(xì)胞周期蛋白的活性2. 確定靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物最佳的超數(shù)排卵方案3. 確定克隆胚胎基因組的甲基化狀態(tài)4. 篩選出正常胚胎與克隆胚胎差異表達(dá)的基因及其在染色體上的定位和表達(dá)譜5. 獲得供蛋白質(zhì)組學(xué)分析所需的細(xì)胞樣本；建立和完善包括少量細(xì)胞的雙向電泳技術(shù)，低豐度蛋白的鑒定技術(shù)和可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行局部氨基酸序列測(cè)定和翻譯后修飾鑒定的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)等在內(nèi)的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)6. 鑒定出Oct4和Nanog發(fā)揮作用時(shí)的各種結(jié)構(gòu)域的功能。分別鑒定出它們的基因調(diào)控結(jié)構(gòu)域，蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域。并在細(xì)胞水平上闡明各個(gè)結(jié)構(gòu)域維持干

19、細(xì)胞多能性的作用機(jī)制7. 證明BMP信號(hào)通路在HGF和bFGF引起的神經(jīng)干細(xì)胞分化中的作用，解釋HGF或bFGF信號(hào)途徑與BMP途徑的關(guān)系；8. 發(fā)現(xiàn) HGF和bFGF引起的相應(yīng)的受體磷酸化位點(diǎn)及其與HGF和bFGF濃度的關(guān)系。9. 通過(guò)基因表達(dá)譜的比較篩選出正常分化的神經(jīng)細(xì)胞中特異表達(dá)的基因和基因家族，從而為體外人工誘導(dǎo)由體細(xì)胞克隆獲得的胚胎干細(xì)胞分化為具有正常功能的神經(jīng)細(xì)胞提供可用的分子標(biāo)記和誘導(dǎo)基因。10. 發(fā)表學(xué)術(shù)論文7-10篇第二年1. 靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物種間核移植研究2. 用于核移植供體的單克隆體細(xì)胞系的制備3. 從克隆胚胎中分離胚胎干細(xì)胞并建系4. 在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用的新的轉(zhuǎn)

20、錄子的分離和鑒定5. 建立卵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，應(yīng)用生物信息學(xué)手段對(duì)卵母細(xì)胞中表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析，并利用所得數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。6. 篩選能夠調(diào)節(jié)Oct4或Nanog表達(dá)的蛋白。并揭示它們的調(diào)節(jié)機(jī)制。利用生物信息學(xué)技術(shù)手段篩選受Oct4或Nanog調(diào)控的候選基因7. 繼續(xù)進(jìn)行HGF和bFGF所激活的下游信號(hào)途徑的研究。8. 根據(jù)第一年的研究結(jié)果，進(jìn)一步比較正常神經(jīng)細(xì)胞和體外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞在基因表達(dá)譜上的異同。1. 明確靈長(zhǎng)類(lèi)體細(xì)胞在不同動(dòng)物卵母細(xì)胞中去分化的差異2. 從成體猴子的組織或流產(chǎn)胎兒獲得和培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，并建立單克隆細(xì)胞系3. 利用克隆囊胚建立非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞系

21、4. 分離到幾種在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子5. 建立全球共享的，符合國(guó)際雙向電泳數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)的卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)6. 利用酵母雙雜交技術(shù)篩選能與Oct4或Nanog相互作用的蛋白質(zhì)。利用生物信息及分子生物學(xué)技術(shù)篩選出多能細(xì)胞及非多能細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因，并從中篩選出受Nanog、Oct4調(diào)控的下游基因。7. 篩選出HGF和bFGF激活受體酪氨酸激酶后可能引發(fā)的影響神經(jīng)干細(xì)胞分化的下游信號(hào)通路。8. 證明HGF和bFGF引起神經(jīng)干細(xì)胞分化的可能途徑。9. 通過(guò)與正常神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)譜的比較，篩選出在體外誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞中不正常表達(dá)的基因，為進(jìn)一步改進(jìn)體外誘導(dǎo)分化系統(tǒng)提供依據(jù)

22、10. 發(fā)表學(xué)術(shù)論文10-13篇第三年1. 靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物供體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)2. 轉(zhuǎn)染體細(xì)胞單克隆細(xì)胞系和胚胎干細(xì)胞3. 在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用的新的轉(zhuǎn)錄子生物學(xué)功能的研究4. 去甲基化藥物的篩選5. 分析比較成熟卵母細(xì)胞、活化卵母細(xì)胞和受精卵的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，用western印記和免疫組化等方法驗(yàn)證它們之間存在表達(dá)差異，并對(duì)這些蛋白的表達(dá)模式和細(xì)胞定位進(jìn)行研究6. 研究能與Oct4或Nanog相互作用的各種蛋白對(duì)它們的調(diào)節(jié)機(jī)制。并探討這些蛋白在干細(xì)胞多能性方面的作用機(jī)制。利用分子生物學(xué)手段從候選基因中鑒定受Oct4或Nanog 調(diào)控的下游基因。7. 開(kāi)展脂筏對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影

23、響和Wnt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用及其與HGF和bFGF途徑的關(guān)系的研究。8. 采集恒河猴從囊胚期直至胎兒大腦形成期各關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期的組織材料，優(yōu)化由少量組織（囊胚和原腸胚）進(jìn)行DNA芯片分析的技術(shù)方法，并著手進(jìn)行初步的芯片分析。1. 獲得可長(zhǎng)期培養(yǎng)且遺傳穩(wěn)定的供體細(xì)胞2. 篩選到穩(wěn)定表達(dá)半乳糖苷酶和綠色熒光蛋白的胚胎干細(xì)胞，并獲得亞克隆3. 發(fā)現(xiàn)在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用的新的轉(zhuǎn)錄子生物學(xué)功能4. 篩選出適合于在核移植前處理供體細(xì)胞的藥物5. 篩選并確立在體細(xì)胞核移植后重編程過(guò)程中可能起關(guān)鍵作用的蛋白6. 篩選出能在蛋白水平上特異性調(diào)控Oct4或Nanog的有價(jià)值的調(diào)節(jié)性蛋白。并篩選

24、出一系列受到Oct4或Nanog調(diào)控的下游基因7. 分析出可能對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化具有影響的lipid rafts；理解Wnt信號(hào)通路在HGF和bFGF引起的神經(jīng)干細(xì)胞分化中的作用，解釋HGF或bFGF信號(hào)途徑與Wnt途徑的關(guān)系，并證明Wnt信號(hào)通路中一些配體以及關(guān)鍵分子在此過(guò)程中的作用。8. 完成囊胚、原腸胚和部分神經(jīng)胚及胎兒組織的采集，建立少量組織的DNA芯片分析方法。9. 發(fā)表學(xué)術(shù)論文10-14篇。第四年1. 靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立和優(yōu)化2. 制備靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆胚胎并進(jìn)行胚胎移植3. 印記的消除對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆胚發(fā)育的影響4. 早期胚胎表觀(guān)遺傳網(wǎng)絡(luò)的研究5. 對(duì)可能起關(guān)鍵作用蛋白質(zhì)進(jìn)行深入的功能研究，包括蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究，與其它蛋白相互作用的研究，及利用各種表達(dá)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)在體內(nèi)、體外研究其功能。6. 研究和探討受Oct4或Nanog 調(diào)控的基因在干細(xì)胞多能性方面的作用機(jī)制。7. HGF、bFGF誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的時(shí)空關(guān)系：其對(duì)不同發(fā)育階段的類(lèi)胚體細(xì)胞激活不同的下游信號(hào)通路、導(dǎo)致產(chǎn)生不同的細(xì)胞類(lèi)型。8. 進(jìn)行一些決定神經(jīng)干細(xì)胞分化的基因的篩選工作。9. 系統(tǒng)分析恒河猴神經(jīng)系