河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物分離工程 第九章 色譜技術(shù)

1、本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容一、概述一、概述u色色層法是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)層法是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)，本世紀(jì)初本世紀(jì)初俄國(guó)植物學(xué)家俄國(guó)植物學(xué)家M.TswettM.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素。植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素。u現(xiàn)在現(xiàn)在色色層法已成為層法已成為生物工程、生物工程、生物化學(xué)、分子生物生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。層析法的發(fā)展過(guò)程層析法的發(fā)展過(guò)程u19031903年年 TswettTswett發(fā)表了吸附色譜分離植物色素的論文，發(fā)表

2、了吸附色譜分離植物色素的論文，三年后他在另外兩篇論文中正式提出色譜法。三年后他在另外兩篇論文中正式提出色譜法。u19311931年年 色譜法提出后，并未立即受到重視。經(jīng)過(guò)大約色譜法提出后，并未立即受到重視。經(jīng)過(guò)大約2020年，由于年，由于LedererLederer的工作，人們才重視色譜技術(shù)。的工作，人們才重視色譜技術(shù)。u19381938年年 IzmailovIzmailov和和ShraiberShraiber第一次使用薄層色譜法。第一次使用薄層色譜法。u19381938年年 TaylorTaylor和和UrayUray用離子交換分離鋰和鉀的同位素用離子交換分離鋰和鉀的同位素。4040年代，合

3、成離子交換樹(shù)脂商品出現(xiàn)后，離子交換年代，合成離子交換樹(shù)脂商品出現(xiàn)后，離子交換色譜才得到廣泛應(yīng)用。色譜才得到廣泛應(yīng)用。19441944年在美國(guó)橡樹(shù)嶺國(guó)家實(shí)驗(yàn)?zāi)暝诿绹?guó)橡樹(shù)嶺國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和衣阿華州立大學(xué)分離和鑒定了稀土元素。在室和衣阿華州立大學(xué)分離和鑒定了稀土元素。在19441944年到年到5050年代中，芝加哥大學(xué)和加州大學(xué)完成了超鈾元年代中，芝加哥大學(xué)和加州大學(xué)完成了超鈾元素的分離。素的分離。1941年 Martin和Synge發(fā)展了分配色譜。1944年 Martin等發(fā)展了紙色譜。1952年 Martin和James發(fā)展了氣-液分配色譜。1956年 Van Deemter等發(fā)表關(guān)于色譜效率的速率

4、理論，并應(yīng)用到氣相色譜中。1957年 制作離子交換色譜氨基酸分析儀。1959年 在Cordon Conference上提出了第一篇凝膠過(guò)濾色譜的報(bào)告。1963年 Giddings的理論工作為現(xiàn)代液相色譜奠定了理論基礎(chǔ)。u60年代中期 凝膠滲透色譜出現(xiàn)。u60年代后期 親和色譜出現(xiàn)。u1969年 現(xiàn)代液相色譜開(kāi)始受到重視。u有兩次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)是授予色譜學(xué)領(lǐng)域的研究工作：1948年瑞典科學(xué)家Tiselins由于他的關(guān)于電泳和吸附分析的研究獲獎(jiǎng)，1952年英國(guó)的Martin和Synge因?yàn)榘l(fā)展了分配色譜而獲獎(jiǎng)。 u對(duì)所有的層析系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，必須具備三個(gè)單元部分，一個(gè)是固定相，一個(gè)是移動(dòng)相，另一個(gè)是需要離

5、析的樣品。u固相的阻滯作用是由不同的機(jī)理產(chǎn)生的,其中包括相的變化、相的分配、在溶液中的分子篩效應(yīng)或電場(chǎng)作用。cqKd樣品從進(jìn)入色譜柱到流出色譜柱所需要的時(shí)間。樣品從進(jìn)入色譜柱到流出色譜柱所需要的時(shí)間。從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。流出溶劑的體積。遷移距離流動(dòng)相在色譜系統(tǒng)中的溶質(zhì)的遷移距離fRsdmmfAKAAR洗脫體積洗脫體積sdmeVKVV色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度22/1)(54. 5WtNR2)(16bRWtN NLH 常用的吸附劑：常用的吸附劑：正相色譜正相色譜u極性固定相（帶有二醇基、氨基

6、、和氰基的固定相及硅膠、三氧化二鋁等）、非極性流動(dòng)相（如正己烷）的分離方法。根據(jù)分子的極性大小將其分開(kāi)。u與固定相產(chǎn)生強(qiáng)極性相互作用的樣品分子難洗脫，在柱內(nèi)停留比較長(zhǎng)的時(shí)間。極性較弱或非極性分子容易洗脫，在柱內(nèi)停留時(shí)間較短。u因此，正相色譜可以根據(jù)溶劑極性差別而達(dá)到分離的目的。u正相色譜有氰基柱、氨基柱、硅膠柱和二醇基柱。u反相層析(Reversed-phase chromatography，RPC)利用非極性的介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進(jìn)行分離。uRPC中溶質(zhì)通過(guò)疏水性相互作用分配于固定相表面。RPC固定相表面完全被非極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)強(qiáng)烈的疏

7、水性。采用極性有機(jī)溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進(jìn)行洗脫。Source RPC30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect常用的離子交換樹(shù)脂原理原理u離子交換層析(Ion exchange chromatography，IEC)利用離子交換劑為固定相，是根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離的洗脫層析法。 洗脫方法洗脫方法uIEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用流動(dòng)相離子強(qiáng)度線性增大的線性梯度洗脫法(linear gradient elution)或離子強(qiáng)度階躍增大的逐次洗脫法(step wise

8、 elution)。u線性梯度洗脫，流動(dòng)相的離子強(qiáng)度線性增大，移動(dòng)速度逐漸增大 ，使恒定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì)，在較小的流動(dòng)相體積下洗脫。u逐次洗脫，流動(dòng)相的離子強(qiáng)度階躍增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)的降低和移動(dòng)速度的增大也是階段式的。u如果流動(dòng)相離子強(qiáng)度的階躍速度很快，逐次洗脫就接近了線性梯度洗脫；反之則接近恒定洗脫。u因此逐次洗脫是介于恒定洗脫和線性梯度洗脫之間的一種洗脫法。線性梯度洗脫法u優(yōu)點(diǎn)：流動(dòng)相離子強(qiáng)度(鹽濃度)連續(xù)增大，u缺點(diǎn)：需要特殊的調(diào)配濃度梯度的設(shè)備。逐次洗脫法u優(yōu)點(diǎn)：利用切換不同鹽濃度的流動(dòng)相溶液進(jìn)行洗脫，不需要特殊梯度設(shè)備，操作簡(jiǎn)便；u缺點(diǎn)：因?yàn)榱鲃?dòng)相濃度不連續(xù)變化，容易出

9、現(xiàn)干擾峰。此外，容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)象，因此洗脫操作參數(shù)的設(shè)計(jì)較困難。IEC的特點(diǎn)的特點(diǎn)u(1)料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作；u(2)應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長(zhǎng)較短；u(3)產(chǎn)品回收率高；u(4)商品化的離子交換劑種類(lèi)多，選擇余地大，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑五、凝膠色譜分子篩凝膠色譜原理Desalting proteinsproteinssalts分子篩凝膠色譜原理分子篩凝膠色譜原理u凝膠過(guò)濾層析(Gel filtration chromatography，GFC) 根據(jù)料液中溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的液相層析法。uGFC操作中溶

10、質(zhì)的分配系數(shù)只是相對(duì)分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu)(孔徑分布)的函數(shù)，與所用洗脫液的pH值和離子強(qiáng)度等物性無(wú)關(guān)。uGFC操作一般采用組成一定組成一定的洗脫液進(jìn)行洗脫展開(kāi)，這種洗脫法稱為恒定洗脫法(isocratic (isocratic elution)elution)。良好凝膠過(guò)濾介質(zhì)：良好凝膠過(guò)濾介質(zhì)：u(1)親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；u(2)穩(wěn)定性強(qiáng)，在較寬的pH和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)；u(3)具有一定的孔徑分布范圍；u(4)機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力(流速)u軟凝膠，耐壓能力較低，其中Sephadex G是最傳統(tǒng)的軟凝

11、膠過(guò)濾介質(zhì)之一。uSephadex G是利用葡聚糖(右旋糖酐)交聯(lián)制備的，交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷(epichloryohdrin)。u原料中環(huán)氧氯丙烷用量越大，交聯(lián)度越高，凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水量越小。凝膠特性參數(shù)凝膠特性參數(shù)u(1)排阻極限排阻極限：指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子質(zhì)量。 u(2)分級(jí)范圍分級(jí)范圍：能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。u(3)溶脹率溶脹率：某些市售的干燥凝膠顆粒，使用前要用水溶液進(jìn)行溶脹處理，溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分?jǐn)?shù)稱為溶脹率。u(4)凝膠粒徑凝膠粒徑：凝膠一般為球形，其粒徑大小對(duì)分離度有重要影響。u(5

12、)床體積床體積：即1g干燥凝膠溶脹后所占有的體積。u(6)空隙體積空隙體積：指層析柱中凝膠之間空隙的體積。GFC的應(yīng)用的應(yīng)用u分離純化u脫鹽u相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：u(1)溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生相互作用，因此可采用恒定洗脫法洗脫展開(kāi)，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近100；u(2)每批分離操作結(jié)束后不需要進(jìn)行介質(zhì)的清洗或再生，故容易實(shí)施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；u(3)作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快，精度高；與超濾法相比，剪切應(yīng)力小，蛋白質(zhì)活性收率高；u(4)分離機(jī)理簡(jiǎn)單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：u(1)僅根據(jù)溶質(zhì)之間相對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離，選擇性低，料液處理量小；u(2)經(jīng)G

13、FC洗脫展開(kāi)后產(chǎn)品被稀釋。因此需要在具有濃縮作用的單元操作(如超濾、離子交換和親和層析等)后使用。六、疏水作用層析(Hydrophobic Interaction Chromatography）Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity靠疏水基團(tuán)的疏水力來(lái)分離靠疏水基團(tuán)的疏水力來(lái)分離生物大分子的液相色譜法稱生物大分子的液相色譜法稱為疏水作用色層分離法。為疏水作用色層

14、分離法。 原理原理u依據(jù)生物大分子疏水性差異實(shí)現(xiàn)分離。u疏水性相互作用層析(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)(疏水性配基)的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類(lèi)生物大分子分離純化的洗脫層析法。具體方法是：具體方法是：u在高鹽環(huán)境下，蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域暴露，固定相表面修飾了一些疏水的基團(tuán)，這樣蛋白質(zhì)的疏水部分即可與固定相發(fā)生較強(qiáng)的疏水相互作用，從而被結(jié)合在固定相表面，u而一旦降低流動(dòng)相的鹽濃度即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的洗脫，方便易行，u是蛋白質(zhì)分離的常用手段之一。Mechani

15、sm of HICu常用的疏水性配基 苯基 短鏈烷基(C3-C8) 烷氨基 聚乙二醇 聚醚HICHIC的特點(diǎn)的特點(diǎn)u(1)由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液；u(2)可通過(guò)調(diào)節(jié)疏水配基鏈長(zhǎng)和密度調(diào)節(jié)吸附力，因此可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑； u(3)疏水性吸附劑種類(lèi)多，選擇余地大，價(jià)格與離子交換劑相當(dāng)。疏水色譜和反相色譜都是利用蛋白質(zhì)上疏水基團(tuán)作用的大小不同而得到分離但二者又完全不同：u疏水配基的密度不同。疏水配基的密度不同。 反相色譜的疏配基一般采用數(shù)量級(jí)為102個(gè)mol/mL膠，配基為418個(gè)C的烷基配基； HIC中密度一般為1050mol/mL膠，配基一般為28個(gè)C的烷基。u流動(dòng)相體系不同。流動(dòng)相體系不同。 反相色譜流動(dòng)相一般為有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇） 而疏水色譜流動(dòng)相則為在水溶液。u再生條件不同。再生條件不同。 反相色譜再生在劇烈條件下，如采用極性小的有機(jī)溶劑，使得蛋白質(zhì)容易變性，因此反相色譜主要用于小分子肽或蛋白質(zhì)。 而疏水色譜主要針對(duì)大分子，采用降低鹽濃度等方法進(jìn)行再生，條件比較溫和。疏水色譜主要用于分離疏水基團(tuán)較多的蛋白質(zhì)。七、親和色譜（Affinity chromatography）AC ver