細(xì)胞生物學(xué)熒光染色實驗

1、單成彬制作單成彬制作五、熒光的細(xì)胞化學(xué)測定五、熒光的細(xì)胞化學(xué)測定 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)熒光顯微鏡的使用，了解熒光學(xué)習(xí)熒光顯微鏡的使用，了解熒光顯微技術(shù)原理和方法，以及熒光技術(shù)在顯微技術(shù)原理和方法，以及熒光技術(shù)在細(xì)胞化學(xué)方面的應(yīng)用。細(xì)胞化學(xué)方面的應(yīng)用。 二、實驗原理二、實驗原理 熒光顯微技術(shù)是利用短波光照射被射物質(zhì)，以激發(fā)其發(fā)射熒光熒光顯微技術(shù)是利用短波光照射被射物質(zhì)，以激發(fā)其發(fā)射熒光而在熒光顯微鏡下可以檢視的方法。而在熒光顯微鏡下可以檢視的方法。 熒光又可分為：自發(fā)熒光和次生熒光。自發(fā)熒光是指有些生物熒光又可分為：自發(fā)熒光和次生熒光。自發(fā)熒光是指有些生物體受到短波光照射后，直接發(fā)出的

2、熒光。如經(jīng)紫外光照射后，葉綠體受到短波光照射后，直接發(fā)出的熒光。如經(jīng)紫外光照射后，葉綠體發(fā)出的紅色熒光；木質(zhì)素發(fā)出的黃色熒光等。次生熒光是指有些體發(fā)出的紅色熒光；木質(zhì)素發(fā)出的黃色熒光等。次生熒光是指有些生物材料受到短波光照射后并不發(fā)光，但當(dāng)它吸附熒光染料后，也生物材料受到短波光照射后并不發(fā)光，但當(dāng)它吸附熒光染料后，也同樣產(chǎn)生熒光，這種熒光也稱間接熒光。同樣產(chǎn)生熒光，這種熒光也稱間接熒光。 作為熒光的激發(fā)光源可分別采用紫外，紫、藍(lán)、綠等作為熒光的激發(fā)光源可分別采用紫外，紫、藍(lán)、綠等波段的光；而獲得的熒光為紫、藍(lán)、綠、黃、橙、紅等波波段的光；而獲得的熒光為紫、藍(lán)、綠、黃、橙、紅等波段的光。不同生理

3、活性的細(xì)胞，發(fā)射熒光段的光。不同生理活性的細(xì)胞，發(fā)射熒光(或次生熒光或次生熒光)的的能力有很大差別，不同組份對熒光染料反應(yīng)產(chǎn)生的熒光顏能力有很大差別，不同組份對熒光染料反應(yīng)產(chǎn)生的熒光顏色也不同，所以利用這一特性，通過熒光顯微鏡可以測定色也不同，所以利用這一特性，通過熒光顯微鏡可以測定某些組分的含量。以及細(xì)胞的生理活性。某些組分的含量。以及細(xì)胞的生理活性。 三、實驗用品三、實驗用品 (一一)材料：洋蔥材料：洋蔥 (二二)用品：熒光顯微鏡，載玻片，鑷子，燒杯等。用品：熒光顯微鏡，載玻片，鑷子，燒杯等。 (三三)試劑：試劑： (1) O.01 吖啶橙生理鹽水溶液吖啶橙生理鹽水溶液 (2) O.02

4、異硫氰酯熒光素生理鹽水溶液異硫氰酯熒光素生理鹽水溶液 (3) O.Ol 羅丹明生理鹽水溶液羅丹明生理鹽水溶液 (4) 熒光增白劑溶液，將熒光增白劑溶于熒光增白劑溶液，將熒光增白劑溶于0.4M山梨醇液中，使山梨醇液中，使 濃度達(dá)到濃度達(dá)到0.1。四、實驗方法四、實驗方法 (一一)利用熒光增白劑觀察植物細(xì)胞壁利用熒光增白劑觀察植物細(xì)胞壁 植物細(xì)胞壁有強烈的吸附染料的能力，因此很植物細(xì)胞壁有強烈的吸附染料的能力，因此很多熒光染料都能著染細(xì)胞壁，但近年來最常用的還多熒光染料都能著染細(xì)胞壁，但近年來最常用的還是熒光增白劑，以此來鑒別細(xì)胞壁的狀況，并常用是熒光增白劑，以此來鑒別細(xì)胞壁的狀況，并常用于檢查原

5、生質(zhì)體細(xì)胞壁是否分解完全，以及原生質(zhì)于檢查原生質(zhì)體細(xì)胞壁是否分解完全，以及原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁的鑒別。體再生細(xì)胞壁的鑒別。 1取洋蔥表皮細(xì)胞取洋蔥表皮細(xì)胞(1cm2)置于載玻片，以置于載玻片，以熒光增白劑染色熒光增白劑染色5分鐘，加蓋玻片，熒光顯微分鐘，加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察其細(xì)胞壁。鏡下觀察其細(xì)胞壁。 2取以酶液游離出來的原生質(zhì)體懸液取以酶液游離出來的原生質(zhì)體懸液l滴于滴于載玻片上，加熒光增白劑一滴，染色載玻片上，加熒光增白劑一滴，染色 5分鐘，加分鐘，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察原生質(zhì)體脫壁是否完蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察原生質(zhì)體脫壁是否完全，藍(lán)紫光激發(fā)觀察。全，藍(lán)紫光激發(fā)觀察。 (二二

6、) DNA分布的觀察分布的觀察 取洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞取洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞(1cm2)置于載玻片，以置于載玻片，以0.0l吖啶橙吖啶橙染色染色5分鐘，生理鹽水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下分鐘，生理鹽水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下藍(lán)光激發(fā)觀察。藍(lán)光激發(fā)觀察。 （三（三) 蛋白質(zhì)分布的觀察蛋白質(zhì)分布的觀察 取洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞取洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞(1cm2)置于載玻片，以置于載玻片，以0.02異硫氰酯熒光素染色異硫氰酯熒光素染色510分鐘，生理鹽分鐘，生理鹽水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下藍(lán)光激水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下藍(lán)光激發(fā)觀察。發(fā)觀察。（四（四) 線粒體觀察線粒體觀察 取洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞取洋蔥

7、內(nèi)表皮細(xì)胞 (1cm2)置于載玻片，以置于載玻片，以0.0l羅丹明染色羅丹明染色5分鐘生理鹽水沖洗一次，加蓋分鐘生理鹽水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下綠光激發(fā)觀察。玻片，熒光顯微鏡下綠光激發(fā)觀察。 五、作業(yè)五、作業(yè) 分別描述分別描述DNA，蛋白質(zhì)及線粒體在細(xì)胞內(nèi)的，蛋白質(zhì)及線粒體在細(xì)胞內(nèi)的分布與顏色。分布與顏色。實驗六實驗六 細(xì)胞活力的測定細(xì)胞活力的測定 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)熒光顯微鏡的使用，了解熒光學(xué)習(xí)熒光顯微鏡的使用，了解熒光顯微技術(shù)原理和方法，以及熒光技術(shù)在顯微技術(shù)原理和方法，以及熒光技術(shù)在細(xì)胞化學(xué)方面的應(yīng)用。細(xì)胞化學(xué)方面的應(yīng)用。 二、實驗原理二、實驗原理 熒光顯微技術(shù)是利用

8、短波光照射被射物質(zhì)，以激發(fā)其發(fā)射熒光熒光顯微技術(shù)是利用短波光照射被射物質(zhì)，以激發(fā)其發(fā)射熒光而在熒光顯微鏡下可以檢視的方法。而在熒光顯微鏡下可以檢視的方法。 熒光又可分為：自發(fā)熒光和次生熒光。自發(fā)熒光是指有些生物熒光又可分為：自發(fā)熒光和次生熒光。自發(fā)熒光是指有些生物體受到短波光照射后，直接發(fā)出的熒光。如經(jīng)紫外光照射后，葉綠體受到短波光照射后，直接發(fā)出的熒光。如經(jīng)紫外光照射后，葉綠體發(fā)出的紅色熒光；木質(zhì)素發(fā)出的黃色熒光等。次生熒光是指有些體發(fā)出的紅色熒光；木質(zhì)素發(fā)出的黃色熒光等。次生熒光是指有些生物材料受到短波光照射后并不發(fā)光，但當(dāng)它吸附熒光染料后，也生物材料受到短波光照射后并不發(fā)光，但當(dāng)它吸附熒

9、光染料后，也同樣產(chǎn)生熒光，這種熒光也稱間接熒光。同樣產(chǎn)生熒光，這種熒光也稱間接熒光。 三、實驗用品三、實驗用品 (一一) 材料：新鮮紫鴨趾草花粉或蠶豆原生質(zhì)體懸液，人口腔上皮細(xì)材料：新鮮紫鴨趾草花粉或蠶豆原生質(zhì)體懸液，人口腔上皮細(xì)胞。胞。 (二二) 用品：熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，鑷子，燒杯，牙簽等。用品：熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，鑷子，燒杯，牙簽等。 (三三) 試劑：試劑： 1二丙酸酯熒光素溶液：取二丙酸酯熒光素溶液：取l0mg二丙酸熒光素于二丙酸熒光素于5ml丙酮中，將丙酮中，將此溶液逐滴加入此溶液逐滴加入 5ml PH5-6生理鹽水或生理鹽水或0.65M的甘露醇溶液中，直到的甘露醇溶

10、液中，直到出現(xiàn)永久性乳白沉淀為止。出現(xiàn)永久性乳白沉淀為止。 20.01吖啶橙的生理鹽水溶液。吖啶橙的生理鹽水溶液。四、實驗方法四、實驗方法 (一一) 細(xì)胞二丙酸酯熒光素分解酶的活性及細(xì)胞活力的測細(xì)胞二丙酸酯熒光素分解酶的活性及細(xì)胞活力的測定二丙酸酯熒光素是非熒光性的親酯性化合物，很容易進定二丙酸酯熒光素是非熒光性的親酯性化合物，很容易進入細(xì)胞活力較強的細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞內(nèi)有較強的活性酯酶入細(xì)胞活力較強的細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞內(nèi)有較強的活性酯酶而將二丙酸酯熒光素中的熒光素分解出來，從而在熒光顯而將二丙酸酯熒光素中的熒光素分解出來，從而在熒光顯微鏡下發(fā)出了強烈的黃綠熒光，相反活力較弱的細(xì)胞，由微鏡下發(fā)出了

11、強烈的黃綠熒光，相反活力較弱的細(xì)胞，由于酯酶的含量低，表現(xiàn)熒光較弱，而死亡的細(xì)胞，由于酯于酯酶的含量低，表現(xiàn)熒光較弱，而死亡的細(xì)胞，由于酯酶活性喪失，不能分解二丙酸酯熒光素，而完全沒有熒光，酶活性喪失，不能分解二丙酸酯熒光素，而完全沒有熒光，具體方法如下：具體方法如下： 1取少許新鮮紫鴨趾草花粉或蠶豆取少許新鮮紫鴨趾草花粉或蠶豆表皮放在玻片上，加二丙酸酯熒光素溶表皮放在玻片上，加二丙酸酯熒光素溶液一滴，液一滴，5-10分鐘后，在熒光顯微鏡下分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察，時間不宜太長，以免細(xì)胞逐漸死觀察，時間不宜太長，以免細(xì)胞逐漸死亡，影響效果亡，影響效果 。2若著染是懸浮細(xì)胞，可將上述染色液數(shù)滴

12、直接加若著染是懸浮細(xì)胞，可將上述染色液數(shù)滴直接加入細(xì)胞培養(yǎng)液入細(xì)胞培養(yǎng)液5分鐘后，可離心收集。再用無細(xì)胞和分鐘后，可離心收集。再用無細(xì)胞和無染料的培養(yǎng)液洗二次，即可收集觀察。上述染過無染料的培養(yǎng)液洗二次，即可收集觀察。上述染過的細(xì)胞可保存在的細(xì)胞可保存在4左右的冰箱中，直到細(xì)胞死亡前左右的冰箱中，直到細(xì)胞死亡前故可觀察。故可觀察。 細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色，在激發(fā)光作用下，活細(xì)胞核呈黃綠細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色，在激發(fā)光作用下，活細(xì)胞核呈黃綠色或亮綠色熒光，而細(xì)胞質(zhì)為淡紅色，但含有粘多糖的細(xì)胞色或亮綠色熒光，而細(xì)胞質(zhì)為淡紅色，但含有粘多糖的細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)桔黃色顆粒，或整個細(xì)胞質(zhì)呈桔黃桔紅色在其細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)桔黃色顆粒，或整個細(xì)胞質(zhì)呈桔黃桔紅色熒光，死細(xì)胞其核呈紅色熒光其操作方法如下：熒光，死細(xì)胞其核呈紅色熒光其操作方法如下： 用牙簽取少許口腔粘膜上