質(zhì)粒酶切鑒定課件

1、1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，并解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，并理解限制性內(nèi)切酶是理解限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)的重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定定DNA片段的有效方法。片段的有效方法。 2. 相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí) 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類(lèi)能識(shí)別雙限制性核酸內(nèi)切酶：是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈鏈DNA分子特異性核酸序列的分子特異性核酸序列的DNA水水解酶。是體外剪切基因片段的重要工解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶具，所以常常與

2、核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱(chēng)為工具酶。以及末端修飾酶等一起稱(chēng)為工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶不僅是限制性核酸內(nèi)切酶不僅是DNA重組中重組中重要的工具，而且還可以用于基因組重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定。酶切圖譜的鑒定。1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象2) 核酸限制性內(nèi)切酶的類(lèi)型核酸限制性內(nèi)切酶的類(lèi)型3) 核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5) 核酸限制性內(nèi)切酶的命名法核酸限制性內(nèi)切酶的命名法6) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制

3、與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。 各各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙雙鏈的核酸內(nèi)切酶，鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來(lái)限制外源它們以此來(lái)限制外源DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞自這種酶的細(xì)胞自身的身的DNA不受影響，因?yàn)檫@種細(xì)胞還合成了不受影響，因?yàn)檫@種細(xì)胞還合成了一種修飾酶，對(duì)自身的一種修飾酶，對(duì)自身的DNA進(jìn)行了修飾，限進(jìn)行了修飾，限制性酶對(duì)修飾過(guò)的制性酶對(duì)修飾過(guò)的DNA不能起作用。不能起作用。這種現(xiàn)這種現(xiàn)象被稱(chēng)為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。象被稱(chēng)為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象

4、。2)限制性核酸內(nèi)切酶的類(lèi)型及特性限制性核酸內(nèi)切酶的類(lèi)型及特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及以及切切斷核酸的情況不同，分為三類(lèi)：斷核酸的情況不同，分為三類(lèi)： 型型 型型* 型型第一類(lèi)（第一類(lèi)（I I型）限制性內(nèi)切酶型）限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專(zhuān)一能識(shí)別專(zhuān)一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割核苷酸上切割DNADNA分子中的雙鏈，但是切分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒(méi)有專(zhuān)一性，是隨機(jī)的。割的核苷酸順序沒(méi)有專(zhuān)一性，是隨機(jī)的。這類(lèi)限制性內(nèi)切酶在這類(lèi)限制性內(nèi)切酶在DNADNA重組技術(shù)或基因重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無(wú)法

5、用于分析工程中用處不大，無(wú)法用于分析DNADNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類(lèi)酶如或克隆基因。這類(lèi)酶如EcoBEcoB、EcoKEcoK等。等。 第二類(lèi)第二類(lèi)(II(II型型) )限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專(zhuān)一的核能識(shí)別專(zhuān)一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類(lèi)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割雙鏈。由于這類(lèi)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專(zhuān)一的。因此，這種限制性內(nèi)的核苷酸都是專(zhuān)一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是切酶是DNADNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別的專(zhuān)一核苷酸順序最常見(jiàn)的是這種酶識(shí)別的專(zhuān)一核苷酸順序

6、最常見(jiàn)的是4 4個(gè)或個(gè)或6 6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5 5個(gè)核苷酸以個(gè)核苷酸以及及7 7個(gè)、個(gè)、8 8個(gè)、個(gè)、9 9個(gè)、個(gè)、1010個(gè)和個(gè)和1111個(gè)核苷酸的。個(gè)核苷酸的。 II II 型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱(chēng)順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱(chēng)軸，從這個(gè)軸對(duì)稱(chēng)順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱(chēng)軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向朝二個(gè)方向“讀讀”都完全相同。這種酶的切都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：割可以有兩種方式：粘性末端；是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，粘性末端；是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，這種末端的

7、核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱(chēng)為粘性末端。所以稱(chēng)為粘性末端。如如EcoRIEcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋旱淖R(shí)別順序?yàn)椋?5 5 GAA|TT_C GAA|TT_C 33 3 3 C_TT|AAG C_TT|AAG 5 5垂直線表示中心對(duì)稱(chēng)軸，從兩側(cè)垂直線表示中心對(duì)稱(chēng)軸，從兩側(cè)“讀讀”核苷酸順序都是核苷酸順序都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，這就是回文順序（，這就是回文順序（palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成55G G和和AATTCAATTC33、33CTTAACTTAA

8、和和G G55二個(gè)二個(gè)DNADNA片段，各片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò)鍵以及氫鍵可通過(guò)DNADNA連接酶的作用而連接酶的作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一種是在同一位置型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV EcoRV 的識(shí)別位置是：的識(shí)別位置是： 55 GAT|ATC GAT|ATC 3 333 CTA|TAG CTA|TAG 5 5 切割后形成切割后形成55 GAT GAT和和ATC ATC 3 3、 33 CTA CT

9、A和和TAG TAG 5 5。這種末端。這種末端同樣可以通過(guò)同樣可以通過(guò)DNADNA連接酶連接起來(lái)。連接酶連接起來(lái)。平頭末端：平頭末端：第三類(lèi)（第三類(lèi)（ IIIIII型）限制性內(nèi)切酶型）限制性內(nèi)切酶也有專(zhuān)一也有專(zhuān)一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱(chēng)的回文順序的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱(chēng)的回文順序, ,在識(shí)在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度定長(zhǎng)度DNADNA片段，具有各種單鏈末端。因此片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用

10、于基因克隆。不能應(yīng)用于基因克隆。同裂酶：同裂酶：有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同，其差別只在于當(dāng)序和切割位置都相同，其差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如例如HpaHpa和和MspMsp的識(shí)別順序都是的識(shí)別順序都是55GCG_GGCG_G33，如果其中有，如果其中有5-5-甲基胞嘧啶，則只有甲基胞嘧啶，則只有HpaHpa能夠切能夠切割。這些有相同切點(diǎn)的酶稱(chēng)為割。這些有相同切點(diǎn)的酶稱(chēng)為同裂酶同裂酶（同切酶或異源同工酶）（同切

11、酶或異源同工酶）。 3） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有時(shí)兩種酶切割序列不完全相同，但卻能有時(shí)兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類(lèi)酶被稱(chēng)為產(chǎn)生相同的粘性末端，這類(lèi)酶被稱(chēng)為同尾同尾酶酶，可以通過(guò)，可以通過(guò)DNADNA連接酶將這類(lèi)末端連接連接酶將這類(lèi)末端連接起來(lái)，但原來(lái)的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)起來(lái)，但原來(lái)的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。如可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。如Xba1Xba1、Nhe1Nhe1、Spe1Spe1以及以及StylStyl切割的切割的DNADNA序列不同，序列不同，但均給出相同的但均給出相同的“CTAG”CTAG”粘性末端。這些粘性末

12、端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個(gè)新的但卻產(chǎn)生了一個(gè)新的4 4核苷酸的酶切位點(diǎn)，核苷酸的酶切位點(diǎn)，即即 Bfa1Bfa1的酶切位點(diǎn)。的酶切位點(diǎn)。同尾酶：同尾酶：4) 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法限制性核酸內(nèi)切酶的命名法v 用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母表示寄主菌的物種名稱(chēng)，如表示寄主菌的物種名稱(chēng)，如E. coli 用用Eco表表示，所以用斜體字。示，所以用斜體字。v 用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血菌用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用菌株用d，即，即Hind。v 如果一種特殊的寄

13、主菌株，具有幾個(gè)不同如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如Hind, Hind，Hind等。等。5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素(1) DNA的純度；的純度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反應(yīng)的溫度；酶切消化反應(yīng)的溫度；(4) DNA的分子結(jié)構(gòu)；的分子結(jié)構(gòu)；(5) 溶液中離子濃度及種類(lèi)；溶液中離子濃度及種類(lèi)；(6) 緩沖液的緩沖液的 pH值。值。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔

14、隙的固體基質(zhì)的特性，其能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)的作用下密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)的作用下及中性及中性pH的緩沖條件下帶負(fù)電的核酸分子就的緩沖條件下帶負(fù)電的核酸分子就可以向陽(yáng)極遷移。可以向陽(yáng)極遷移。影響影響DNA在瓊脂糖中遷移率的因素：在瓊脂糖中遷移率的因素：DNA分分子的大小、子的大小、DNA的構(gòu)象、電壓、電場(chǎng)方向、的構(gòu)象、電壓、電場(chǎng)方向、堿基組成、嵌入的燃料以及電泳緩沖液的組堿基組成、嵌入的燃料以及電泳緩沖液的組成。成。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的的遷移率，因此采用不同濃度的

15、凝膠可以分離不同大小范圍的凝膠可以分離不同大小范圍的DNA片片段。段。0.8%的瓊脂糖凝膠能很好地分辨的瓊脂糖凝膠能很好地分辨1-25kb的片段；的片段；0.5% 的瓊脂糖凝膠用的瓊脂糖凝膠用于分辨較大片段的于分辨較大片段的DNA (20-100kb）；）；對(duì)于小片段的對(duì)于小片段的DNA(0.2-2kb) 可用可用1.5%或更高濃度的凝膠進(jìn)行分離。不或更高濃度的凝膠進(jìn)行分離。不過(guò)，以上這些并不是絕對(duì)的，因?yàn)橛羞^(guò)，以上這些并不是絕對(duì)的，因?yàn)橛袝r(shí)我們需要同時(shí)分離多種分子量相差時(shí)我們需要同時(shí)分離多種分子量相差較大的片段，因此所用瓊脂糖凝膠的較大的片段，因此所用瓊脂糖凝膠的濃度要視情況而定。濃度要視情

16、況而定。EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲錠苯基菲錠溴鹽溴鹽, (Ethidium Bromide), (Ethidium Bromide)。它能夠插它能夠插入入DNADNA分子中的堿基對(duì)之間而與分子中的堿基對(duì)之間而與DNADNA結(jié)合。結(jié)合。由于由于EBEB分子分子的插入，在紫外光的照射下，的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的凝膠電泳中的DNADNA條帶呈現(xiàn)出條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，紅色熒光，易于檢測(cè)。可以檢測(cè)易于檢測(cè)?？梢詸z測(cè)1010ng ng 的的DNADNA。注意：注意：EBEB是一種誘變劑，操作時(shí)一是一種誘變劑，操作時(shí)一定要注意安全操作，必須戴

17、塑料或定要注意安全操作，必須戴塑料或乳膠手套乳膠手套。3. 3. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器實(shí)驗(yàn)材料與儀器 質(zhì)粒質(zhì)粒 pCMV-Myc-T10pCMV-Myc-T10 NEB NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)EcoR1 EcoR1 和和 Xho1 Xho1 核酸內(nèi)切酶（核酸內(nèi)切酶（TakaraTakara）EcoR 1和 Xho 1酶解緩沖液酶解緩沖液(10(10H buffer)H buffer) 瓊脂糖瓊脂糖 TBETBE或或TAETAE緩沖液緩沖液(10(10) ) 溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml)

18、上樣液上樣液(6(6) )：0.25% 0.25% 溴酚蘭，溴酚蘭，4040(W/V)(W/V)蔗蔗糖糖 水溶液或水溶液或3030的甘油。的甘油。InsertEcoR1Xho11.9kb質(zhì)粒質(zhì)粒1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder不能對(duì)不能對(duì)DNADNA質(zhì)量進(jìn)行精確定量分析，質(zhì)量進(jìn)行精確定量分析，但可以通過(guò)與相近的條帶但可以通過(guò)與相近的條帶進(jìn)行比較估算出大概的數(shù)進(jìn)行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。每條帶大概的量如下?lián)?。每條帶大概的量如下（按（按0.5g0.5g上樣量計(jì)。應(yīng)上樣量計(jì)。應(yīng)按按1212條帶計(jì)算，因?yàn)闂l帶計(jì)算，因?yàn)?kb3kb的的量是其它片段量的近三量是其它片段量的近三倍

19、）：倍）： 片段堿基對(duì)質(zhì)量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*EcoR I 酶切位點(diǎn)：酶切位點(diǎn)：GAATT_CXho I 酶切位點(diǎn)：酶切位點(diǎn)：CTCGA_G1010H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5)H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl 100mM MgCl2 2 10mM Dithiothreitol 10m

20、M Dithiothreitol 1000mM NaCl 1000mM NaCl酶活性的定義：酶活性的定義：一個(gè)活性單位（一個(gè)活性單位（U)U)，是指在，是指在5050 l l反應(yīng)體系反應(yīng)體系中，中，3737o oC C的條件下，經(jīng)過(guò)的條件下，經(jīng)過(guò)1 1小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，將將1 1 g g DNA DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因?yàn)椴煌拿杆蟮淖钸m反應(yīng)條件不同，因?yàn)椴煌拿杆蟮淖钸m反應(yīng)條件不同，所以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。所以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。一般按照銷(xiāo)售酶的公司所提供的相應(yīng)緩沖一般按照銷(xiāo)售酶的公司所提供的相應(yīng)緩沖液。雙酶切或多

21、酶切時(shí)要考慮相容性緩沖液。雙酶切或多酶切時(shí)要考慮相容性緩沖液?jiǎn)栴}，一般公司會(huì)給用戶提供這方面的液?jiǎn)栴}，一般公司會(huì)給用戶提供這方面的信息。信息。電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等凝膠成像儀，一次性塑料手套等4. 實(shí)驗(yàn)方法和步驟實(shí)驗(yàn)方法和步驟 ll（ll） （ll）ll（ll* * 緩沖液隨不同的酶而不同緩沖液隨不同的酶而不同, ,本實(shí)驗(yàn)用本實(shí)驗(yàn)用 H bufferH buffer。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小時(shí)。酶解完成后，分小時(shí)。酶解完成后，分別加入別加入1010 l l 3 3倍的上樣緩沖液倍的上樣緩沖液, , 然后

22、各取然后各取1515 l l進(jìn)進(jìn)行電泳分析。行電泳分析。1) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的酶解（自提質(zhì)粒的酶解（自提質(zhì)粒pCMV-Myc-T10）2) 瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠液的制備：稱(chēng)取瓊脂糖凝膠液的制備：稱(chēng)取0.8g瓊脂糖，瓊脂糖，置于三角瓶中，加入置于三角瓶中，加入100ml TBE或或TAE工作液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯等，將該工作液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。3）膠板的制備）膠板的制備取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠條條(寬約寬約1cm)，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一

23、水平位置模具上，放好梳子。水平位置模具上，放好梳子。 將冷卻至將冷卻至65左右的瓊脂糖凝膠液，小左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速心地倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開(kāi)，直到在整度和量，使膠液緩慢地展開(kāi)，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開(kāi)的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻開(kāi)的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在含有璃內(nèi)槽放在含有0.5-1TAE（Tris-乙酸）乙酸） 或或T

24、BE（Tris-硼酸）工作液的電泳槽中硼酸）工作液的電泳槽中使用。使用。4）加樣）加樣用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個(gè)樣品，換一個(gè)的樣品孔內(nèi)。每加完一個(gè)樣品，換一個(gè)加樣頭。加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周?chē)訕宇^。加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周?chē)哪z面以及穿透凝膠底部，本實(shí)驗(yàn)樣的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實(shí)驗(yàn)樣品孔容量約品孔容量約1520 l。1 kb DNA ladder（共（共10條帶）條帶）: 在第一在第一個(gè)上樣孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)加入個(gè)上樣孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)加入6 l 的的 1 kb DNA ladder（50ng/ l ）。）。5）電泳（帶上手套操作）電泳（帶上手套操作） 加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳；加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳； 建議在建議在80100V的電壓下電泳；的電壓下電泳； 當(dāng)溴酚蘭移動(dòng)到距離膠板下沿約當(dāng)溴酚蘭移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處處停止電泳；停止電泳； 將凝膠放入將凝膠放入溴化乙啶（溴化乙啶（EB工作液工作液（0.5 g/ml左右）中染色約左右）中染色約20min。為了獲得電泳分離為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于率