第章基因表達(dá)及功能分析基本策略

1、目目 錄錄第二十六章第二十六章 基因表達(dá)及功能分析的基因表達(dá)及功能分析的基本策略基本策略STRATEGIES FOR ANALYZING GENE EXPRESSION AND FUNCTION目目 錄錄第一節(jié)第一節(jié) 基因表達(dá)的分析策略基因表達(dá)的分析策略Strategies for Analyzing Gene Expression目目 錄錄一、通過檢測一、通過檢測mRNA揭示基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)特征揭示基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)特征根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達(dá)分析分為根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達(dá)分析分為:封閉性系統(tǒng)研究方法封閉性系統(tǒng)研究方法:例如例如DNA微陣列、微陣列、N

2、orthern印跡、實(shí)印跡、實(shí)時(shí)時(shí)RT-PCR等方法，其應(yīng)用范圍僅限于已測序的物種，只能等方法，其應(yīng)用范圍僅限于已測序的物種，只能研究已知的基因。研究已知的基因。開放性系統(tǒng)研究方法開放性系統(tǒng)研究方法: 如差異顯示如差異顯示PCR、雙向基因表達(dá)指紋、雙向基因表達(dá)指紋圖譜、分子索引法、隨機(jī)引物圖譜、分子索引法、隨機(jī)引物PCR指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)和分析未知的基因。和分析未知的基因。這里主要針對已知基因的常用表達(dá)分析方法做一介紹。這里主要針對已知基因的常用表達(dá)分析方法做一介紹。目目 錄錄（一）基于雜交原理的方法可檢測（一）基于雜交原理的方法可檢測mRNAmRNA表達(dá)水平表達(dá)水平1N

3、orthern印跡印跡（Northern blot） 既可分析既可分析mRNA表達(dá)又可驗(yàn)證表達(dá)又可驗(yàn)證cDNA新序列新序列 是一種基于是一種基于RNA-DNA雜交原理建立的一種雜交原理建立的一種RNA分析分析技術(shù)技術(shù)目目 錄錄Northern印跡分析原理示意圖印跡分析原理示意圖目目 錄錄2核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（ribonuclease protection assay，RPA）可用于可用于mRNA定量和定量和RNA剪接分析剪接分析 是一種基于雜交原理分析是一種基于雜交原理分析mRNA的方法，既可對的方法，既可對mRNA進(jìn)行定量分析又可研究其結(jié)構(gòu)特征，靈敏進(jìn)行定量分析又可研究其結(jié)

4、構(gòu)特征，靈敏度和特異性都很高。度和特異性都很高。 目目 錄錄核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)原理示意圖核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)原理示意圖目目 錄錄可對可對mRNA進(jìn)行區(qū)域定位進(jìn)行區(qū)域定位 是利用雜交原理建立的組織原位是利用雜交原理建立的組織原位mRNA檢測技術(shù)，可檢測技術(shù)，可對細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的對細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的mRNA進(jìn)行區(qū)域定位。同進(jìn)行區(qū)域定位。同時(shí)也可作為定量分析的補(bǔ)充。時(shí)也可作為定量分析的補(bǔ)充。通過設(shè)計(jì)與目標(biāo)通過設(shè)計(jì)與目標(biāo)mRNA堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列，堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列，標(biāo)記后作為探針；該探針能夠特異性地與目標(biāo)靶序列標(biāo)記后作為探針；該探針能夠特異性地與目標(biāo)靶序列雜交，檢測標(biāo)記信號來

5、確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)雜交，檢測標(biāo)記信號來確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的區(qū)位信息。的區(qū)位信息。雖然原位雜交在功能性方面提供的信息較少，但是該雖然原位雜交在功能性方面提供的信息較少，但是該技術(shù)還是被廣泛用于組織中的基因表達(dá)分析，這是因技術(shù)還是被廣泛用于組織中的基因表達(dá)分析，這是因?yàn)槠漭^高的穩(wěn)定性、較廣泛的靶點(diǎn)和組織適用性。為其較高的穩(wěn)定性、較廣泛的靶點(diǎn)和組織適用性。3原位雜交（原位雜交（in situ hybridization，ISH）目目 錄錄（二）兩種變換的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是常用的（二）兩種變換的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是常用的mRNA檢測方法檢測方法1反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR 可用于可用于mRNA的半定

6、量分析的半定量分析 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 是一種簡單、快捷地對是一種簡單、快捷地對RNA進(jìn)行定性、定量分析的方進(jìn)行定性、定量分析的方法。它是以法。它是以mRNA為模板，體外擴(kuò)增為模板，體外擴(kuò)增cDNA，再以，再以cDNA為模板進(jìn)行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的為模板進(jìn)行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。RT-PCR技術(shù)一般用于技術(shù)一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽性參的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測照，則可對待測RNA樣品進(jìn)行半定量分析。樣品進(jìn)行半定量分析。 該方法適合對待測樣品進(jìn)行初步篩選，目前已廣泛被該方法適合對待測樣品進(jìn)行

7、初步篩選，目前已廣泛被實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR替代。替代。目目 錄錄常用于常用于mRNA的定量分析的定量分析 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)是定量分析是定量分析mRNA的最通用、最快速、的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對最簡便的方法，該方法是對PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，具反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。有很高的靈敏度和特異性。2實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR目目 錄錄目前有目前有5種技術(shù)用于實(shí)時(shí)定量種技術(shù)用于實(shí)時(shí)定量PCR： 其中最經(jīng)濟(jì)、簡便的技術(shù)是利用熒光染料（如其中最經(jīng)濟(jì)、簡

8、便的技術(shù)是利用熒光染料（如SYBR Green ）與雙鏈）與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴(kuò)增產(chǎn)分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；物的增加； 其他其他4種方法都是以熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸為探針種方法都是以熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸為探針與正確的擴(kuò)增子雜交，包括與正確的擴(kuò)增子雜交，包括5核酸酶法（即人們熟知的核酸酶法（即人們熟知的TaqManTM）、分子信標(biāo)、）、分子信標(biāo)、ScropionsTM和探針雜交法，和探針雜交法，它們擁有更強(qiáng)的特異性，可以避免對它們擁有更強(qiáng)的特異性，可以避免對PCR后溶解曲線的后溶解曲線的需求，以及后續(xù)的需求，以及后續(xù)的Southern雜交或?qū)U(kuò)增子的測序鑒定，雜

9、交或?qū)U(kuò)增子的測序鑒定，但是成本較高。但是成本較高。目目 錄錄SYBR Green實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR分析原理示意圖分析原理示意圖 目目 錄錄二、通過蛋白質(zhì)檢測揭示基因二、通過蛋白質(zhì)檢測揭示基因 翻譯水平的表達(dá)特征翻譯水平的表達(dá)特征 Western印跡（印跡（Western blot）是一種免疫印跡技術(shù)，是一種免疫印跡技術(shù)，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)/多肽多肽分子。當(dāng)在蛋白質(zhì)水平上檢測特定基因的表達(dá)活性時(shí)，最分子。當(dāng)在蛋白質(zhì)水平

10、上檢測特定基因的表達(dá)活性時(shí)，最常用的方法就是利用常用的方法就是利用Western印跡對細(xì)胞或組織的總蛋白印跡對細(xì)胞或組織的總蛋白質(zhì)中的特異蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和半定量分析。質(zhì)中的特異蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和半定量分析。（一）采用特異抗體經(jīng)（一）采用特異抗體經(jīng)Western印跡可直接印跡可直接 測定基因編碼多肽測定基因編碼多肽目目 錄錄1. 蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品的制備2. SDS-PAGE分離分離3. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜4. 特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印跡雜交跡雜交5. 再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記信號的第二抗體（即抗抗體，再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記信

11、號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的Ig）6. 最后經(jīng)與酶的底物反應(yīng)而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取最后經(jīng)與酶的底物反應(yīng)而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免疫印跡信息免疫印跡信息Western blot基本程序基本程序目目 錄錄 酶聯(lián)免疫吸附分析（酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是一種建立在抗原也是一種建立在抗原-抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)分析基本方法。質(zhì)分析基本方法。 該方法不需經(jīng)電泳分離待檢樣品蛋白質(zhì)，而是預(yù)先將樣該方法不需經(jīng)電泳分離待檢樣品蛋白質(zhì)，而是預(yù)先

12、將樣品包被在支持體上，以后反應(yīng)過程與品包被在支持體上，以后反應(yīng)過程與Western印跡大致相同印跡大致相同順序結(jié)合（即順序結(jié)合（即“吸附吸附”）特異抗體（一抗）及與酶連接的）特異抗體（一抗）及與酶連接的第二抗體（也可預(yù)先包被抗體，第二抗體（也可預(yù)先包被抗體，“吸附吸附”抗原），再進(jìn)行酶抗原），再進(jìn)行酶-底物反應(yīng)。反應(yīng)后通過專門的酶標(biāo)儀測定、記錄數(shù)據(jù)。底物反應(yīng)。反應(yīng)后通過專門的酶標(biāo)儀測定、記錄數(shù)據(jù)。（二）酶聯(lián)免疫吸附分析與（二）酶聯(lián)免疫吸附分析與Western印跡原理印跡原理相似但形式不同相似但形式不同目目 錄錄特點(diǎn)：特點(diǎn)：具有特異性；具有特異性；靈敏度很高；靈敏度很高；穩(wěn)定、操作簡便，標(biāo)本用量

13、少，適于大規(guī)模篩查，穩(wěn)定、操作簡便，標(biāo)本用量少，適于大規(guī)模篩查，尤其適用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原；尤其適用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原；既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析。既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析。 被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域。免疫學(xué)等領(lǐng)域。 酶聯(lián)免疫吸附分析酶聯(lián)免疫吸附分析目目 錄錄 免疫組織化學(xué)（免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）與與免疫免疫細(xì)胞化學(xué)（細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）原理相同，都是利）原理相同，都是利用標(biāo)記的特異性抗體通過抗原用標(biāo)記的特異性抗體通過

14、抗原-抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)，抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)，在組織或細(xì)胞原位檢測特定抗原（即目標(biāo)蛋白質(zhì)）的在組織或細(xì)胞原位檢測特定抗原（即目標(biāo)蛋白質(zhì)）的方法，簡稱為免疫組化實(shí)驗(yàn)。近年來由于熒光標(biāo)記抗方法，簡稱為免疫組化實(shí)驗(yàn)。近年來由于熒光標(biāo)記抗體的廣泛應(yīng)用，這兩種方法又被統(tǒng)稱為體的廣泛應(yīng)用，這兩種方法又被統(tǒng)稱為免疫熒光法。免疫熒光法。（三）免疫組化實(shí)驗(yàn)可對組織（三）免疫組化實(shí)驗(yàn)可對組織/ /細(xì)胞細(xì)胞 表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行原位檢測表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行原位檢測目目 錄錄（immunofluorescence），可應(yīng)用熒光（倒置）顯微鏡或），可應(yīng)用熒光（倒置）顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡（激光共聚焦顯微鏡（confocal

15、microscopy）對靶分子進(jìn)行對靶分子進(jìn)行定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進(jìn)行斷層定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進(jìn)行斷層成像，是在蛋白質(zhì)水平分析基因表達(dá)的直觀方法。成像，是在蛋白質(zhì)水平分析基因表達(dá)的直觀方法。其中抗體對于蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的特異性、種間交叉反應(yīng)、檢測其中抗體對于蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的特異性、種間交叉反應(yīng)、檢測系統(tǒng)的靈敏性以及細(xì)胞或組織的固定類型是該方法的關(guān)鍵系統(tǒng)的靈敏性以及細(xì)胞或組織的固定類型是該方法的關(guān)鍵因素。因素。運(yùn)用雙重著色或多重著色程序同時(shí)對多個(gè)感興趣的靶分子運(yùn)用雙重著色或多重著色程序同時(shí)對多個(gè)感興趣的靶分子進(jìn)行檢測，是一種揭示更多有關(guān)細(xì)胞群的功能和它們之間進(jìn)行

16、檢測，是一種揭示更多有關(guān)細(xì)胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。相互作用信息的有效方法。免疫組化主要是作為定性、定位的技術(shù)，若結(jié)合密度計(jì)量免疫組化主要是作為定性、定位的技術(shù)，若結(jié)合密度計(jì)量系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)等測量工具也可以得到定量的數(shù)據(jù)。系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)等測量工具也可以得到定量的數(shù)據(jù)。目目 錄錄 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）在細(xì)胞水平分析特定在細(xì)胞水平分析特定蛋白質(zhì)的基本原理也是抗原蛋白質(zhì)的基本原理也是抗原-抗體反應(yīng)，它利用熒光標(biāo)記抗體反應(yīng)，它利用熒光標(biāo)記抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析熒光信號，抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析熒光信號，從

17、而根據(jù)細(xì)胞表達(dá)特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細(xì)從而根據(jù)細(xì)胞表達(dá)特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細(xì)胞（即特異基因表達(dá)的細(xì)胞）作出判斷。胞（即特異基因表達(dá)的細(xì)胞）作出判斷。（四）流式細(xì)胞術(shù)用于分析（四）流式細(xì)胞術(shù)用于分析 表達(dá)特異蛋白質(zhì)的陽性細(xì)胞表達(dá)特異蛋白質(zhì)的陽性細(xì)胞目目 錄錄流式細(xì)胞術(shù)可以檢測活細(xì)胞，也可以檢測用甲醛固定的流式細(xì)胞術(shù)可以檢測活細(xì)胞，也可以檢測用甲醛固定的細(xì)胞。細(xì)胞。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)水平的定量分析，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)水平的定量分析，并能夠根據(jù)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)模式區(qū)分細(xì)胞亞群。并能夠根據(jù)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)模式區(qū)分細(xì)胞亞群。此外，流式細(xì)胞術(shù)可以使用多

18、個(gè)熒光標(biāo)記的抗體同時(shí)對此外，流式細(xì)胞術(shù)可以使用多個(gè)熒光標(biāo)記的抗體同時(shí)對多個(gè)基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記和監(jiān)測，是對細(xì)胞進(jìn)行快速分析、多個(gè)基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記和監(jiān)測，是對細(xì)胞進(jìn)行快速分析、分選、特征鑒定的一種有效方法。分選、特征鑒定的一種有效方法。目目 錄錄三、高通量檢測技術(shù)成為基因表達(dá)三、高通量檢測技術(shù)成為基因表達(dá)研究的有力工具研究的有力工具 高通量篩選高通量篩選(High throughput screening，HTS)技術(shù)技術(shù)是在大量核酸、多肽信息累計(jì)（即資料庫）基礎(chǔ)上，采是在大量核酸、多肽信息累計(jì)（即資料庫）基礎(chǔ)上，采用微板作為分子載體，制作集成用微板作為分子載體，制作集成“芯片芯片”，以自動化操，以

19、自動化操作系統(tǒng)進(jìn)行分子雜交的試驗(yàn)過程。作系統(tǒng)進(jìn)行分子雜交的試驗(yàn)過程。 因?yàn)榭旖?、靈敏、信息量大，適合大規(guī)模操作，故因?yàn)榭旖?、靈敏、信息量大，適合大規(guī)模操作，故稱稱“高通量高通量”。 高通量檢測技術(shù)適合高通量檢測技術(shù)適合“組學(xué)組學(xué)”（omics）研究，更）研究，更適合生命活動過程相關(guān)的基因表達(dá)譜分析。適合生命活動過程相關(guān)的基因表達(dá)譜分析。目目 錄錄1. 1. 基因芯片已成為基因表達(dá)譜分析的常用方法基因芯片已成為基因表達(dá)譜分析的常用方法 基因芯片（基因芯片（gene chip）又稱）又稱DNA微陣列微陣列(DNA microarray)、DNA芯片（芯片（DNA chip）, 是將大量已知序列的核

20、酸片段（包括是將大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、寡核苷酸、cDNA、基因組、基因組DNA、microRNA等等) 集成在同一基集成在同一基片上，組成密集分子排列，通過與標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，檢測、片上，組成密集分子排列，通過與標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，檢測、獲取細(xì)胞或組織的基因信息。獲取細(xì)胞或組織的基因信息。 其中其中基因表達(dá)譜（基因表達(dá)譜（expression prifile）分析）分析是目前基因芯片是目前基因芯片應(yīng)用最多的一個(gè)方面，主要采用應(yīng)用最多的一個(gè)方面，主要采用cDNA芯片，基因表達(dá)譜芯片芯片，基因表達(dá)譜芯片便于對不同狀態(tài)（如生理和病理?xiàng)l件）下的基因表達(dá)譜進(jìn)行比便于對不同狀態(tài)（如生理和病理

21、條件）下的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，揭示較，揭示轉(zhuǎn)錄組（轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）差異表達(dá)的規(guī)律，對探索發(fā)差異表達(dá)的規(guī)律，對探索發(fā)病機(jī)制、評價(jià)治療效果、篩選藥物靶標(biāo)具有重要意義。病機(jī)制、評價(jià)治療效果、篩選藥物靶標(biāo)具有重要意義。（一）基因芯片和高通量測序技術(shù)可在基因（一）基因芯片和高通量測序技術(shù)可在基因水平高通量地分析基因表達(dá)水平高通量地分析基因表達(dá)目目 錄錄2. 2. 高通量測序技術(shù)是新一代基因表達(dá)譜高通量測序技術(shù)是新一代基因表達(dá)譜分析方法分析方法 高通量測序技術(shù)可以一次對幾十萬到幾百萬個(gè)高通量測序技術(shù)可以一次對幾十萬到幾百萬個(gè)DNA分子片段進(jìn)行序列測定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或分子片段進(jìn)行序

22、列測定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或基因組的全貌基因組的全貌, 又被稱為又被稱為深度測序深度測序(deep sequencing)。目目 錄錄 在在DNA水平上，可以大規(guī)模地分析基因組甲基化、篩選突變基水平上，可以大規(guī)模地分析基因組甲基化、篩選突變基因、檢測基因多態(tài)性；因、檢測基因多態(tài)性； 在在RNA水平上，可以對水平上，可以對RNA片段進(jìn)行掃描、定量與鑒定，對全片段進(jìn)行掃描、定量與鑒定，對全基因組進(jìn)行廣譜表達(dá)研究?；蚪M進(jìn)行廣譜表達(dá)研究。 1）目前，高通量測序技術(shù)不僅僅在）目前，高通量測序技術(shù)不僅僅在DNA測序中起到重測序中起到重要的作用，并且已經(jīng)應(yīng)用于基因組分析的各個(gè)方面：要的作用，并且已經(jīng)應(yīng)用于

23、基因組分析的各個(gè)方面：2）高通量測序另一個(gè)被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子）高通量測序另一個(gè)被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易地解決芯研究。測序方法能輕易地解決芯片技術(shù)在檢測小分子時(shí)遇到的技術(shù)難題片技術(shù)在檢測小分子時(shí)遇到的技術(shù)難題(短序列短序列, 高度同高度同源源), 而且小分子而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的的短序列正好配合了高通量測序的長度長度,同時(shí)測序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子同時(shí)測序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。目目 錄錄基因芯片的缺點(diǎn)基因芯片的缺點(diǎn): : 在于它是一個(gè)在于它是一個(gè)“封閉系統(tǒng)封閉系統(tǒng)”, , 它只能檢

24、測人們已知它只能檢測人們已知序列的特征序列的特征( (或有限的變異或有限的變異) )。高通量測序的優(yōu)勢高通量測序的優(yōu)勢: : 在于它是一個(gè)在于它是一個(gè)“開放系統(tǒng)開放系統(tǒng)”, , 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。新信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。目目 錄錄（二）蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳可在蛋白質(zhì)水平（二）蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳可在蛋白質(zhì)水平高通量地分析基因表達(dá)高通量地分析基因表達(dá) 蛋白質(zhì)芯片（蛋白質(zhì)芯片（protein chip）是一種對蛋白質(zhì)的表達(dá)和是一種對蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能進(jìn)行高通量分析的技術(shù)。功能進(jìn)行高通量分析的技術(shù)。 是將具有高度親和特異性的探針分子（如單

25、克隆抗體）是將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用以識別復(fù)雜生物樣品溶液中的目標(biāo)多肽；固定在基片上，用以識別復(fù)雜生物樣品溶液中的目標(biāo)多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)功能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/DNA-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/RNA-蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、小分子與藥物、酶與底物、小分子-蛋白質(zhì)等的相互作用。蛋白質(zhì)等的相互作用。1 1蛋白質(zhì)芯片有多種形式和用途蛋白質(zhì)芯片有多種形式和用途目目 錄錄蛋白質(zhì)檢測芯片包括蛋白質(zhì)檢測芯片包括: :1. 1. 抗體芯片抗體芯片2. 2. 抗原

26、芯片抗原芯片3. 3. 配體芯片配體芯片4. 4. 碳水化合物芯片等碳水化合物芯片等根據(jù)蛋白質(zhì)芯片制作方法和用途不同，可將其分為根據(jù)蛋白質(zhì)芯片制作方法和用途不同，可將其分為1. 1. 蛋白質(zhì)檢測芯片蛋白質(zhì)檢測芯片2. 2. 蛋白質(zhì)功能芯片兩大類蛋白質(zhì)功能芯片兩大類目目 錄錄 目前比較和鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)譜更多采用雙向聚丙烯酰目前比較和鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)譜更多采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)胺凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)又稱又稱二維電泳（二維電泳（two-dimensional electrophoresis, 簡稱簡稱2-D電泳）。電泳）。 原理原

27、理: 根據(jù)蛋白質(zhì)分子的兩個(gè)屬性根據(jù)蛋白質(zhì)分子的兩個(gè)屬性等電點(diǎn)和分子等電點(diǎn)和分子質(zhì)量質(zhì)量將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離。電泳結(jié)果經(jīng)染色后，將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離。電泳結(jié)果經(jīng)染色后，即可對不同樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)譜進(jìn)行比較；還可從凝膠即可對不同樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)譜進(jìn)行比較；還可從凝膠中將特定的蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，經(jīng)胰蛋白酶消化后得到短肽片中將特定的蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，經(jīng)胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用段，利用質(zhì)譜（質(zhì)譜（mass spectrum）技術(shù)進(jìn)行定性分析，對差）技術(shù)進(jìn)行定性分析，對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。 可同時(shí)分離數(shù)成百上千的蛋白質(zhì)?？赏瑫r(shí)分離數(shù)成百上千的蛋白質(zhì)。2 2雙向電泳結(jié)合

28、質(zhì)譜普遍用于蛋白質(zhì)表達(dá)雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜普遍用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜的分析和鑒定譜的分析和鑒定目目 錄錄第二節(jié)第二節(jié) 生物信息學(xué)在預(yù)測基因生物信息學(xué)在預(yù)測基因功能中的應(yīng)用功能中的應(yīng)用 Bioinformatics Application in Predicting Gene Function目目 錄錄一、利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因功能一、利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因功能注釋注釋(一）通過序列比對預(yù)測基因功能一）通過序列比對預(yù)測基因功能 序列比對是生物信息學(xué)最基本的分析技術(shù)之一，最常序列比對是生物信息學(xué)最基本的分析技術(shù)之一，最常用的方法是將目的用的方法是將目的DNA或蛋白質(zhì)序列與已知的或蛋白質(zhì)序列與已知的D

29、NA和蛋白和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，搜索到與目的序列高度同源的功質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，搜索到與目的序列高度同源的功能已知的基因或蛋白質(zhì)，用這些基因和蛋白質(zhì)預(yù)測目的基能已知的基因或蛋白質(zhì)，用這些基因和蛋白質(zhì)預(yù)測目的基因和蛋白質(zhì)的功能。局部比對搜索工具因和蛋白質(zhì)的功能。局部比對搜索工具BLAST是進(jìn)行序列是進(jìn)行序列比對的基本工具，它允許用戶選擇一條查詢序列與一個(gè)數(shù)比對的基本工具，它允許用戶選擇一條查詢序列與一個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，找到數(shù)據(jù)庫中與輸入的查詢序列相匹配的據(jù)庫進(jìn)行比對，找到數(shù)據(jù)庫中與輸入的查詢序列相匹配的項(xiàng)。項(xiàng)。BLAST是一個(gè)序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族，其中包括許是一個(gè)序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族

30、，其中包括許多有特定用途的程序。多有特定用途的程序。 目目 錄錄程序程序查詢序列查詢序列類型類型數(shù)據(jù)庫類型數(shù)據(jù)庫類型注注BLASTNDNADNABLASTP蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)BLASTXDNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)將待搜索的核酸序列按將待搜索的核酸序列按6個(gè)閱讀框翻譯成蛋白個(gè)閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列比對質(zhì)序列，然后與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列比對TBLASTN蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNA將數(shù)據(jù)庫中的核酸序列按將數(shù)據(jù)庫中的核酸序列按6個(gè)閱讀框翻譯成蛋個(gè)閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后與待搜索的蛋白質(zhì)序列比對白質(zhì)序列，然后與待搜索的蛋白質(zhì)序列比對TBLASTXDNADNA無論是待搜索的核酸序列還

31、是數(shù)據(jù)庫中的核無論是待搜索的核酸序列還是數(shù)據(jù)庫中的核酸序列都按酸序列都按6個(gè)閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然個(gè)閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后比對后比對BLAST序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族目目 錄錄（二）利用生物信息學(xué)方法分析基因芯片數(shù)據(jù)（二）利用生物信息學(xué)方法分析基因芯片數(shù)據(jù)最常用的方法有：最常用的方法有：差異表達(dá)分析（又稱基因表達(dá)差異分析）差異表達(dá)分析（又稱基因表達(dá)差異分析）聚類分析聚類分析差異表達(dá)分析的目的：差異表達(dá)分析的目的： 識別兩個(gè)條件下表達(dá)差異顯著的基因，即一個(gè)基因識別兩個(gè)條件下表達(dá)差異顯著的基因，即一個(gè)基因在兩個(gè)條件中的表達(dá)水平，在排除各種偏差后，其差異在兩個(gè)條件中的表

32、達(dá)水平，在排除各種偏差后，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義目目 錄錄1. 1. 倍數(shù)分析：倍數(shù)分析：計(jì)算每個(gè)基因在兩個(gè)條件下的表達(dá)比值；計(jì)算每個(gè)基因在兩個(gè)條件下的表達(dá)比值；2. 2. 統(tǒng)計(jì)分析中的統(tǒng)計(jì)分析中的t t檢驗(yàn)和方差分析：檢驗(yàn)和方差分析：通過計(jì)算表達(dá)差異的通過計(jì)算表達(dá)差異的置信度來分析差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；置信度來分析差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3. 3. 建模的方法：建模的方法：通過確定兩個(gè)條件下的模型參數(shù)是否相通過確定兩個(gè)條件下的模型參數(shù)是否相同來判斷表達(dá)差異的顯著性。同來判斷表達(dá)差異的顯著性。差異表達(dá)分析常用的分析方法有差異表達(dá)分析常用的分析方法有3類：類：目目 錄錄聚類分析所依

33、據(jù)的基本假設(shè)：聚類分析所依據(jù)的基本假設(shè)： 若組內(nèi)基因具有相似的表達(dá)模式，則它們可能具有若組內(nèi)基因具有相似的表達(dá)模式，則它們可能具有相似的功能，例如受共同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因，或者相似的功能，例如受共同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因，或者產(chǎn)物構(gòu)成同一個(gè)蛋白復(fù)合體的基因，或者參與相同調(diào)控產(chǎn)物構(gòu)成同一個(gè)蛋白復(fù)合體的基因，或者參與相同調(diào)控路徑的基因。路徑的基因。 在具體應(yīng)用中可按照相似的表達(dá)譜對基因進(jìn)行聚類，在具體應(yīng)用中可按照相似的表達(dá)譜對基因進(jìn)行聚類，從而預(yù)測組內(nèi)未知基因的功能。從而預(yù)測組內(nèi)未知基因的功能。 目前已經(jīng)有很多種聚類的方法應(yīng)用到基因芯片的研目前已經(jīng)有很多種聚類的方法應(yīng)用到基因芯片的研究當(dāng)中，如層次

34、聚類究當(dāng)中，如層次聚類(Hierarchical clustering)、K 均值聚均值聚類類(K-means clustering)、自組織映射、自組織映射(self organizing map)、PCA (principlecomponet analysis)等。等。目目 錄錄 在氨基酸序列整體同源性不明顯的情況下，對在氨基酸序列整體同源性不明顯的情況下，對蛋白質(zhì)的功能域進(jìn)行分析將對預(yù)測基因功能提供極蛋白質(zhì)的功能域進(jìn)行分析將對預(yù)測基因功能提供極其有價(jià)值的信息。目前已通過多序列比對將蛋白質(zhì)其有價(jià)值的信息。目前已通過多序列比對將蛋白質(zhì)的同源序列收集在一起，確定了大量蘊(yùn)藏于蛋白質(zhì)的同源序列收集

35、在一起，確定了大量蘊(yùn)藏于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的保守區(qū)域或序列，如結(jié)構(gòu)域（結(jié)構(gòu)中的保守區(qū)域或序列，如結(jié)構(gòu)域（domain）和）和模體（模體（motif），這些共享結(jié)構(gòu)域和保守模體通常與），這些共享結(jié)構(gòu)域和保守模體通常與特定的生物學(xué)活性相關(guān)，反映了蛋白質(zhì)分子的一些特定的生物學(xué)活性相關(guān)，反映了蛋白質(zhì)分子的一些重要功能。重要功能。 （三）通過生物信息學(xué)方法分析蛋白質(zhì)（三）通過生物信息學(xué)方法分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來預(yù)測蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)來預(yù)測蛋白質(zhì)功能目目 錄錄運(yùn)用蛋白質(zhì)序列模體搜索工具預(yù)測蛋白質(zhì)功能的方法是：運(yùn)用蛋白質(zhì)序列模體搜索工具預(yù)測蛋白質(zhì)功能的方法是：首先收集現(xiàn)有的蛋白質(zhì)家族，構(gòu)造模體數(shù)據(jù)庫；首先收集現(xiàn)有的蛋白質(zhì)家

36、族，構(gòu)造模體數(shù)據(jù)庫；而后通過搜索該數(shù)據(jù)庫確定查詢序列是否具有可能的序而后通過搜索該數(shù)據(jù)庫確定查詢序列是否具有可能的序 列模體，判斷該序列是否屬于一個(gè)已知的蛋白質(zhì)家族；列模體，判斷該序列是否屬于一個(gè)已知的蛋白質(zhì)家族；然后根據(jù)該蛋白質(zhì)家族的已知功能預(yù)測未知蛋白質(zhì)的功然后根據(jù)該蛋白質(zhì)家族的已知功能預(yù)測未知蛋白質(zhì)的功能。能。 常用的模體數(shù)據(jù)庫有常用的模體數(shù)據(jù)庫有INTERPROSCAN、PROSITE、SMART等。等。目目 錄錄基因組功能注釋常用數(shù)據(jù)庫基因組功能注釋常用數(shù)據(jù)庫目目 錄錄 現(xiàn)在人們已經(jīng)越來越清楚地認(rèn)識到，生物功能大多現(xiàn)在人們已經(jīng)越來越清楚地認(rèn)識到，生物功能大多不是只由一個(gè)或幾個(gè)基因控制

37、的，而是通過生物體內(nèi)眾不是只由一個(gè)或幾個(gè)基因控制的，而是通過生物體內(nèi)眾多的分子（如多的分子（如DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)）、蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)）共同構(gòu)成的復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)前生物學(xué)面臨的巨共同構(gòu)成的復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)前生物學(xué)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一就是，了解生物體內(nèi)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)以大挑戰(zhàn)之一就是，了解生物體內(nèi)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及它們的動態(tài)特征。要想全面系統(tǒng)地解析這些復(fù)雜的生及它們的動態(tài)特征。要想全面系統(tǒng)地解析這些復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)需要大量相關(guān)數(shù)據(jù)的積累，現(xiàn)代基因芯片、蛋白物網(wǎng)絡(luò)需要大量相關(guān)數(shù)據(jù)的積累，現(xiàn)代基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等大規(guī)模數(shù)據(jù)采集技術(shù)大大加快了這一進(jìn)程

38、。目質(zhì)芯片等大規(guī)模數(shù)據(jù)采集技術(shù)大大加快了這一進(jìn)程。目前人們已經(jīng)利用生物技術(shù)和信息技術(shù)建立了各種生物網(wǎng)前人們已經(jīng)利用生物技術(shù)和信息技術(shù)建立了各種生物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)站，可為研究者提供基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、絡(luò)數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)站，可為研究者提供基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝途徑、蛋白質(zhì)相互作用等方面的信息。代謝途徑、蛋白質(zhì)相互作用等方面的信息。二、利用生物網(wǎng)絡(luò)全面系統(tǒng)地了解二、利用生物網(wǎng)絡(luò)全面系統(tǒng)地了解基因的功能基因的功能 目目 錄錄 生物體任何細(xì)胞的遺傳信息、基因都是相同的，生物體任何細(xì)胞的遺傳信息、基因都是相同的，但同一個(gè)基因在不同組織、不同細(xì)胞中的表達(dá)卻不相但同一個(gè)基因在不同組織、不同細(xì)胞中的表達(dá)卻不相同。一

39、個(gè)基因的表達(dá)既影響其他的基因，又受其他基同。一個(gè)基因的表達(dá)既影響其他的基因，又受其他基因的影響，基因之間相互促進(jìn)、相互抑制，構(gòu)成一個(gè)因的影響，基因之間相互促進(jìn)、相互抑制，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究就是：利用生物芯片等高通量基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究就是：利用生物芯片等高通量技術(shù)所產(chǎn)生的大量基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，以及蛋白質(zhì)技術(shù)所產(chǎn)生的大量基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，以及蛋白質(zhì)- -DNADNA間的相互作用等信息，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果，用間的相互作用等信息，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果，用生物信息學(xué)方法構(gòu)建基因調(diào)控模型，對某一物種或組生物信息學(xué)方法構(gòu)建基因調(diào)控模型，對某一物種或組織的基因表達(dá)關(guān)系進(jìn)

40、行整體性研究，從而推斷基因之織的基因表達(dá)關(guān)系進(jìn)行整體性研究，從而推斷基因之間的調(diào)控關(guān)系，揭示支配基因表達(dá)和功能的基本規(guī)律。間的調(diào)控關(guān)系，揭示支配基因表達(dá)和功能的基本規(guī)律。 （一）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究基因調(diào)控（一）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究基因調(diào)控目目 錄錄常用基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫常用基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫目目 錄錄 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是生物系統(tǒng)的重要生命活動過程，機(jī)體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是生物系統(tǒng)的重要生命活動過程，機(jī)體通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中分子之間的相互識別、聯(lián)絡(luò)和相通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中分子之間的相互識別、聯(lián)絡(luò)和相互作用互作用, , 實(shí)現(xiàn)整體功能上的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。由于細(xì)胞內(nèi)各種實(shí)現(xiàn)整體功能上的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。由于細(xì)胞內(nèi)各種信號通路之間存在著緊密的聯(lián)

41、系和交叉調(diào)控信號通路之間存在著緊密的聯(lián)系和交叉調(diào)控, , 形成了非形成了非常復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)研究的目的是常復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)研究的目的是期望通過建立細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程的模型，找出參與此期望通過建立細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程的模型，找出參與此過程的各個(gè)蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，闡明其在基因過程的各個(gè)蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，闡明其在基因調(diào)控、疾病發(fā)生中的作用。調(diào)控、疾病發(fā)生中的作用。 生物信息學(xué)方法利用已知數(shù)據(jù)和生物學(xué)知識進(jìn)行生物信息學(xué)方法利用已知數(shù)據(jù)和生物學(xué)知識進(jìn)行通路推斷通路推斷, , 可以幫助闡釋信號分子作用機(jī)制可以幫助闡釋信號分子作用機(jī)制, , 輔助實(shí)驗(yàn)輔助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì),

42、, 節(jié)省大量的人力物力。有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的網(wǎng)上節(jié)省大量的人力物力。有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫資源較多數(shù)據(jù)庫資源較多 。 （二）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（二）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)目目 錄錄常用信號通路數(shù)據(jù)庫常用信號通路數(shù)據(jù)庫目目 錄錄 代謝網(wǎng)絡(luò)處于生物體的功能執(zhí)行階段，其結(jié)構(gòu)組代謝網(wǎng)絡(luò)處于生物體的功能執(zhí)行階段，其結(jié)構(gòu)組成方式反映了生物體的功能構(gòu)成。代謝網(wǎng)絡(luò)把細(xì)胞內(nèi)成方式反映了生物體的功能構(gòu)成。代謝網(wǎng)絡(luò)把細(xì)胞內(nèi)所有生化反應(yīng)表示為網(wǎng)絡(luò)形式，反映了代謝活動中所所有生化反應(yīng)表示為網(wǎng)絡(luò)形式，反映了代謝活動中所有化合物及酶之間的相互作用。有化合物及酶之間的相互作用。 通過基因組注釋信息可以識別出編碼催

43、化生物體通過基因組注釋信息可以識別出編碼催化生物體內(nèi)生化反應(yīng)的酶的基因內(nèi)生化反應(yīng)的酶的基因, ,結(jié)合相關(guān)的酶反應(yīng)數(shù)據(jù)庫就可結(jié)合相關(guān)的酶反應(yīng)數(shù)據(jù)庫就可以預(yù)測物種特異的酶基因、酶以及酶催化反應(yīng)，由此以預(yù)測物種特異的酶基因、酶以及酶催化反應(yīng)，由此產(chǎn)生了許多優(yōu)秀的代謝數(shù)據(jù)庫產(chǎn)生了許多優(yōu)秀的代謝數(shù)據(jù)庫, ,可以方便地檢索某一生可以方便地檢索某一生物代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝反應(yīng)。物代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝反應(yīng)。 （三）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究代謝途徑（三）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究代謝途徑目目 錄錄常用代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫常用代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫目目 錄錄（四）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究蛋白質(zhì)相互作用（四）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究蛋白質(zhì)相互作用 從某種程度上可以說，細(xì)

44、胞進(jìn)行的生命活動，是從某種程度上可以說，細(xì)胞進(jìn)行的生命活動，是蛋白質(zhì)在一定條件下相互作用的結(jié)果，若蛋白質(zhì)相互蛋白質(zhì)在一定條件下相互作用的結(jié)果，若蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)被破壞或穩(wěn)定性丟失，會引起細(xì)胞的功能性作用網(wǎng)絡(luò)被破壞或穩(wěn)定性丟失，會引起細(xì)胞的功能性障礙。闡明蛋白質(zhì)相互作用的完整網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有助于障礙。闡明蛋白質(zhì)相互作用的完整網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有助于從系統(tǒng)的角度加深對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識。從系統(tǒng)的角度加深對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識。 近年來各種預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用的計(jì)算方法被不近年來各種預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用的計(jì)算方法被不斷提出，將這些方法與實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合，挖掘出了蛋白斷提出，將這些方法與實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合，挖掘出了蛋白質(zhì)相

45、互作用網(wǎng)絡(luò)中更多的相互作用節(jié)點(diǎn)，目前已有多質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中更多的相互作用節(jié)點(diǎn)，目前已有多個(gè)蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫應(yīng)運(yùn)而生，可用來研究蛋個(gè)蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫應(yīng)運(yùn)而生，可用來研究蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)過程白質(zhì)相互作用的生物學(xué)過程 。目目 錄錄常用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫常用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫目目 錄錄三、復(fù)雜疾病的生物信息學(xué)研究策略三、復(fù)雜疾病的生物信息學(xué)研究策略 包括信息提取、分析和建模包括信息提取、分析和建模 癌癥、糖尿病、高血壓等復(fù)雜疾病對人類健康影響癌癥、糖尿病、高血壓等復(fù)雜疾病對人類健康影響巨大，這類疾病的發(fā)病機(jī)制一般與多種遺傳或非遺傳因巨大，這類疾病的發(fā)病機(jī)制一般與多種遺傳或非遺傳因

46、素，以及它們之間的相互作用有關(guān)，不能通過單基因、素，以及它們之間的相互作用有關(guān)，不能通過單基因、單通路、單層次的變化解釋。單通路、單層次的變化解釋。 以系統(tǒng)的觀點(diǎn)解釋復(fù)雜疾病中遺傳與環(huán)境的關(guān)系、以系統(tǒng)的觀點(diǎn)解釋復(fù)雜疾病中遺傳與環(huán)境的關(guān)系、描述復(fù)雜疾病中基因的特征、分析疾病基因型與表現(xiàn)型描述復(fù)雜疾病中基因的特征、分析疾病基因型與表現(xiàn)型之間的關(guān)系，已成為生物信息學(xué)研究復(fù)雜疾病的基本觀之間的關(guān)系，已成為生物信息學(xué)研究復(fù)雜疾病的基本觀點(diǎn)，針對復(fù)雜疾病的研究模式，也開始從傳統(tǒng)的點(diǎn)，針對復(fù)雜疾病的研究模式，也開始從傳統(tǒng)的“序列序列結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)功能功能”向向“相互作用相互作用網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)功能功能”轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)變。目目

47、錄錄疾病的基因組合及相互作用信息的提取：即對復(fù)雜疾病相關(guān)疾病的基因組合及相互作用信息的提?。杭磳?fù)雜疾病相關(guān)靶基因的識別，以及利用靶基因的識別，以及利用SNPsSNPs、基因、蛋白質(zhì)等不同類型、基因、蛋白質(zhì)等不同類型的信息，構(gòu)建疾病驅(qū)使相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)。的信息，構(gòu)建疾病驅(qū)使相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)。生物信息分析及多層次信息的融合：即從不同層次對疾病的生物信息分析及多層次信息的融合：即從不同層次對疾病的遺傳復(fù)雜性進(jìn)行分析，對不同遺傳網(wǎng)絡(luò)間的映射算法進(jìn)行研遺傳復(fù)雜性進(jìn)行分析，對不同遺傳網(wǎng)絡(luò)間的映射算法進(jìn)行研究，進(jìn)而將究，進(jìn)而將SNPsSNPs、基因、蛋白質(zhì)等不同水平的信息進(jìn)行融、基因、蛋白質(zhì)等不同水平的信息進(jìn)行融

48、合。合。分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建模：即綜合生理病理相關(guān)的基因、分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建模：即綜合生理病理相關(guān)的基因、SNPsSNPs、基因表達(dá)狀況，蛋白質(zhì)功能狀態(tài)以及臨床治療等信息，以系基因表達(dá)狀況，蛋白質(zhì)功能狀態(tài)以及臨床治療等信息，以系統(tǒng)的方法將不同的測量數(shù)據(jù)、各種因素的辨識、各個(gè)層次上統(tǒng)的方法將不同的測量數(shù)據(jù)、各種因素的辨識、各個(gè)層次上的相互作用關(guān)系進(jìn)行整合，建立數(shù)學(xué)模型，深入了解疾病過的相互作用關(guān)系進(jìn)行整合，建立數(shù)學(xué)模型，深入了解疾病過程、揭示復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制。程、揭示復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制。復(fù)雜疾病的基本研究策略復(fù)雜疾病的基本研究策略目目 錄錄第三節(jié)第三節(jié) 基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)M

49、ethods for Identifying Biological Functions of Genes目目 錄錄目前在已知的目前在已知的2.52.5萬萬3 3萬個(gè)人類基因中，大約萬個(gè)人類基因中，大約70%70%的基因我們還的基因我們還不清楚它們的功能，有不清楚它們的功能，有90%90%的基因我們不知道它們在體內(nèi)的確切的基因我們不知道它們在體內(nèi)的確切生理作用，因此，利用各種技術(shù)手段研究基因組中功能未知基生理作用，因此，利用各種技術(shù)手段研究基因組中功能未知基因的作用，將是因的作用，將是“后基因組時(shí)代后基因組時(shí)代”功能基因組學(xué)研究的主要內(nèi)功能基因組學(xué)研究的主要內(nèi)容。容。生物信息學(xué)利用已知數(shù)據(jù)和生物

50、學(xué)知識進(jìn)行合理推斷生物信息學(xué)利用已知數(shù)據(jù)和生物學(xué)知識進(jìn)行合理推斷, , 可以節(jié)省可以節(jié)省大量的人力物力，但基因功能的鑒定最終仍需要通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)大量的人力物力，但基因功能的鑒定最終仍需要通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。證。通常采用基因功能獲得和通常采用基因功能獲得和/ /或基因功能缺失的策略，觀察基因在或基因功能缺失的策略，觀察基因在細(xì)胞或生物個(gè)體中的，細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體表型遺傳性狀的細(xì)胞或生物個(gè)體中的，細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體表型遺傳性狀的變化，來鑒定基因的功能。此外，基于正向遺傳學(xué)的隨機(jī)突變變化，來鑒定基因的功能。此外，基于正向遺傳學(xué)的隨機(jī)突變篩選技術(shù)也成為揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必篩選技術(shù)也成

51、為揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必須在完整的生物個(gè)體及其生命過程中才能得到完整的體現(xiàn)，因須在完整的生物個(gè)體及其生命過程中才能得到完整的體現(xiàn)，因此從整體水平研究基因的功能是必然的選擇。此從整體水平研究基因的功能是必然的選擇。目目 錄錄基因功能獲得策略即通過將目的基因直接導(dǎo)入某一基因功能獲得策略即通過將目的基因直接導(dǎo)入某一細(xì)胞或個(gè)體中，使其獲得新的或更高水平的表達(dá)，通過細(xì)胞或個(gè)體中，使其獲得新的或更高水平的表達(dá)，通過細(xì)胞或個(gè)體生物性狀的變化來研究基因的功能。常用的細(xì)胞或個(gè)體生物性狀的變化來研究基因的功能。常用的方法有轉(zhuǎn)基因和基因敲入技術(shù)等。方法有轉(zhuǎn)基因和基因敲入技術(shù)等。一、采用功能獲得策略

52、鑒定基因的功能一、采用功能獲得策略鑒定基因的功能目目 錄錄 轉(zhuǎn)基因技術(shù)（轉(zhuǎn)基因技術(shù)（transgenic technology）是指將外源基是指將外源基因?qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞中，通過隨機(jī)重組使外源基因?qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞中，通過隨機(jī)重組使外源基因插入細(xì)胞染色體因插入細(xì)胞染色體DNA，再將受精卵或胚胎干細(xì)胞植入，再將受精卵或胚胎干細(xì)胞植入受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細(xì)胞分裂遺傳給受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細(xì)胞分裂遺傳給后代。后代。（一）用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因功能（一）用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因功能目目 錄錄 轉(zhuǎn)基因動物（轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因是指

53、應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物。技術(shù)培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物。 其基本制作過程包括：轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建，外其基本制作過程包括：轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建，外源基因的導(dǎo)入，轉(zhuǎn)基因動物的獲得和鑒定，轉(zhuǎn)基因動物源基因的導(dǎo)入，轉(zhuǎn)基因動物的獲得和鑒定，轉(zhuǎn)基因動物品系的建立以及外源基因表達(dá)的鑒定。品系的建立以及外源基因表達(dá)的鑒定。1. 1. 轉(zhuǎn)基因動物可在整體水平研究基因的功能轉(zhuǎn)基因動物可在整體水平研究基因的功能目目 錄錄轉(zhuǎn)基因動物制作原理示意圖轉(zhuǎn)基因動物制作原理示意圖目目 錄錄優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1. 利用轉(zhuǎn)基因動物模型研究外源基因，能夠接近真實(shí)地利用轉(zhuǎn)基因動物模型研究外源基

54、因，能夠接近真實(shí)地再現(xiàn)基因表達(dá)所導(dǎo)致的結(jié)果，及其在整體水平的調(diào)控再現(xiàn)基因表達(dá)所導(dǎo)致的結(jié)果，及其在整體水平的調(diào)控規(guī)律，把復(fù)雜的系統(tǒng)簡單化，具有系統(tǒng)性和獨(dú)立性，規(guī)律，把復(fù)雜的系統(tǒng)簡單化，具有系統(tǒng)性和獨(dú)立性，是目前層次最高的實(shí)驗(yàn)體系。是目前層次最高的實(shí)驗(yàn)體系。2. 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的疾病動物模型具有遺傳背景清利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的疾病動物模型具有遺傳背景清楚、遺傳物質(zhì)改變簡單、更自然更接近疾病的真實(shí)癥楚、遺傳物質(zhì)改變簡單、更自然更接近疾病的真實(shí)癥狀等優(yōu)點(diǎn)。狀等優(yōu)點(diǎn)。目目 錄錄但轉(zhuǎn)基因動物模型仍存在一些亟待解決的問題：但轉(zhuǎn)基因動物模型仍存在一些亟待解決的問題：1. 外源基因插入宿主基因組是隨機(jī)的，可能

55、產(chǎn)生插入突變，外源基因插入宿主基因組是隨機(jī)的，可能產(chǎn)生插入突變，破壞宿主基因組功能；破壞宿主基因組功能；2. 外源基因在宿主染色體上整合的拷貝數(shù)不等；外源基因在宿主染色體上整合的拷貝數(shù)不等；3. 整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物癥狀的不穩(wěn)整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物癥狀的不穩(wěn)定遺傳等。定遺傳等。 雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身仍存在一些問題，但其在醫(yī)學(xué)研雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身仍存在一些問題，但其在醫(yī)學(xué)研究中的重要地位是毋庸置疑的，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完究中的重要地位是毋庸置疑的，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，其在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域必將有更加廣泛的應(yīng)用。善，其在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域必將有更加廣泛的應(yīng)用。目

56、目 錄錄目前，科學(xué)家已經(jīng)采取了多種方法使轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加完善：目前，科學(xué)家已經(jīng)采取了多種方法使轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加完善： 為了更為精確地調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，使其獲得時(shí)空特異為了更為精確地調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，使其獲得時(shí)空特異性的調(diào)控，在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體時(shí)，性的調(diào)控，在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體時(shí)，選擇只在特定的細(xì)胞選擇只在特定的細(xì)胞類型或特定的生命時(shí)期才啟動基因表達(dá)的啟動子類型或特定的生命時(shí)期才啟動基因表達(dá)的啟動子，即可使外，即可使外源基因獲得時(shí)空特異性的表達(dá)。源基因獲得時(shí)空特異性的表達(dá)?？烧{(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)也是一種常用的方法：可調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)也是一種常用的方法： 例如四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)可使轉(zhuǎn)基因動物

57、體內(nèi)例如四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)可使轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)外源基因的表達(dá)受誘導(dǎo)劑（四環(huán)素）的調(diào)控，通過加入或去外源基因的表達(dá)受誘導(dǎo)劑（四環(huán)素）的調(diào)控，通過加入或去除誘導(dǎo)劑，就可以實(shí)現(xiàn)對外源基因表達(dá)時(shí)間及水平的控制。除誘導(dǎo)劑，就可以實(shí)現(xiàn)對外源基因表達(dá)時(shí)間及水平的控制。2. 2. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不斷完善轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不斷完善目目 錄錄當(dāng)前轉(zhuǎn)基因動物所涉及的轉(zhuǎn)基因片段長度大多在幾十個(gè)當(dāng)前轉(zhuǎn)基因動物所涉及的轉(zhuǎn)基因片段長度大多在幾十個(gè)kbkb以下，但是，隨著科學(xué)研究需要進(jìn)行以下，但是，隨著科學(xué)研究需要進(jìn)行大片段大片段DNADNA、多、多基因或基因簇的轉(zhuǎn)基因基因或基因簇的轉(zhuǎn)基因?？寺〈笃慰寺〈笃蜠NADNA常應(yīng)

58、用酵母人工染色體常應(yīng)用酵母人工染色體(YAC)(YAC)、細(xì)菌人、細(xì)菌人工染色體工染色體(BAC)(BAC)等，可獲得等，可獲得200kb200kb以上的大以上的大DNADNA片段，能片段，能攜帶包含完整的基因或多個(gè)基因，以及基因的所有外顯攜帶包含完整的基因或多個(gè)基因，以及基因的所有外顯子，和附近的染色體調(diào)控區(qū)，為目的基因提供與其在正子，和附近的染色體調(diào)控區(qū)，為目的基因提供與其在正常染色體上一致的環(huán)境，保證了轉(zhuǎn)基因在正常細(xì)胞中的常染色體上一致的環(huán)境，保證了轉(zhuǎn)基因在正常細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)。時(shí)空表達(dá)。目目 錄錄（二）基因敲入可以實(shí)現(xiàn)基因的定向插入（二）基因敲入可以實(shí)現(xiàn)基因的定向插入 基因敲入基因敲入

59、( gene knock-in)是通過同源重組的方法，是通過同源重組的方法，用某一基因替換另一基因用某一基因替換另一基因, 或?qū)⒁粋€(gè)設(shè)計(jì)好的基因片段插或?qū)⒁粋€(gè)設(shè)計(jì)好的基因片段插入到基因組的特定位點(diǎn)，使之表達(dá)并發(fā)揮作用。通過基入到基因組的特定位點(diǎn)，使之表達(dá)并發(fā)揮作用。通過基因敲入，可以研究特定基因在體內(nèi)的功能；也可以與之因敲入，可以研究特定基因在體內(nèi)的功能；也可以與之前基因的功能進(jìn)行比較；或?qū)⒄；蛞牖蚪M中置前基因的功能進(jìn)行比較；或?qū)⒄；蛞牖蚪M中置換突變基因以達(dá)到靶向基因治療的目的。換突變基因以達(dá)到靶向基因治療的目的。目目 錄錄基因敲入是基因打靶技術(shù)的一種，基因打靶技術(shù)是基因敲入是

60、基因打靶技術(shù)的一種，基因打靶技術(shù)是2020世紀(jì)世紀(jì)8080年代后半期發(fā)展起來的，一種按預(yù)期方式年代后半期發(fā)展起來的，一種按預(yù)期方式準(zhǔn)確改造生物遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。準(zhǔn)確改造生物遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。該技術(shù)的巧妙之處在于把胚胎干細(xì)胞技術(shù)和該技術(shù)的巧妙之處在于把胚胎干細(xì)胞技術(shù)和DNADNA同同源重組技術(shù)源重組技術(shù)“結(jié)合結(jié)合”起來，實(shí)現(xiàn)對染色體上某一基起來，實(shí)現(xiàn)對染色體上某一基因的定向修飾和改造，從而深入地了解基因的功能。因的定向修飾和改造，從而深入地了解基因的功能。除基因敲入外，基因打靶還包括基因敲除、點(diǎn)突變、除基因敲入外，基因打靶還包括基因敲除、點(diǎn)突變、缺失突變、染色體組大片段刪除等。缺失突變、染色