2015研究生實驗4 電泳與紫外

1、2015級研究生生化與分子生物學(xué)技術(shù)銀 巍生物化學(xué)教研室實驗二3影響DNA在凝膠中遷移速率的因素： DNA分子的大小 構(gòu)象 凝膠濃度 電壓 緩沖液不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（，（，W/ V ) DNA分子的有效分離范圍（分子的有效分離范圍（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2實驗步驟實驗步驟1、膠帶封制膠板兩端；2、放好梳子，今天插2個梳子,等膠稍稍冷卻后灌膠；3、待膠凝固后撕去膠帶，將制膠板放在電泳槽中，輕輕的拔掉梳子；4、加樣：每排第一個孔加 DNA marker 10 l （酶

2、切組：酶切質(zhì)粒20ul和4l loading buffer在膠帶上混勻上樣） (對照組：用酶切前的質(zhì)粒10ul和2l loading buffer在膠帶上混勻上樣,每組1個)；5、接通電源，開始電泳（80V，1H）;6、藍色條帶快到終點時停止電泳，EB染色5min，洗脫3min；7、漂洗后紫外燈下觀察結(jié)果。7實驗小結(jié)實驗小結(jié)結(jié)果分析與討論酶切前后的對比？質(zhì)粒構(gòu)型對結(jié)果的影響？重組質(zhì)粒的濃度是多少？純度怎樣？試驗中還有哪些問題沒有解決？8點樣孔點樣孔細菌基因組細菌基因組DNAOC 型質(zhì)粒型質(zhì)粒DNAL型質(zhì)粒型質(zhì)粒DNASC 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA細菌細菌RNA質(zhì)質(zhì)粒粒電電泳泳圖圖譜譜 超螺旋超螺旋DNA

3、(SC DNA)質(zhì)粒的三種構(gòu)型質(zhì)粒的三種構(gòu)型10 開環(huán)開環(huán)DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松分子就發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。弛型的環(huán)狀分子。11 線狀線狀DNA(linear DNA,LC DNA): 如果兩條鏈均斷開，即為線狀如果兩條鏈均斷開，即為線狀DNA。電泳時，三者泳動速度大小關(guān)系 SCLCOC12M：Marker1：酶切樣品：酶切樣品12：酶切樣品：酶切樣品23：酶切樣品：酶切樣品34：未酶切質(zhì)粒：未酶切質(zhì)粒M3211Kb200bp

4、100bp2Kb5Kb600bp400bp42.1 2.1 分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)2.1.1 2.1.1 概述概述 分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有的吸收分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有的吸收光譜對其進行定性、定量分析的實驗技術(shù)光譜對其進行定性、定量分析的實驗技術(shù)。14靈敏度高：測定下限可達靈敏度高：測定下限可達105106mol/L準確度高：能夠滿足微量組分的測定要求，準確度高：能夠滿足微量組分的測定要求，相對誤差相對誤差25 （12）;操作簡便快速操作簡便快速;應(yīng)用廣泛。應(yīng)用廣泛。152.2.2 光吸收基本定律光吸收基本定律: Lambert-Beer定律定律透光度百分比透光度百分比 T: T% =

5、 I0 / It光密度光密度 D，是光被吸收的程度，是光被吸收的程度: D = lg1/T = lg(I0/It)16Lambert-Beer定律定律 DK C L 吸光度吸光度 摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù) 吸收物質(zhì)的光徑（吸收物質(zhì)的光徑（cm） 溶液濃度（溶液濃度（mol/L）172.4.1 2.4.1 紫外分光光度法檢測紫外分光光度法檢測DNADNA的原理的原理原理：核酸分子含有嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，原理：核酸分子含有嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在在260nm處有特異的紫外吸收峰，其吸收強度與核處有特異的紫外吸收峰，其吸收強度與核酸濃度成正比。酸濃度成正比。優(yōu)點：簡單、快速、靈敏、樣品可以

6、回收。優(yōu)點：簡單、快速、靈敏、樣品可以回收。缺點：有一定的誤差（原因）；受蛋白類物質(zhì)干擾。缺點：有一定的誤差（原因）；受蛋白類物質(zhì)干擾。18：1. 0.1TE作為空對照作為空對照,在波長在波長260nm、280nm、310nm處分別測標準處分別測標準DNA樣品的樣品的OD值值2. 根據(jù)根據(jù)OD值計算值計算DNA濃度（濃度（ g/ml）單鏈DNAssDNA=33(OD260OD310)稀釋倍數(shù)雙鏈DNAdsDNA=50(OD260OD310)稀釋倍數(shù)4. DNA的純度鑒定的純度鑒定 OD260/ OD280=1.8 （RNA為為2 .0） 1.8 可能有可能有RNA污染污染 1.8 可能有蛋白質(zhì)污染可能有蛋白質(zhì)污染19思考題？