基因表達(dá)和基因重組

1、 Genetic Recombination and Genetic Engineering第第 十十 四四 章章重組重組DNA技術(shù)發(fā)展史技術(shù)發(fā)展史pSC101pSC101SS第第 一一 節(jié)節(jié)DNA的重組的重組 DNA RecombinationDNADNA重組重組接合作用接合作用 (conjugation)(conjugation)轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction)(transduction)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 座座 (transposition)(transposition)同源重組同源重組 (homologo

2、us recombination)(homologous recombination)位點(diǎn)特異的重組位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination)(site-specific recombination)發(fā) 生 在 同 源 序 列 間 的 重 組 稱 為 同 源 重 組發(fā) 生 在 同 源 序 列 間 的 重 組 稱 為 同 源 重 組(homologous recombination)(homologous recombination)，又稱基本重組。是最基，又稱基本重組。是最基本的本的DNADNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在

3、兩個(gè)個(gè)DNADNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。 二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒觸時(shí)，質(zhì)粒DNADNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNADNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)(conjugation)?？山雍腺|(zhì)粒如可接合質(zhì)粒如 F 因子因子(F factor) 質(zhì)粒質(zhì)粒 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子分子（二）

4、轉(zhuǎn)化作用（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNADNA，使細(xì)，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用化作用 (transformation)(transformation)。 例：溶菌時(shí)，裂解的例：溶菌時(shí)，裂解的DNADNA片段被另一細(xì)菌攝取。片段被另一細(xì)菌攝取。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞 之 間 的胞 之 間 的 D N A

5、D N A 轉(zhuǎn) 移 及 基 因 重 組 即 為 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 作 用轉(zhuǎn) 移 及 基 因 重 組 即 為 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 作 用(transduction)(transduction)。噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑溶菌生長(zhǎng)途徑(lysis pathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenic pathway)例例第第 二二 節(jié)節(jié) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)DNA Recombination Technique n相關(guān)概念相關(guān)概念nDNA克隆克隆n工具酶工具酶n目的基因目的基因n基因載體基因載體n基本原理基本原理 n重組重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系本節(jié)主要內(nèi)容本節(jié)主要內(nèi)容克隆克

6、隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為獲取同一拷貝的過程稱為克隆化克隆化(cloning)，即即無性繁殖無性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆技術(shù)水平：技術(shù)水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物）個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）DNA克隆克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA）與載體）與載體DNA接合成一具有

7、自我接合成一具有自我復(fù)制能力的復(fù)制能力的DNA分子分子復(fù)制子復(fù)制子(replicon)，繼而，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一D N A 分 子 ， 也 稱分 子 ， 也 稱 基 因 克 隆 或 重 組基 因 克 隆 或 重 組 D N A (recombinant DNA) 。 生物技術(shù)工程生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等酶工程、細(xì)胞工程等目的目的 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得

8、感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱又稱重組重組DNA工藝學(xué)工藝學(xué)。（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶n DNA聚合酶聚合酶n 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶n T4DNA連接酶連接酶n 堿性磷酸酶堿性磷酸酶n 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶n Taq DNA聚合酶聚合酶重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割識(shí)別特異序列，切

9、割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補(bǔ)填補(bǔ)3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙

10、鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶定義定義限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是是識(shí)別識(shí)別DNA的特異序列的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割并在識(shí)別位點(diǎn)或

11、其周圍切割雙鏈雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H作用作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身保護(hù)自身DNA。分類分類、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 系系 株株

12、 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識(shí)別序列特點(diǎn)類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口同功異源酶同功異源酶來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTA

13、GGGCCTAGGATCC GBst有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為稱為同尾酶同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A同尾酶同尾酶為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。分子?？寺≥d體克隆載體(clonin

14、g vector)-為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector)-為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體。 質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA polylinker噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克?。┛寺。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。┫盗校ㄖ脫Q型，適用基因組克?。┦删w噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(cosmid)酵母人工染色體酵母人工染色體

15、(yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他其他二、重組二、重組DNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA

16、 克克 隆隆 過過 程程（一）目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕虻墨@取1. 化學(xué)合成法化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列氨基酸序列 。2.基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)(genomic DNA library)3. cDNA文庫(kù)文庫(kù)(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) （見第（見第22章）章） * 化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列序列組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基

17、因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合* 從基因組從基因組DNA文文庫(kù)獲取目的基因庫(kù)獲取目的基因（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接（三）外源基因與載體的連接1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連

18、接Bam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的

19、連接不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連限制酶切位點(diǎn)連接相似。接相似。2. 平端連接平端連接適用于：適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端

20、補(bǔ)齊或切平形成的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連3. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶或機(jī)械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)n

21、T 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體4. 4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件受體菌條件安

22、全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重組（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌（五）重組體的篩選（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法分子雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡 2. 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等( (插入失活法

23、插入失活法) )抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇 互補(bǔ)互補(bǔ) 互互補(bǔ)補(bǔ)的的檢檢測(cè)測(cè)原原位位雜雜交交Southern印跡印跡雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出重組重組DNADNA技術(shù)操作過程可形象歸納為技術(shù)操作過程可形象歸納為 小小 結(jié)結(jié)分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制

24、酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交表達(dá)體系的建立表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)（六）克隆基因的表達(dá)1. 原核表達(dá)體系原核表達(dá)體系 （E.coli表達(dá)體系最為常用）表達(dá)體系最為常用）標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn)多接頭克隆位點(diǎn)E.coli表達(dá)體系的不足表達(dá)體系的不足 不宜表達(dá)真核基

25、因組不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白很難表達(dá)大量可溶性蛋白大鼠胰島素原大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌的表達(dá)和分泌優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)

26、染葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射顯微注射 2. 真核表達(dá)體系真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體表達(dá)載體pFASTBACI 的物理圖譜的物理圖譜（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。識(shí)疾病的分子機(jī)制。三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物制藥（二）生物制藥 重組重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)產(chǎn) 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促進(jìn)凝血促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子(b