第7章免疫與血清學(xué)基本技術(shù)

1、第七章 免疫與血清學(xué)根本技術(shù)第一節(jié) 免疫學(xué)根本知識(shí)一、抗原抗原是指能與 T 細(xì)胞及 B 細(xì)胞的受體結(jié)合，促使其增殖、分化，產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并與之結(jié) 合，進(jìn)而發(fā)揮免疫效應(yīng)的物質(zhì)。抗原一般具有兩個(gè)重要特性： 一是免疫原性，即抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力； 二是抗原性，即抗原與其誘生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞有特異性結(jié)合的能力。 既有免疫源性又有抗原性的物質(zhì)為完全抗原，而只有抗原性無免疫源性的物質(zhì)稱為半抗原。決定 Ag 特異性的最小化學(xué)亞單位稱為決定簇又稱表位 。 依其與胸腺關(guān)系又分胸腺依賴抗原 TD-Ag 和胸腺非依賴抗原 TI-Ag。 絕大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原如病原微生物、

2、血細(xì)胞、血清蛋白等均屬于TD-Ag ?？乖拿庖咴葱允钱愇镄裕乖奶禺愋允敲庖邞?yīng)答中最重要的特點(diǎn)，也是免疫學(xué)診斷和免疫學(xué)防治 的理論依據(jù)。人類血型抗原有 A 和 B 抗原，它們刺激機(jī)體產(chǎn)生抗 A 和抗 B 抗體。 人類血型抗原是同種異型抗原同一種屬不同個(gè)體間的遺傳標(biāo)記不同 。 器官移植所產(chǎn)生的排異反響，也是因同種異型抗原所致。佐劑在免疫中常常采用，它主要的機(jī)制是增強(qiáng)機(jī)體對(duì) Ag 的免疫應(yīng)答。二、抗體 抗體是抗原刺激機(jī)體由 B 細(xì)胞產(chǎn)生的，本質(zhì)是免疫球蛋白 Ig 。Ig 的根本結(jié)構(gòu)是：4 條肽鏈 2 條輕鏈 -L 鏈、 2 條重鏈 -H 鏈由二硫鍵連接。L鏈分為可變部位V和恒定局部C，即VL+

3、CL 。H鏈也分為可變部位V丨和恒定局部C，即卩VH+CH，但CH局部又分為 CHi、CH2、CH3。IgM 和 IgE 還有 CH4 局部。CH 1與CH2區(qū)之間為絞鏈區(qū)。如果用木瓜酶水解后，將 IgG水解2Fab和Fc。 Fab是Ig與Ag結(jié)合部位，F(xiàn)c是可結(jié)晶局部。用胃蛋白酶水解IgG，可分為F(ab?2和Fc局部，F(xiàn)(ab?)是兩個(gè)Fab連在一起的局部。Ig的分類是依據(jù) H鏈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，主要依Fc局部CH。Ig分為五大類：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD。 Ig 同種型是指 H 鏈所具有的的特性。同一類Ig分型依據(jù)L鏈結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可分為k和入型。Ig的Fc段局部可與某些細(xì)胞的 Fc

4、受體結(jié)合，如巨噬細(xì)胞等。F(ab?2局部是與Ag結(jié)合部，VH+VL是F(ab?2中的高變區(qū)，直接與 Ag能結(jié)合的部位。人類 5 種 Ig 各具特色， IgM 分子量最大，免疫應(yīng)答早期產(chǎn)生的 Ab 只要為 IgM 。IgG 在血清中含量最高，而且是唯一能通過人類胎盤的 Ig。IgA經(jīng)J鏈連接，可形成多聚IgA。多聚 IgA 與分泌片結(jié)合后，能抵抗蛋白酶的水解作用。有人稱具備局部Ab o IgE可與肥大細(xì)胞膜上 Fc受體結(jié)合。三、抗原抗體反響 每一種抗原物質(zhì)都能在具有免疫功能的機(jī)體中遇到與其相應(yīng)的免疫細(xì)胞，結(jié)合在其外表受體上，激發(fā) 產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并且能夠與這種抗體特異性地結(jié)合?？乖c抗體的結(jié)合為

5、非共價(jià)結(jié)合。 其分子空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，決定了結(jié)合部位原子間的接近程度，使各種弱作用鍵充分發(fā)揮作用，形成 相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)合。 在機(jī)體內(nèi)，抗原和抗體的結(jié)合導(dǎo)致補(bǔ)體激活，最終引起殺細(xì)胞或殺菌作用；或者結(jié)合于吞噬細(xì)胞外表 的受體，引起對(duì)細(xì)菌或異物的吞噬作用。抗原與抗體的結(jié)合使特異性的，這種性質(zhì)構(gòu)成了各種免疫學(xué)測(cè)定的根底；同時(shí)，這種結(jié)合反響只是相 對(duì)穩(wěn)固的，可以利用洗脫的方法將它們重新別離而不損害其活性，這種方法可以用于抗原或抗體的提純。四、補(bǔ)體 C 存在于人和動(dòng)物血清中，不耐熱，可輔助特異性抗體介導(dǎo)的溶菌作用，由于這種成分是抗體發(fā)揮溶細(xì) 胞作用的必要補(bǔ)充條件，這種物質(zhì)稱為補(bǔ)體。補(bǔ)體由9種成分，11種蛋白

6、組成：C1 q、r、s、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9。它們對(duì)溫 度很敏感，易被破壞。補(bǔ)體系統(tǒng)包括補(bǔ)體及 D、 P、 B 等因子，約有 20 種成分。 補(bǔ)體激活有兩個(gè)途徑： 傳統(tǒng)途徑第一途徑和旁路途徑第二途徑 。 第一途徑可被 Ag -Ab免疫復(fù)合物IC活化?；罨樞蚴牵?C1 、 C4、 C2、 C3、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9。第二途徑可被細(xì)菌的脂多糖激活。 補(bǔ)體的激活是一種酶促級(jí)連反響：第一種成分激活后，稱為一種有活性的酶，催化下一種成分轉(zhuǎn)化為 具有生物活性的物質(zhì)蛋白酶或炎癥誘導(dǎo)成分 。補(bǔ)體的最后 3 種成分將聚合成為“終末復(fù)合物 ，其本身或在抗體的幫助下插入

7、細(xì)菌外膜，導(dǎo)致細(xì)菌 死亡。五、免疫系統(tǒng)1 、免疫組織器官 1 中蘇免疫器官：骨髓、胸腺、法氏囊禽類 2周圍免疫器官：脾臟、淋巴結(jié)、皮膚免疫系統(tǒng)、黏膜免疫系統(tǒng)。2、免疫細(xì)胞干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系 TH、 TC、 TS、 TDH、 BC 漿細(xì)胞等、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、NK 細(xì)胞等。單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1。3、免疫分子Tcr、Bcr、CD、MHC、Ig、補(bǔ)體、細(xì)胞因子IL-1、IL-2六、各免疫細(xì)胞特點(diǎn)1、T細(xì)胞可分為幾群，其中 Th細(xì)胞是很重要的免疫細(xì)胞，CD4+可被PHA、ConA、PWM、花生凝集素刺激活化進(jìn)行有絲分裂，幫助產(chǎn)生抗體，司管細(xì)胞免疫。TS細(xì)胞是抑制細(xì)胞，CD8+參

8、加免疫調(diào)節(jié)。Tc是細(xì)胞毒細(xì)胞。Th細(xì)胞成熟需要胸腺加工處理。T 細(xì)胞定位于淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)。2、B 細(xì)胞B 淋巴細(xì)胞主管體液免疫調(diào)節(jié)。 外表有抗原受體 SMIg。BC 成熟在骨髓中相當(dāng)禽類法氏囊 。未成熟BC最初可查到Ig的鏈，活化BC可衍變成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞能產(chǎn)生 Ab和分泌Ab。 PWM 可以刺激 BC 有絲分裂。人類外周血中 T 細(xì)胞與 B 細(xì)胞比為 2：1。3、單核類細(xì)胞 無Ag受體，但不能處理 Ag，加工Ag，并向T細(xì)胞呈遞Ag。七、過敏反響變態(tài)反響 國際公認(rèn)的過敏反響是 4 個(gè)型：I型速發(fā)型、I型溶細(xì)胞型、I型免疫復(fù)合物型或稱血管炎型、I型遲發(fā)型。 第I型是由IgE抗體所致，IgE與肥

9、大細(xì)胞的IgE的Fc受體結(jié)合產(chǎn)生一系列變化，出現(xiàn) I型過敏。 如青霉素過敏皮內(nèi)注射過敏原 ?；加新约纳x感染疾患； IgE 抗體升高顯著。第I型過敏反響是由T細(xì)胞中Tdh細(xì)胞釋放淋巴因子所致。如結(jié)核菌素過敏試驗(yàn)皮內(nèi)直射過敏原第I型、I型過敏系由IgM、IgG抗體及補(bǔ)體參與介導(dǎo)。第二節(jié) 抗體檢測(cè)一、抗體檢測(cè)的根本原理 抗原與抗體之間特異性的結(jié)合反響，是免疫學(xué)檢測(cè)的根底，既抗原使用抗原來檢測(cè)抗體，也可以使用一直抗體來檢測(cè)抗原?？乖c抗體雖然都是大分子物質(zhì)，但單分子的抗原與抗體反響仍然是肉眼無法覺察的反響。 要檢測(cè)抗體的存在， 就必須建立一中顯示系統(tǒng)，將看不見的抗原 -抗體反響， 轉(zhuǎn)化為抗原看見、

10、或者可 以測(cè)定的反響。抗體測(cè)定抗原使用許多種不同的方法，本質(zhì)上浙西而方法只有顯示系統(tǒng)的誤差。 不同的方法可以顯示出不同量的抗原 -抗體反響， 因而，抗體檢測(cè)的方法主要決定了抗體檢測(cè)的靈敏度。 檢測(cè)抗體必須使用的抗原，抗原可能是混雜的物質(zhì)。因而，在抗體測(cè)定中使用的抗原種類，主要決定了抗體檢測(cè)的特異性。二、抗體檢測(cè)方法一中和反響 中和反響不僅測(cè)定抗體是否存在，而且測(cè)定抗體是否具有免疫保護(hù)作用，因而，盡管這種方法復(fù)雜、 費(fèi)時(shí)，影響因素眾多而且不穩(wěn)定， 在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是病毒性疾病中， 仍然是不可區(qū)帶的抗體檢測(cè)方法。中和試驗(yàn)的根本方法是，將待檢物質(zhì)與活的致病微生物混合，感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，然后

11、觀察 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否發(fā)病、死亡、或細(xì)胞是否發(fā)生病變。早期中和試驗(yàn)主要利用疾病的動(dòng)物模型進(jìn)行，目前，在病毒性疾病領(lǐng)域，通常利用培養(yǎng)病毒的細(xì)胞進(jìn) 行。在結(jié)果的解釋中應(yīng)當(dāng)注意，細(xì)胞的中和試驗(yàn)通常只反映抗體阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力，這只是病毒致 病過程中的一小局部。二沉淀反響 血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)沉淀物，這類反響稱為沉淀反 應(yīng)。該類反響可檢測(cè)到 202mg/mL 水平的抗體。較常用的檢測(cè)方法有：1、單項(xiàng)免疫擴(kuò)散 將一定量抑制抗原混于瓊脂中制成瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗體參加孔中擴(kuò)散，抗原抗體在擴(kuò)散過程形成以抗體孔為中心的沉淀環(huán)，可用于檢測(cè)血清中的IgG、IgM、

12、IgA和補(bǔ)體C3等含量。2、雙相免疫擴(kuò)散將抗原與抗體分別加于瓊脂凝膠中， 二者自由向四周擴(kuò)散， 在相遇處形成沉淀線。 可用于抗體的定性、 定量檢測(cè)。三凝集反響 細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集團(tuán)塊，這一類反響稱為凝集反響，該類反響可檢測(cè)到1g/mL。1 、直接凝集 將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反響，出現(xiàn)細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。檢測(cè)方法有兩種： 是玻片凝集試驗(yàn)，用于定性測(cè)抗原，多用于快速診斷； 是試管凝集試驗(yàn)，在試管種系列稀釋待檢血清，參加顆?？乖谰蚧罹?，多用死菌，進(jìn)行的血清反響，用于定量檢測(cè)抗體。溫箱中放 24 小時(shí)后取出反響管在室溫放 2個(gè)小時(shí)再判斷為宜，判定凝集滴度以凝

13、集程度為+而定。2、間接凝集 將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒外表，與相應(yīng)抗體反響出現(xiàn)顆粒凝集的現(xiàn)象。如用丫球蛋白包被的乳膠顆粒，檢測(cè)病人血清中的一種抗丫球蛋白的抗體類風(fēng)濕因子四補(bǔ)體參加的反響利用抗體與紅細(xì)胞上的抗原結(jié)合，激活反響體系中的補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞的溶解，用溶血現(xiàn)象作為指示 系統(tǒng)幫助結(jié)果判定。常用的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和溶血空斑試驗(yàn)。五用標(biāo)記抗原進(jìn)行的抗原抗體反響 利用熒光素、酶或放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行的抗原抗體反響。 靈敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等優(yōu)點(diǎn)。1 、免疫熒光 將細(xì)菌、感染病毒的細(xì)胞等顆?？乖裙潭ㄓ谳d玻片，加待檢血清反響后，再加熒光素標(biāo)記的抗 體，置

14、熒光顯微鏡下觀察判定，用于檢測(cè)抗體。2、酶免疫測(cè)定 是用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反響。可用目測(cè)定性，也可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定光密度0D值以反映抗體的含量，敏感度可達(dá)ng/mL甚至pg/mL 。常用語標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等。 常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA ?；虿捎秒p抗體夾心法或間接法檢測(cè)特異抗體。3、放射免疫測(cè)定法用放射性的核素125|和131|丨標(biāo)記抗原，檢測(cè)抗體，靈敏度達(dá)pg/mL。4、免疫印跡法將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳區(qū)分的蛋白質(zhì)抗原轉(zhuǎn)移至NC或PVDF等膜上。檢測(cè)特異的抗體。用該法檢測(cè)血清 H|V 抗體為診斷 H|V 感染的方法之一。三、抗體檢測(cè)所使用的

15、抗原 病原微生物，無論是細(xì)菌還是病毒，都含有許多種抗原物質(zhì)，在感染過程中，會(huì)形成反響性非常復(fù)雜的抗體。這些抗原的特異性很不相同，有的只存在于該種致病微生物中，也有的可能是在細(xì)菌或病毒中廣泛存 在時(shí)，甚至可以和動(dòng)物以至人體的組織產(chǎn)生交叉反響。因此，我們?cè)诤饬恳豁?xiàng)抗體檢測(cè)的結(jié)果時(shí)，不僅需要考慮所采用的方法和滴度的上下，還必須考慮用 于檢測(cè)的是那一種類型的抗原。1 、全菌或全病毒抗原 最早的血清學(xué)反響，就是將細(xì)菌或病毒直接殺死后作為抗原進(jìn)行的。 目前，這種類型的抗原在一些疾病， 幾種類型的試驗(yàn)方法如細(xì)菌凝集試驗(yàn)或免疫熒光檢測(cè)中仍在應(yīng)用。由于這種類型的抗原物質(zhì)中成分復(fù)雜，很難防止交叉反響，在用作疾病診

16、斷時(shí)，必須結(jié)合臨床病癥并 對(duì)結(jié)果判定有較嚴(yán)格的限制。由于結(jié)果難于解釋，這些方法很難用于大規(guī)模的疾病監(jiān)測(cè)。2、替代抗原 由于一些種類的微生物只能在細(xì)胞中生長，無法獲得純培養(yǎng)，傳統(tǒng)上使用與它們具有交叉反響的抗原 物質(zhì)來測(cè)定這些疾病產(chǎn)生的抗體。如診斷立克次體病使用的變形桿菌抗原或診斷梅毒的牛心脂抗原。 由于這些抗原廣泛存在，這種檢測(cè)方法的結(jié)果只能具有參考價(jià)值。3、粗提取抗原 在一些監(jiān)測(cè)方法開展較早的疾病中，已經(jīng)選用了病原微生物中高度特異的抗原成分，而在監(jiān)測(cè)方法中 使用的抗原物質(zhì)，也已經(jīng)過了一定程度的提純，但其中仍會(huì)含有少量的其他雜散蛋白質(zhì)。在當(dāng)前使用的高靈敏度檢測(cè)方法中，極微量的蛋白質(zhì)也能顯示反響。

17、 這說明，使用這種類型抗原的試驗(yàn)，雖然對(duì)結(jié)果能有明確的解釋，但仍然存在著交叉反響的可能性。4、精提純抗原當(dāng)前，已經(jīng)有一些疾病的抗體檢測(cè)中，使用高度提純的抗原?？赡苁翘烊坏?，也可能是克隆的蛋白質(zhì)，能夠到達(dá)“層析純的純度，即經(jīng)過電泳只能見到清晰的單 一蛋白質(zhì)條帶。使用這樣的抗原物質(zhì)進(jìn)行的檢測(cè)，可以得到最可靠的結(jié)果。然而，這仍然不能保證不同微生物之間具有共同抗原的可能性。 使用分子克隆方法獲取的蛋白質(zhì)，不能認(rèn)為就已經(jīng)是精提純的抗原。 因?yàn)槿魏慰寺《急仨氃谳d體中表達(dá)，不管表達(dá)的蛋白質(zhì)量有多大，其中還是會(huì)含有受體細(xì)胞或表達(dá)系 統(tǒng)中成分，這些成分仍然能夠引起交叉反響。還有一些疾病，抗原的特異性本身就不夠明

18、確，目前仍然需要通過蛋白印跡試驗(yàn)，不是通過明確的蛋 白質(zhì)種類，而是根據(jù)多種不明性質(zhì)的蛋白質(zhì)組成的圖形來確定診斷。在這樣的疾病，即使高度提純的抗原物質(zhì)也難于在監(jiān)測(cè)中應(yīng)用。四、抗體本地測(cè)定 無論開展得多么成熟的檢測(cè)方法，也無論提取得多么純粹的抗原，在大規(guī)模的疾病監(jiān)測(cè)中，還是會(huì)在 無疾病的人群或動(dòng)物中顯示一定程度的反響，這稱為抗體本底，誒一種新的方法投入使用前，都必須進(jìn)行 抗體本底測(cè)定。本底抗體可能有以下幾個(gè)主要的來源：1、雜散抗原致病微生物通常具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，其中許多是低特異性的，存在于許多微生物，甚至宿主機(jī)體之 中。這些雜散抗原能產(chǎn)生低滴度的抗體。 因而在根本沒有疾病流行的人群或動(dòng)物中，本底

19、抗體反映著其他類型的感染，甚至其他未知來源產(chǎn)生 的抗體。2、共同抗原 現(xiàn)代分子生物學(xué)說明，任何一個(gè)基因都是可能轉(zhuǎn)移的，多為的病原微生物，都是由于基因的轉(zhuǎn)移，從 其非致病的祖先轉(zhuǎn)化而來。盡管在檢測(cè)中采用了高度特異并且高度提純的抗原，這種抗原仍然可能存在著目前未知的其他來源。 這種來源的抗原，有時(shí)可以在無疾病個(gè)體中產(chǎn)生高滴度的抗體。3、既往感染 并非所有的本底抗體反響都源自非特異性，個(gè)體在感染后，抗體可能保持相當(dāng)長的時(shí)間，疾病在動(dòng)物 間的存在常常不被人所開掘，人類的感染也可能由于病癥輕微或時(shí)間久遠(yuǎn)而無從追溯，于是，這些疾病過 程所產(chǎn)生的抗體便成了本底抗體。進(jìn)行本底調(diào)查需要在一個(gè)已經(jīng)確認(rèn)沒有疾病流行

20、的地區(qū)，采取一定數(shù)量的“健康個(gè)體血清標(biāo)本，測(cè) 定其中的抗體，并計(jì)算反響的幾何平均抗體滴度?？贵w本底測(cè)定最主要的目標(biāo)，是建立疾病的安定標(biāo)準(zhǔn)。這需要積累一定數(shù)量的，經(jīng)過病原學(xué)確診的個(gè)體，測(cè)定病后不同時(shí)間的抗體水平，再與本底抗體水平相比擬，運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法確定期間的判別值。 只有這樣，抗體測(cè)定的方法才能夠在疾病診斷和監(jiān)測(cè)中實(shí)際應(yīng)用。第三節(jié) 細(xì)胞免疫檢查一、淋巴細(xì)胞的別離與類型鑒定體外檢測(cè)淋巴細(xì)胞，需要先制備外周血單個(gè)核細(xì)胞 PBMC ，制備 PBMC 常用的方法是葡聚糖 -泛影 葡胺淋巴細(xì)胞別離液密度梯度離心法。以下方法通過檢測(cè)淋巴細(xì)胞的某些外表標(biāo)志，可確定細(xì)胞的不同類型。1、免疫熒光法 常用直接或

21、間接免疫熒光法檢查淋巴細(xì)胞的外表標(biāo)志，鑒定細(xì)胞的群、亞群。如CD4+和CD8+細(xì)胞亞群，表達(dá) mlgD、mlgM的B細(xì)胞亞群。2、磁珠別離法 將抗細(xì)胞外表標(biāo)記的抗體交聯(lián)到磁珠顆粒，與細(xì)胞懸液反響后，磁珠通過抗體結(jié)合相應(yīng)的細(xì)胞群 或亞群外表，借助磁場(chǎng)，將磁珠結(jié)合的細(xì)胞與未結(jié)合的細(xì)胞分開。3、淘選法 將一直抗細(xì)胞外表標(biāo)記的抗體包被培養(yǎng)皿，加淋巴細(xì)胞懸液，表達(dá)響應(yīng)外表標(biāo)記的細(xì)胞即與相應(yīng)抗體 結(jié)合，而黏附于固相上，與懸液中的其他細(xì)胞分開。4、流式細(xì)胞術(shù)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行別離，借助熒光激活細(xì)胞分選器 FACS 對(duì)免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞進(jìn)行快速準(zhǔn)確 鑒定和分類技術(shù)。二、免疫細(xì)胞功能測(cè)定一 T 細(xì)胞功能測(cè)定1、

22、T 細(xì)胞增殖試驗(yàn)采用 3H-TdR 摻入法檢測(cè)。在PBMC中參加植物血凝素PHA丨共同培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前 815小時(shí)參加3H-TdR，由于3H-TdR能 摻入細(xì)胞合成的 DNA 中，細(xì)胞增殖的水平越高，摻入的放射性核素越高。用液體閃爍儀檢測(cè)細(xì)胞樣品中的放射活性，測(cè)定細(xì)胞的增值情況。2、細(xì)胞毒試驗(yàn) 1 51Cr 釋放法：用Na2CrO4標(biāo)記靶細(xì)胞，假設(shè)待檢效應(yīng)細(xì)胞能殺傷靶細(xì)胞，測(cè)51Cr從靶細(xì)胞內(nèi)釋放，用丫計(jì)數(shù)儀測(cè)定釋放的51Cr放射活性，靶細(xì)胞溶解破壞越多，51Cr釋放越多，上清液中的放射活性越低。 2乳酸脫氫酶釋放法： 將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按比例混合，靶細(xì)胞被殺傷后細(xì)胞膜受損，釋放出乳酸脫氫酶，

23、用光度計(jì)測(cè)定溶 液中的該酶的含量，反映效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性。 3 皮膚試驗(yàn)： 根據(jù)局部紅腫為特征的遲發(fā)型超敏反響的強(qiáng)度檢測(cè)。 常用的生物性抗原常從病原體中提取，如結(jié)核菌素、麻風(fēng)菌素等。二 B 細(xì)胞功能測(cè)定1、B細(xì)胞增殖試驗(yàn)B 細(xì)胞受絲裂原刺激后，進(jìn)行分裂增殖，溫育一定時(shí)間后檢查抗體形成細(xì)胞的數(shù)目。2、抗體形成細(xì)胞測(cè)定 常用溶血空斑試驗(yàn)測(cè)定。將SRBC、待檢B細(xì)胞、補(bǔ)體及適量瓊脂糖液混合，傾斜平皿，溫育13小時(shí)后，肉眼觀測(cè)分散的溶血空斑出現(xiàn)，每一空斑中央含一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑的數(shù)量即為抗體形成細(xì)胞數(shù)。三、免疫細(xì)胞因子測(cè)定細(xì)胞因子的檢測(cè)有助于了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，鑒定別離的淋巴細(xì)胞，監(jiān)測(cè)某些疾

24、病狀態(tài)的細(xì)胞 免疫功能。1、免疫學(xué)檢測(cè)法ELISPOT 測(cè)定法。FACS 分析法測(cè)定產(chǎn)生該細(xì)胞用細(xì)胞因子單克隆抗體包被固相的雙抗體夾心法或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn) 也可用熒光素標(biāo)記抗細(xì)胞因子抗體，對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子作染色，直接用因子的細(xì)胞比例。mRNA ，然后用特定引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行定性、定量檢2、RT-PCR 法 設(shè)計(jì)特定引物，逆轉(zhuǎn)錄特定細(xì)胞因子的 測(cè)。第四節(jié) 抗原檢測(cè)一、抗原檢測(cè)的目的1、疾病的快速診斷 由人或動(dòng)物的組織、器官或其他標(biāo)本中檢出病原微生物特征性的抗原成分，可以對(duì)某些疾病作出早期 診斷。2、病原微生物鑒定 別離獲得病原微生物后，可以通過抗原檢測(cè)確定其血清型，或者通過針對(duì)致病決定因

25、子的抗原檢測(cè)確 定其致病性。3、生物活性物質(zhì)的抗原分析提取的或人工合成的生物活性物質(zhì)，如果具有抗原性，都可以利用抗原檢測(cè)的方法確定其生物活性。二、抗原的檢測(cè)方法 在“抗體檢測(cè)一節(jié)中介紹的方法，都可以通過相反方向的運(yùn)用，即使用抗體，通過類似的方法 來進(jìn)行抗原檢測(cè)。三、單克隆抗體的應(yīng)用 與抗體檢測(cè)方法類似，用于檢測(cè)的抗體，決定了抗原檢測(cè)的特異性。 單克隆抗體的出現(xiàn)，使抗原測(cè)定稱為精確的免疫學(xué)方法。一種 B 淋巴細(xì)胞抗原刺激后只能產(chǎn)生一種抗體，因此稱其為單克隆抗體。 使用細(xì)胞雜交技術(shù)，使免疫的小鼠脾細(xì)胞，與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株可以在體 外條件下任意增殖，并產(chǎn)生專一的，融合的 B 淋巴細(xì)胞特異的抗體，從而使單克隆抗體成為一種實(shí)用的技 術(shù)。單克隆抗體的特點(diǎn)是： 理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)、便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容 易。單克隆抗體用于抗原檢測(cè)時(shí)能充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。單克隆抗體的特異性強(qiáng)， 大大提高了抗原 - 抗體反響的特異性， 減少了和其他物質(zhì)發(fā)生交叉反響的可能 性，使試驗(yàn)結(jié)果可信度更大。單抗的均一性和生物活