第十三次課：?jiǎn)慰寺】贵w：從診斷到治療

1、單克隆抗體單克隆抗體Monocolonal antibody“the specificity in development and control of the immune system” and the the discovery of “the principle for production of monoclonal antibodies”Natural-Selection Theory of antibody formation（抗體（抗體形成過(guò)程中的自然選擇學(xué)說(shuō)）形成過(guò)程中的自然選擇學(xué)說(shuō)）1955年年Somatic Generation of immune Recognition

2、（免疫系統(tǒng)（免疫系統(tǒng)的自我建立學(xué)說(shuō)）的自我建立學(xué)說(shuō)）1971年年 Network Theory（免疫系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)）（免疫系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)）1974年年免疫相關(guān)疾病和生物學(xué)過(guò)程免疫相關(guān)疾病和生物學(xué)過(guò)程自身免疫疾?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡自身免疫疾?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡器官移植：免疫排斥器官移植：免疫排斥過(guò)敏：有機(jī)體對(duì)某些藥物或外界刺激的感受性不正過(guò)敏：有機(jī)體對(duì)某些藥物或外界刺激的感受性不正常地增高的現(xiàn)象；過(guò)分敏感常地增高的現(xiàn)象；過(guò)分敏感1. 疫苗：基因重組乙肝疫苗疫苗：基因重組乙肝疫苗T cell在胸腺中經(jīng)歷陽(yáng)性和陰性篩選過(guò)程在胸腺中經(jīng)歷陽(yáng)性和陰性篩選過(guò)程1、多克隆抗

3、體（、多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：）： 用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物，可刺激用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物，可刺激機(jī)體多個(gè)機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞細(xì)胞克隆克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物。2、單克隆抗體（、單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAb）：）： 由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞細(xì)胞克隆克隆產(chǎn)生的同源抗產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無(wú)交叉反應(yīng)性。體。高度均

4、一、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無(wú)交叉反應(yīng)性。與多抗相比，單抗純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持與多抗相比，單抗純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。McAb and PcAb雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)的誕生的誕生 1975年年8月月7日日，Kohler和和Milstein在英國(guó)自然在英國(guó)自然雜志上發(fā)表了題為雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預(yù)定特異性抗體的分泌具有預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity） 198

5、4年度榮獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)年度榮獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)細(xì) 胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合 HATHAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選克反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選克隆化增殖的雜交瘤隆化增殖的雜交瘤 細(xì)胞系細(xì)胞系 單克隆抗體生成：?jiǎn)慰寺】贵w生成：接種雜交瘤接種雜交瘤 細(xì)胞于小鼠腹腔，腹細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體抗體種類：抗體種類：第一代抗體第一代抗體 多克隆抗體多克隆抗體 （polyclonal antibody)

6、第二代抗體第二代抗體 單克隆抗體單克隆抗體 （monoclonal antibody)第三代抗體第三代抗體 基因工程抗體基因工程抗體 （genetic engineering antibody)B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞: :壽命短壽命短, ,分泌特分泌特異系性抗體異系性抗體骨髓瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)壽命長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞：雜交瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)，單壽命長(zhǎng)，單 隆抗體隆抗體流流程程 不產(chǎn)生不產(chǎn)生IgIg的重鏈和輕鏈的重鏈和輕鏈 HGPRT-（次黃嘌呤（次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）轉(zhuǎn)移酶）;TK-（胸腺嘧啶核苷激酶）（胸腺嘧啶核苷激酶） 與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品

7、系相同（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來(lái)源小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來(lái)源于于BALB/c小鼠小鼠，大鼠骨髓瘤細(xì)，大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來(lái)源于胞都來(lái)源于LOU/c大鼠大鼠建立的骨髓瘤細(xì)胞系建立的骨髓瘤細(xì)胞系 : SP2/0-Ag14， X63-Ag8.653 NSO/1 動(dòng)動(dòng) 物：物：BALB/BALB/c c小鼠小鼠4 48 8周齡周齡20g20g25g25g體重體重（二）免疫脾細(xì)胞（二）免疫脾細(xì)胞細(xì)胞性抗原：細(xì)胞性抗原：（1 12 2）10107 7/ /只，不加佐劑，只，不加佐劑，2 23 3周重復(fù)一次周重復(fù)一次可溶性抗原：可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑首次，完全福氏佐劑+10

8、0+100微克抗原，微克抗原，3 36 6周周100100200200微克抗原，融合前微克抗原，融合前3 3天，加強(qiáng)免疫天，加強(qiáng)免疫體內(nèi)免疫法體內(nèi)免疫法-免疫原性強(qiáng)、來(lái)源充分的抗原，對(duì)于免疫原性強(qiáng)、來(lái)源充分的抗原，對(duì)于免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起免疫抑制）的免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了抗原就不適用了免疫小鼠免疫小鼠。淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞。漿細(xì)胞漿細(xì)胞。抗原接種抗原接種免疫原特性免疫原特性抗原量抗原量接種次數(shù)接種次數(shù)間隔時(shí)間隔時(shí)間間單抗的特性單抗的特性抗體滴度抗體滴度親和性親和性免疫原性強(qiáng)免疫原性強(qiáng)（如細(xì)胞、細(xì)（如細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等）菌和病毒等）10106 6-10

9、-107 7個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞或或1-10ug1-10ug2-42-42-42-4周周高高中等至強(qiáng)中等至強(qiáng)免疫原性中等免疫原性中等10-100ug10-100ug2-42-42-42-4周周中等或高中等或高中等或強(qiáng)中等或強(qiáng)免疫原性弱免疫原性弱A.20-400ugA.20-400ug2-42-4隨后隨后2-32-3每月每月2-32-3月月中等中等強(qiáng)強(qiáng)B.10-50ugB.10-50ug其后其后200-400ug200-400ug2 2其后其后4 4每月每月每天每天中等中等中等中等C.10-100ugC.10-100ug2 2其后其后4 4其后其后“休息休息”最后加強(qiáng)最后加強(qiáng)每月每月1010天天1-21

10、-2月月中等中等中等或強(qiáng)中等或強(qiáng)表表6-1 不同免疫抗原的免疫程序不同免疫抗原的免疫程序（引自劉秀梵，（引自劉秀梵，1994）培養(yǎng)液：培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)液（三）細(xì)胞融合（三）細(xì)胞融合細(xì)胞融合劑：細(xì)胞融合劑：PEG:分子量分子量4000 的的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開(kāi)而有助于細(xì)胞融合膜易打開(kāi)而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的PEGPEG，其純度與毒性有所不同，其純度與毒性

11、有所不同最早仙臺(tái)病毒被用做融合劑，后來(lái)發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（最早仙臺(tái)病毒被用做融合劑，后來(lái)發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）的融合效果更）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問(wèn)題好，且避免了病毒的污染問(wèn)題培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG8-AG（8 8氮鳥(niǎo)嘌呤）處理細(xì)氮鳥(niǎo)嘌呤）處理細(xì)胞，以維持胞，以維持HGPRT-HGPRT-的狀態(tài)。的狀態(tài)。注意事項(xiàng)：切忌過(guò)多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存注意事項(xiàng)：切忌過(guò)多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于于-

12、80-80或液氮及干冰中或液氮及干冰中取已經(jīng)免疫的取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照血清。血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照血清。同時(shí)通過(guò)頸脫位致死小鼠，浸泡于同時(shí)通過(guò)頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中酒精中5分鐘分鐘通常每只小鼠通常每只小鼠1108-2.5108個(gè)脾細(xì)胞，每只大鼠脾個(gè)脾細(xì)胞，每只大鼠脾臟可得臟可得5108-10108脾細(xì)胞。脾細(xì)胞。免疫脾細(xì)胞的制備：免疫脾細(xì)胞的制備：1 110108 8的的淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 無(wú)菌手術(shù)無(wú)菌手術(shù)常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬

13、細(xì)胞噬細(xì)胞其中巨噬細(xì)胞還有清除死亡細(xì)胞的作用其中巨噬細(xì)胞還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過(guò)飼養(yǎng)存活一般不超過(guò)2 2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化 在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過(guò)程中，由于大量骨髓瘤在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過(guò)程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞（飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cells）。）。飼養(yǎng)細(xì)胞：飼養(yǎng)細(xì)胞：。飼養(yǎng)細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞融合方法

14、融合方法a、將、將1108脾細(xì)胞與脾細(xì)胞與2107-5107骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14混合于一支混合于一支50ml融合管融合管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基至中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。，充分混勻。b、1000r/min離心離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。分鐘，將上清盡量吸凈。c、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻;置置40水浴中預(yù)熱。水浴中預(yù)熱。d、用、用1ml吸管在吸管在1分鐘左右（最佳時(shí)間為分鐘左右（最佳時(shí)間為45秒）加預(yù)熱至秒）加預(yù)熱至40的的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。，邊加邊輕輕攪拌。e、

15、用、用10ml吸管在吸管在90秒內(nèi)加秒內(nèi)加20-30ml預(yù)熱至預(yù)熱至37的不完全培養(yǎng)基；的不完全培養(yǎng)基；20-37靜置靜置10分分鐘。鐘。f、1000r/min 5分鐘；棄去上清。分鐘；棄去上清。g、加入、加入5ml HAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含腹腔培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含腹腔巨噬細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至培養(yǎng)基至80-100ml。h、分裝、分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.10-0.15ml；分裝；分裝24孔板，每孔孔板，每孔1.0-1.5ml；然后將；然后將培養(yǎng)板置培養(yǎng)板置37，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱內(nèi)培

16、養(yǎng)。i、5天后用天后用HAT培養(yǎng)基換出培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。j、7-10天后用天后用HT培養(yǎng)基換出培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。天后可用普通完全培養(yǎng)基）。l、經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)至孔底面積、經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)至孔底面積1/10以上時(shí)吸出上清供抗體以上時(shí)吸出上清供抗體檢測(cè)。檢測(cè)。10102020天出現(xiàn)克隆天出現(xiàn)克隆HATHAT篩選篩選雜交瘤細(xì)胞在融合后雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來(lái)，通常也稱為抗體檢測(cè)。來(lái)，通常

17、也稱為抗體檢測(cè)。融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)常用的抗體檢測(cè)方法：常用的抗體檢測(cè)方法：（1）免疫酶技術(shù)）免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的高效催免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性高，靈敏度高，現(xiàn)已化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性高，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。廣泛用于篩選和鑒定單抗。用可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（用可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）用全菌抗原的用全菌抗原的ELISA用全細(xì)胞抗原的用全細(xì)胞抗原的ELISA抗體捕捉抗體捕捉ELISA試驗(yàn)試驗(yàn)ABC

18、-ELISA試驗(yàn)試驗(yàn)Dot-ELISA試驗(yàn)試驗(yàn)免疫組化染色法免疫組化染色法（2）免疫熒光技術(shù)）免疫熒光技術(shù)間接免疫熒光法間接免疫熒光法活細(xì)胞的膜熒光染色活細(xì)胞的膜熒光染色（3）間接血凝試驗(yàn)）間接血凝試驗(yàn)（4）放射免疫測(cè)定）放射免疫測(cè)定HGPRTHGPRT酶與酶與TKTK酶酶：次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)應(yīng)用液：應(yīng)用液：8-8-氮鳥(niǎo)嘌呤氮鳥(niǎo)嘌呤HATHAT培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤次黃嘌呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；氨基喋呤；葉酸拮抗物

19、，阻葉酸拮抗物，阻斷斷DNA合成主要途徑（合成主要途徑（D途徑）途徑） T（Thymidine）：）：胸胸腺嘧啶核苷酸；腺嘧啶核苷酸；“核苷酸前核苷酸前體體”，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成DNADNA。H H和和T T聯(lián)合阻聯(lián)合阻斷斷DNADNA合成的替代途徑。合成的替代途徑。HATHAT選擇作用：選擇作用：淋巴細(xì)胞：淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，不能生長(zhǎng)，5 57 7天死亡。天死亡。DNADNA合成的合成的主要途徑被主要途徑被A A阻斷阻斷骨髓瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，不能生長(zhǎng)，5 57 7天死亡。天死亡。HGPRTHGPRT缺缺乏，乏，DNADNA合成的替代途徑被阻斷合成的替代

20、途徑被阻斷SP2/O: HGPRT- ，TK-;長(zhǎng)長(zhǎng)命命脾細(xì)胞脾細(xì)胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命短命(7天天)雜交雜交瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞:HGPRT+ ，TK+; 長(zhǎng)長(zhǎng)命命骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交雜交瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)：雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)： 長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖 利用淋巴細(xì)胞的利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將，將H合成為嘌呤合成為嘌呤堿并最終與堿并最終與T一起合成一起合成DNA 從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息 從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法有限稀釋法(limiting dilution)

21、FACS法法（fluorescence activated cell sorter）軟瓊脂平板法軟瓊脂平板法(soft agar method) 二、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存二、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存特點(diǎn)：特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：方法：細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含每個(gè)培養(yǎng)孔含0.50.51 1個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞有限稀釋法有限稀釋法每種雜交瘤細(xì)胞分裝每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個(gè)稀釋度孔板一塊，每個(gè)稀釋度32孔，每孔量為孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為，每孔的雜交

22、瘤細(xì)胞數(shù)分別為0.5、3和和10。效率最高效率最高價(jià)格昂貴價(jià)格昂貴FACS（ Fluorescence Activating Cell Sorter ）軟瓊脂平板法軟瓊脂平板法(soft agar method)按按1:1比例使比例使1.2%的瓊脂糖和的瓊脂糖和2DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基(含有含有2抗抗生素和生素和20%的小牛血清的小牛血清)混合后，取混合后，取3mL混合液注入直徑混合液注入直徑6cm平皿中平皿中(10cm平皿加平皿加710mL)，冷卻凝固，可作底層，冷卻凝固，可作底層瓊脂置瓊脂置CO2溫箱中備用。溫箱中備用。 按按1:1比例讓比例讓0.7%的瓊脂糖和的瓊脂糖和2DMEM培養(yǎng)基在無(wú)

23、菌試管培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后，再向管中加入中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入上層瓊脂凝固后，置入37 5%CO2溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)1014天天克隆生長(zhǎng)至克隆生長(zhǎng)至2mm時(shí)，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含時(shí)，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)?？装?，擴(kuò)大培養(yǎng)。吸取上清，檢測(cè)抗體，陽(yáng)性孔可繼續(xù)克隆化，或擴(kuò)大培養(yǎng)吸取上清，檢測(cè)抗體，陽(yáng)性孔可繼續(xù)克隆化，或擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。、凍存。配制方案：配制方案

24、：雜交瘤細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞（1 15 5）x10 x106 6/ml) + /ml) + 細(xì)胞凍存液細(xì)胞凍存液(30%(30%40% 40% 牛血清，牛血清，50%50%60% RPMI-164060% RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)液，10%DMSO )10%DMSO )“慢凍慢凍”：分步冷凍，分步冷凍，30-7030-70液氮液氮 保存數(shù)年至數(shù)十年保存數(shù)年至數(shù)十年“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇在建立雜交瘤細(xì)胞的過(guò)程中，有時(shí)一次融合產(chǎn)生很多在建立雜交瘤細(xì)胞的過(guò)程中，有時(shí)一次融

25、合產(chǎn)生很多“陽(yáng)性陽(yáng)性”孔，孔，來(lái)不及對(duì)所有的雜交瘤細(xì)胞作進(jìn)一步的工作，需要把其中一部分來(lái)不及對(duì)所有的雜交瘤細(xì)胞作進(jìn)一步的工作，需要把其中一部分細(xì)胞凍存起來(lái)；另一方面，為了防止實(shí)驗(yàn)室可能發(fā)生的意外事故細(xì)胞凍存起來(lái)；另一方面，為了防止實(shí)驗(yàn)室可能發(fā)生的意外事故防止污染防止污染避免染色體丟失避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡細(xì)胞冷凍的意義細(xì)胞冷凍的意義（1）單克隆性的確定）單克隆性的確定包括雜交瘤細(xì)胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和包括雜交瘤細(xì)胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。單

26、抗純度鑒定等。A A、雜交瘤細(xì)胞的染色體分析、雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細(xì)胞的客對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細(xì)胞的客觀指標(biāo)之一，雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目應(yīng)接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總觀指標(biāo)之一，雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目應(yīng)接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為和，正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為40，小鼠骨髓瘤細(xì)胞，小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為為62-68，NS-1為為54-56； B 、單抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定單抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定 免疫擴(kuò)散免疫擴(kuò)散 ELISA C、單抗純度的鑒定、單抗純度

27、的鑒定 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、）、SDS-PAGE、等電點(diǎn)聚焦電泳、等電點(diǎn)聚焦電泳（IEF）及免疫）及免疫 轉(zhuǎn)印分析（轉(zhuǎn)印分析（WB）等方法都可用于鑒定單抗的純度。）等方法都可用于鑒定單抗的純度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB（三三）單克隆抗體的性質(zhì)鑒定單克隆抗體的性質(zhì)鑒定（2）單抗理化特性的鑒定）單抗理化特性的鑒定抗體親合力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的程度，其高低主要是由抗體親合力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的程度，其高低主要是由抗體和抗原分子的大小、抗體分子結(jié)合簇（部）和抗原決定簇之間抗體和抗原分子的大小、抗體分子結(jié)合簇（部）和抗原決定簇之間的立體構(gòu)型

28、的合適程度決定的。親合力通常以平均內(nèi)在結(jié)合常數(shù)（的立體構(gòu)型的合適程度決定的。親合力通常以平均內(nèi)在結(jié)合常數(shù)（K）表示。）表示。常用的方法有競(jìng)爭(zhēng)常用的方法有競(jìng)爭(zhēng)ELISA、非競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA、間接、間接ELISA、間接法夾心間接法夾心ELISA等等（3）單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性測(cè)定）單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性測(cè)定包括各類免疫血清學(xué)試驗(yàn)、生物學(xué)試驗(yàn)和免疫化學(xué)技術(shù)等包括各類免疫血清學(xué)試驗(yàn)、生物學(xué)試驗(yàn)和免疫化學(xué)技術(shù)等 三、單克隆抗體的制備三、單克隆抗體的制備 經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起

29、染色體大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。 （一）單克隆抗體的產(chǎn)生（一）單克隆抗體的產(chǎn)生1 1 動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：每次用每次用BALB/cBALB/c或或F1F1代小鼠，（代小鼠，（5 51010）10105 5/ /只只, , 使用的動(dòng)物當(dāng)然首選使用的動(dòng)物當(dāng)然首選BALB/c小鼠小鼠 ,將雜交瘤細(xì)胞將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)雜交瘤，接種于小鼠

30、腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高?？梢?jiàn)該法操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，不過(guò)，腹?jié)舛群芨??？梢?jiàn)該法操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，不過(guò)，腹水中?；煊行∈蟮母鞣N雜蛋白（包括水中?；煊行∈蟮母鞣N雜蛋白（包括Ig）腹腔注射法腹腔注射法2 2 體外培養(yǎng)法：體外培養(yǎng)法：a、懸浮培養(yǎng)法：、懸浮培養(yǎng)法：小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，通過(guò)攪拌小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，通過(guò)攪拌使細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)；而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物使細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)；而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物反應(yīng)器反應(yīng)器b、微載體培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法Microcarrier：

31、主要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、主要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質(zhì)的產(chǎn)品聚苯乙烯、玻璃等作為基質(zhì)的產(chǎn)品c、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：由中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基由中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動(dòng)泵等組成容器、供氧器和蠕動(dòng)泵等組成d、微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：、微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：先將雜交瘤細(xì)胞微囊化，然后將此先將雜交瘤細(xì)胞微囊化，然后將此具有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，一定時(shí)間后，具有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，一定時(shí)間后，從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗后打開(kāi)囊膜，離心后即可獲得從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗后打開(kāi)囊膜，離心后即可獲得高濃度的單抗。高濃度的單抗。3. 3. 雜交瘤細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)已報(bào)道的各類無(wú)血清培養(yǎng)基有含有大豆類脂的、含有酪已報(bào)道的各類無(wú)血清