轉(zhuǎn)染體系的關(guān)鍵組分對細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗的效率有何影響

1、.轉(zhuǎn)染體系的關(guān)鍵組分對細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗的效率有何影響?！窘M織培養(yǎng)試劑】一般提示：優(yōu)化您的細(xì)胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并經(jīng)可能減少所用試劑的變更?；A(chǔ)培養(yǎng)基目前所使用的各種市售培養(yǎng)基（如，RPMI 1640和DMEM）。培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)（氨基酸，葡萄糖），維生素，無機鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果不在使用時新鮮加入就可能會產(chǎn)生問題。務(wù)必要使培養(yǎng)基避光保存。因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。酚紅試劑可保護細(xì)胞免受一些HEPES降解所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，但在使用未加酚紅試劑的培養(yǎng)基的應(yīng)用場合下，如熒光素酶的測定，細(xì)胞毒

2、性則仍然是一個問題。胎牛血清血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長促進因子和生長抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動物的年齡、營養(yǎng)水平、和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量。因此血清易受顯著生物學(xué)變異的影響。添加劑某些細(xì)胞的生長依賴于一些對生命力或細(xì)胞分裂必不可少的物質(zhì)（如，生長因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等）。CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞生長所需環(huán)境為37、相對濕度為95的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值。細(xì)胞生理對pH的變化非常敏感，因此多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5來有效控制pH值，而另一些則需要10的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對一下適

3、當(dāng)?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致（溫度、濕度和CO2）則會導(dǎo)致實驗結(jié)果的板間變異性。來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì)，或真菌細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理【細(xì)胞】一般提示：密切觀察您的細(xì)胞；確保它們狀態(tài)良好。在開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前，先制定一個適當(dāng)?shù)姆N板方案，使細(xì)胞密度從轉(zhuǎn)染開始到結(jié)束都保持最佳狀態(tài)。增加成功幾率細(xì)胞是轉(zhuǎn)染過程中的一個關(guān)鍵元素，它可以是影響結(jié)果的一致性和質(zhì)量的最重要的變量。為幫助解決這些問題，羅氏應(yīng)用科學(xué)部與ATCC®（美國菌種保藏中心）進行了合作。為保證將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)量，羅氏應(yīng)用科學(xué)部建議使用新近從ATCC®獲得的細(xì)胞系。分裂細(xì)胞相比較非

4、分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于生長過度的狀態(tài)。由于FuGENE® 6和HD轉(zhuǎn)染試劑對于細(xì)胞作用溫和，可同時進行貼壁細(xì)胞的種板和轉(zhuǎn)染。此外，還常用促有絲分裂刺激物（如，病毒轉(zhuǎn)化，生長因子，條件培養(yǎng)基，以及滋養(yǎng)細(xì)胞）來活化原代培養(yǎng)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。天生趨于懸浮的細(xì)胞（如HL 60，Jurkat）非常難以轉(zhuǎn)染。相反，天生為貼壁的細(xì)胞（如HEK，CHO）則可適應(yīng)懸浮生長的條件。這兩種細(xì)胞（即那些天然懸浮的和那些

5、適應(yīng)懸浮的細(xì)胞）的漿膜是不一樣的。據(jù)推測轉(zhuǎn)染過程中的一個限制步驟就是通過內(nèi)吞作用攝取轉(zhuǎn)染分子（DNA或RNA與轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物）；然而，目前對此尚未有分子水平上的合理機制的解釋。細(xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異可能是某些細(xì)胞類型天生難以轉(zhuǎn)染的部分原因。所以，尋找更有效轉(zhuǎn)染試劑的工作目前還主要是經(jīng)驗性的，尤其對于那些天生為懸浮的細(xì)胞而言更是如此。這常常是在不含血清而含有抑制轉(zhuǎn)染的特殊添加劑的培養(yǎng)基中發(fā)生。經(jīng)小心處理后，這些細(xì)胞可適應(yīng)于在沒有添加劑的環(huán)境中懸浮生長。如果這些適應(yīng)于懸浮生長的貼壁細(xì)胞在沒有這些添加劑的環(huán)境中生長，那么它們就可以被轉(zhuǎn)染。分批方案在對培養(yǎng)細(xì)胞進行分批傳代培養(yǎng)之前，必須把貼壁細(xì)胞用胰蛋白

6、酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害。因此分批方案的不同（如，胰蛋白酶消化時間的延長，胰蛋白酶的失活，以及消化后直到轉(zhuǎn)染開始的時間）都可能對轉(zhuǎn)染實驗有所影響。如果在轉(zhuǎn)染時細(xì)胞過于密集，那么種到培養(yǎng)板上的就會是細(xì)胞團塊而非單個細(xì)胞。對于某些細(xì)胞試劑組合而言，漿膜狀態(tài)被改變后有可能會影響到所用試劑和DNA的最佳配用量和配比。傳代次數(shù)傳代次數(shù)是指對一個細(xì)胞系進行分批傳代的頻度（通常在一個實驗室范圍內(nèi)）。在某些情況下，自建立細(xì)胞系起的確切傳代次數(shù)無法得知。某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較不穩(wěn)定，可能會隨著培養(yǎng)時間的延長而改變，視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而定。培養(yǎng)條件的不同可

7、引起克隆選擇。因此名稱相同的同一細(xì)胞系有關(guān)其生理學(xué)和形態(tài)學(xué)（以及轉(zhuǎn)染能力）性質(zhì)可能會有很大的差異。一般而言，細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。在不同細(xì)胞系之間轉(zhuǎn)染效率的變化很大。某些細(xì)胞系在傳代很大次后仍能保持穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率，而其他一些則傳代很少次數(shù)就表現(xiàn)出轉(zhuǎn)染效率的差異。細(xì)胞數(shù)量（匯聚度）只要培養(yǎng)基質(zhì)（組織培養(yǎng)皿）尚有空間，細(xì)胞就會按指數(shù)規(guī)律分裂。對于正常細(xì)胞而言，細(xì)胞生長的速度受細(xì)胞密度大小的抑制（接觸抑制），但癌細(xì)胞則不受此限制而會繼續(xù)生長并可互相疊加。營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細(xì)胞生長。細(xì)胞會因受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。報告基因的

8、表達率與轉(zhuǎn)染開始時的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞健康以及它們隨后直到細(xì)胞溶解之前的生長情況相關(guān)。培養(yǎng)物污染培養(yǎng)物可被細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類所污染。各種污染都會導(dǎo)致產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。支原體污染支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為5-35，它可改變細(xì)胞生長特性，酶的作用途徑，細(xì)胞膜的組成，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是，支原體對采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾，其結(jié)果致使轉(zhuǎn)染效率偏低或非典型。這些效應(yīng)會導(dǎo)致實驗結(jié)果的不可靠以及時間和珍貴細(xì)胞系的損失。和細(xì)菌及真菌不同，支原體污染無法通過視覺檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過大多數(shù)的無菌濾膜；它們還對常用抗生

9、素有抗藥性。所以必需進行支原體污染的常規(guī)篩查。羅氏應(yīng)用科學(xué)部提供支原體檢測試劑盒以幫助盡早發(fā)現(xiàn)支原體污染。交叉污染如果同一個實驗室同時培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。眾所周知有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種，幾個月過后它們就會完全取代目標(biāo)培養(yǎng)物。這種變化是逐漸發(fā)生的；而您可能甚至還未發(fā)現(xiàn)。建立細(xì)胞系鑒定的檢測標(biāo)準(zhǔn)。例如，對于人類細(xì)胞系而言，STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）圖譜就是一種可靠的鑒定方法。或者更簡單的解決方案就是，當(dāng)懷疑有交叉污染時，如果

10、有可能，就換用新鮮的，傳代次數(shù)少的細(xì)胞源?！据d體DNA】一般提示：對您純化所得的載體進行質(zhì)量檢查。確定支持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在對您細(xì)胞體系的參數(shù)進行測定時，一定要選用一種您已知具有功能的對照載體。載體的完整性種載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋中斷、核酸酶的降解，以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力的影響。載體制備物各種載體是按照不同的方案在細(xì)菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物（如CsCl，內(nèi)毒素）可能會影響轉(zhuǎn)染效率。載體構(gòu)造（啟動子增強子ORI）轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強病毒調(diào)節(jié)元件（如，RSV，CM

11、V，和 SV40）的對照載體進行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動子增強子體系的相對有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個數(shù)量級。例如，在某些細(xì)胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴增，SV40體系可高效表達 large T抗原（如，COS）；而在其他許多細(xì)胞系中，則是CMV啟動子更為有效。除此之外，各種CMV載體的表達率也會有超過一個數(shù)量級的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。【轉(zhuǎn)染方案】一般提示：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案；首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開始，然后通過改變試劑DNA的配比和形成復(fù)合物的數(shù)量進行優(yōu)化。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備諸如轉(zhuǎn)染試劑DNA配比，離子強度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和

12、功能。質(zhì)粒既可在無菌水又可在TE緩沖液中稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑，就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說明。需要對試劑提供方給予一定的信賴；除非您有很好的理由支持您做出改變，否則就應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照他們所推薦的轉(zhuǎn)染方案。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物；如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會對轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的最佳孵育時間是一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。轉(zhuǎn)染試劑DNA配比（負(fù)載比）所有的轉(zhuǎn)染試劑都會在某一個試劑DNA配比時最為有效。有時候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄；而且對于每種實驗體系都必須進行優(yōu)化才能得到最佳配比。為了尋找這種最佳

13、配比往往會花費大量的時間和金錢。除了配比的重要性之外，所加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物量的多少也非常關(guān)鍵。形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑對于多數(shù)試劑而言，很關(guān)鍵的一點是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基和鹽溶液中形成。FuGENE® HD 轉(zhuǎn)染試劑則是一個例外，因為它能在水中、不會血清的培養(yǎng)基中或含有10血清的培養(yǎng)基中生成復(fù)合物。如果您使用的是水或含有10血清的培養(yǎng)基，則應(yīng)保證它能適用于你特定的細(xì)胞體系。復(fù)合物數(shù)量對轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用的轉(zhuǎn)染試劑DNA復(fù)合物的量也應(yīng)當(dāng)進行優(yōu)化。如果用量太少，那么轉(zhuǎn)染DNA的表達就太弱；如果用量太多，則可能由于細(xì)胞毒性或其他作用反而降低蛋白的表達。最佳用量通常都必須進行實驗來確定。

14、這種影響用FuGENE® HD 轉(zhuǎn)染試劑進行實驗時尤其明顯。而用FuGENE® 6轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染時則是一個例外，因為它在一個很寬的轉(zhuǎn)染復(fù)合物用量范圍內(nèi)都會得到很好的轉(zhuǎn)染結(jié)果。在很多情況下，F(xiàn)uGENE® 6 轉(zhuǎn)染試劑的這種特性使得不再需要對轉(zhuǎn)染劑量進行優(yōu)化過程。所需要的轉(zhuǎn)染復(fù)合物用量與所用細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞越少，所需復(fù)合物就越少。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的加入有兩種替換方法可用來漿轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞：1. 將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者2. 將轉(zhuǎn)染復(fù)合物先用培養(yǎng)基稀釋，然后進行培養(yǎng)基更換操作。第一種方法更簡便，而第二種方法則更因為避免了試劑在局部濃聚而產(chǎn)生毒性，

15、所以會使結(jié)果的一致性更好。對于諸如FuGENE® 6 轉(zhuǎn)染試劑和HD轉(zhuǎn)染試劑這類的溫和試劑而言，您可以先將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)容器，然后再加入用胰蛋白酶新鮮消化得到的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染過程中所使用的培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)染效率可能會有正面或負(fù)面的影響。甚至對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方而言也是如此，尤其是在培養(yǎng)基中加入牛血清的情況下。胎牛血清的存在會使多種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率降低. 某些公司還提供可與轉(zhuǎn)染試劑配合使用的優(yōu)化無血清轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。而由羅氏應(yīng)用科學(xué)部所提供的轉(zhuǎn)染試劑則無論是否存在血清都能有效轉(zhuǎn)染。FuGENE® H D是獨一無二的能夠轉(zhuǎn)染保存在100血清中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑。如果有抗生素（如

16、，青霉素、鏈霉素、或兩性霉素B）存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，則轉(zhuǎn)染有效性會降低至25。因此，對于瞬時轉(zhuǎn)染，我們建議使用不加抗生素的培養(yǎng)基?！緯r間進度】一般提示：要確保最終結(jié)果的成功；建立一個合適的時間進度進行轉(zhuǎn)染實驗以保證您所需要的目標(biāo)蛋白能得到最佳表達。轉(zhuǎn)染的開始在轉(zhuǎn)染前12小時，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中。在轉(zhuǎn)染開始時，培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)有約50-80匯聚，這樣就可以使它們在實驗結(jié)束時達到接近100的匯聚。如果在轉(zhuǎn)染中去掉血清，細(xì)胞可能會暫時停止生長。細(xì)胞對轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時的時間內(nèi)完成。在這段時間后，就不會再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長。培養(yǎng)基更換某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染必須在沒有胎牛血清存在的條件下進行，那么這一步驟就必不可少。至于可在血清存在的情況下使用的無毒性轉(zhuǎn)染試劑（如，F(xiàn)uGENE® 6 轉(zhuǎn)染試劑或FuGENE® HD 轉(zhuǎn)染試劑）時，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達階段，就可以省略這一步。如果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在細(xì)胞中直到進行檢測，那么對有些細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率會有所提高，而另外一些細(xì)胞在轉(zhuǎn)染開始幾個小時之后其轉(zhuǎn)染效率就不會再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑DNA復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除，但在此后的長期生長階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉(zhuǎn)染細(xì)