色譜分析法_09高效液相色譜實驗技術(shù)

1、一、色譜柱的保養(yǎng)一、色譜柱的保養(yǎng) 二、色譜柱的再生二、色譜柱的再生 三、實驗前準備工作三、實驗前準備工作 四、樣品處理技術(shù)四、樣品處理技術(shù) 在正常情況下，色譜柱至少可以使用36個月，能完成數(shù)百次以上的分離。但是，若操作不慎，將使色譜柱很易損壞而不能使用。因此為了保持柱效、柱容量及滲透性，必須對色譜柱進行仔細地保養(yǎng)。 1、色譜柱極易被微小的顆粒雜質(zhì)培塞，使操作壓力速升高而無法使用，因此必須將流動相仔細地蒸餾或用0.45m孔徑的濾膜過濾。在流動相組貯槽與色譜柱間，安裝0.45m孔徑的過濾器。在柱子上端接頭處裝上多孔過濾片，以防止固體顆粒進入色譜柱中。在水溶液流動相中，細菌容易生長，可能堵塞篩板加入

2、0.01NoHa能防止能防止細菌生長。 2、最好使用進祥閥進樣，以防止注射器進樣時、注射隔膜碎屑堵塞柱子入口。 3、對硅膠基鍵合相填科，水溶液流動相的PH值不得超出285的范圍，使溫度不宜過高。柱子在酸性或堿性條件下使用之后，。應依次用水、甲醇清洗，對暫時不用而需要較長時間保存的柱子，要用純甲清洗，柱子兩端用金屬螺帽封閉，保存于干凈的有機溶劑中。 4、要防止色譜柱被振動或撞擊，否則柱內(nèi)填料床層產(chǎn)生裂縫和空隙，會使色譜峰出現(xiàn)“駝峰”或“對峰”。 5、要防止流動相逆向流動，否則將使固定相層位移，柱效下降。 6、使用保護柱。連續(xù)注射含有未被洗脫樣品時，會使柱效下降，保留值改變。為了延長柱壽命，在進樣

3、閥和分析柱間加上保護柱，其長度一般為35cm，填充與分析柱性質(zhì)相似的表面多孔型固定相，因此可干法填裝。而且價廉、更換容易。實驗表明，使用保護柱后，除了使擴為零的組分的塔板數(shù)減少外，其柱效下降很少。一般情況下，硅膠和ODS等化學鍵合固定相再生是困難的。有時，采用下述方法可能提高校效。 1、由于雜質(zhì)微粒等因素，使柱上端固定相變色，柱效下降。這時，可仔細地將變色部分除去(約3mm左右)，再補充新的固定香。 2、當色譜柱吸附未被洗脫成分時，柱效將明顯下降，可選擇合適的溶劑進行洗凈。 3、對離子交換樹脂柱，先經(jīng)1molL HCI相1mol NaOH溶液洗凈，再以12mol/L NaCl水溶液平衡，以超聲

4、波發(fā)生器進行清洗，通常可獲良好的效果。 4、當采用梯度洗脫時，柱在重復使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生。1流動相溶劑的處理 2試樣溶液的制備 流動相溶劑的處理流動相溶劑的處理 (1) 水 將一般的蒸餾水，加入少許高錳酸鉀，在pH910的條件蒸餾，可用于常規(guī)洗脫。用于梯度洗脫的水，應進行二次蒸餾。 (2) 有機溶劑的提純 通常用蒸餾法可除掉大部分有紫外吸收的雜質(zhì)。將溶劑通過氧化鋁或硅膠柱可除去極性化合物。氯仿中含有的少量甲醇，可先經(jīng)水洗再經(jīng)蒸餾提純。試劑級的四氫呋喃由于含抗氧劑丁基甲苯酚而強烈吸收紫外線，可經(jīng)蒸餾除去難揮發(fā)的丁基甲苯酚。為了防止爆炸，蒸

5、餾終止時，在蒸餾瓶中必須剩余一定量的液體。(3) 溶劑的過濾和脫氣 流動相溶劑在使用前必須先用0.45ym孔徑的濾膜過濾，以除去微小顆粒，防止色譜柱堵塞。同時要進行脫氣處理，因為溶解在溶劑中的氣體會在管道、輸液泵或檢測池中以氣泡形式逸出，影響正常操作的進行。 在某些試樣中，常含有多量的蛋白質(zhì)、脂肪及糖類等物質(zhì)。它們的存在，將影響組分的分離測定，同時容易堵塞和污染色譜柱，使柱效降低，所以常需對試樣預處理。樣品的預處理方法很多，如溶劑萃取、吸附、超速離心及超過濾等。 1溶劑萃取 溶劑萃取適用于待測組件為非極性物質(zhì)。在試樣中加入緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，然后用乙醚或氯仿萃取待測組分。但如果待測組分和蛋白質(zhì)結(jié)

6、合，在大多數(shù)情況下；難以用萃取操作來進行分離。2吸附 將吸附劑直接加到試樣中，或?qū)⑽絼┨畛溆谥鶅?nèi)進行吸附。親水性物質(zhì)用硅膠吸附，而疏水性物質(zhì)可用聚苯乙烯二乙烯基苯等類樹脂吸附。 3除蛋白質(zhì) 向試樣中加入三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲醇，蛋白質(zhì)被沉淀下來，然后經(jīng)超速離心，吸取上層清液供分離測定用。 4超過濾 用孔徑為l010-10一500l0-10m的多孔膜過濾，可除去蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)。 l1、吸附色譜l2、分配色譜l3、離子交換色譜l4、凝膠色譜l根據(jù)填充劑吸附活性點對樣品的吸收系數(shù)不同而分離l充填劑：硅膠l根據(jù)固定相與流動相的極性不同而分為l 正相分配色譜和反相分配色譜兩者的區(qū)別如下圖所示： 固定相流動相正相分配極性非極性反相分配非極性極性l充填劑：多孔聚合物l是根據(jù)固定相的離子交換基和樣品成分中的離子性基進行交換來分離的 l凝膠色譜分離方法是利用分子振動效應，根據(jù)樣品分子的大小而進行分離。所以又稱為排斥色譜 l充填劑多采用：一定孔徑的多孔性聚合物 l1、農(nóng)藥殘留量分析 ：含氯農(nóng)藥 、有機磷農(nóng)藥 、除蟲菊l2、致癌物質(zhì) ：霉素 、亞硝胺(