細(xì)胞融合與單克隆抗體課件

1、細(xì)胞融合與單克隆抗體第一頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞融合概述細(xì)胞融合概述(i sh)第二頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞融合（細(xì)胞融合（cell fusion)，又稱體細(xì)胞雜交（somatic hybridiazation），是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過(tnggu)膜 融合形成單個(gè)細(xì)胞的過程。一、細(xì)胞融合的定義一、細(xì)胞融合的定義(dngy)第三頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體uMuller于1838年觀察到脊椎動(dòng)的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。uVirchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。uLug

2、inbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。uLange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。u1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有(jyu)觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。u1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。u20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。二、細(xì)胞融合研究進(jìn)展二、細(xì)

3、胞融合研究進(jìn)展第四頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體生物種類生物種類細(xì)胞來源細(xì)胞來源成功年代成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)青菜大豆馬唐草矮牽牛龍面花大麥花生大麥大豆小麥矮牽牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麥蠶豆大豆草香木犀酵母菌雞大豆煙草大豆秋水仙人胡蘿卜番茄馬鈴薯人小鼠葉葉葉根愈傷組織葉葉花瓣種子種子葉懸浮細(xì)胞葉花瓣葉懸浮細(xì)胞葉懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞葉根懸浮細(xì)胞葉原生質(zhì)體血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞葉懸浮細(xì)胞葉腹水癌細(xì)胞原生質(zhì)體葉根尖纖維肉瘤細(xì)胞畸胎瘤細(xì)胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種幾種(

4、j zhn)細(xì)胞融合成功的例子細(xì)胞融合成功的例子第五頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體植物融合植物融合(rngh)細(xì)胞成長狀態(tài)對(duì)比細(xì)胞成長狀態(tài)對(duì)比,右瓶為地面融右瓶為地面融合合(rngh)的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合合(rngh)的細(xì)胞的細(xì)胞 第六頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)(shyn)使用的小白鼠 第七頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體三、動(dòng)植物細(xì)胞三、動(dòng)植物細(xì)胞(xbo)的融合過程的融合過程植物植物(zhw)細(xì)胞融合過程細(xì)胞融合過程人造人造(rnzo)小鼠培育過程示意圖小鼠培育過程示意圖第八頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克

5、隆抗體四、細(xì)胞融合的意義四、細(xì)胞融合的意義(yy)u理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這 對(duì)于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。對(duì)于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。u融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間 的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。u體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分 裂和增殖過程中雙親的葉綠體

6、、線粒體裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新 的核外遺傳系統(tǒng)。的核外遺傳系統(tǒng)。u淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體(kngt)的制備。的制備。第九頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞融合的基本原理細(xì)胞融合的基本原理第十頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體顯微鏡下細(xì)胞融合過程顯微鏡下細(xì)胞融合過程(guchng)第十一頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體融合過程融合過程(guchng)中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程(guchng)圖解圖解第十二頁

7、，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物(dngw)細(xì)胞融合過程示意圖細(xì)胞融合過程示意圖 第十三頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞融合的常用細(xì)胞融合的常用(chn yn)方法方法第十四頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體一、仙臺(tái)病毒法一、仙臺(tái)病毒法仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4條件下病毒附著在細(xì)胞 膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚；在37中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)(fnyng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需 要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修

8、復(fù)，此時(shí)需Ca2+和ATP；融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP 。第十五頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體病毒促使細(xì)胞融合的主要病毒促使細(xì)胞融合的主要(zhyo)步驟如下：步驟如下：兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此(bc)靠近；通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體；進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。第十六頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體用滅活的病毒用滅活的病毒(bngd)誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過程示意圖誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過程示意圖 第十七頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體u 優(yōu)點(diǎn)是易得，用法

9、簡單，融合效果穩(wěn)定。u聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。uPEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培養(yǎng)液為1g重)，即成50PEG溶液。uPEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。u通常(tngchng)用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細(xì)胞。uPEG溶液在pH6.0時(shí)細(xì)胞融合率最高。二、聚乙二醇（二、聚乙二醇（PEG）法）法第十八頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程）法細(xì)胞融合過程(g

10、uchng)第十九頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體PEG的作用機(jī)理的作用機(jī)理： Kao等認(rèn)為，由于等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成(xngchng)H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成(xngchng)分子橋，其結(jié)果是分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。

11、 PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制(xinzh)。其。其缺點(diǎn)是融合過程繁瑣，缺點(diǎn)是融合過程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害?？赡軐?duì)細(xì)胞有毒害。第二十頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法細(xì)胞融合步驟細(xì)胞融合步驟（1）將兩種不同親本(qn bn)細(xì)胞各5l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；（4）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加

12、5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個(gè)直徑60mm平皿，每個(gè)平皿加培養(yǎng) 液至 5ml，37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）624小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。第二十一頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體第二十二頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體三、電融合法三、電融合法 電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：電融合法的優(yōu)點(diǎn)：u融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害小；u裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察(gunch)或錄像觀察(gunch)融合過程；u免

13、去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。第二十三頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體電融合的基本過程：電融合的基本過程：細(xì)胞膜的接觸：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場通電后，電流即通當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原

14、生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)(lin )緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。 第二十四頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體電融合誘導(dǎo)法原理電融合誘導(dǎo)法原理(yunl)示意圖示意圖第二十五頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體第三節(jié)第三節(jié) 雜種雜種(zzhng)細(xì)胞的篩選細(xì)胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生根據(jù)已經(jīng)發(fā)生(fshng)融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：其分為以下幾種類型：u異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。u同核細(xì)胞：兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。u多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。第二十六頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗

15、體u基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物(yow)抗性所建立的雜種篩選u基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選u由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選u具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選常用的雜種常用的雜種(zzhng)細(xì)胞篩選方法細(xì)胞篩選方法第二十七頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第二十八頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體一、何謂一、何謂(hwi)單克隆抗體？單克隆抗體？第二十九頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體第三十頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體第三十一頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體第三十二頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆

16、抗體只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子(fnz)稱為單克隆抗體稱為單克隆抗體。第三十三頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體 單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell)與經(jīng)特定與經(jīng)特定抗源免疫刺激的抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(antigen stimulated B lymphoblast)融融合得到雜交瘤細(xì)胞合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridoma cell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異

17、性抗體的能力。因此因此(ync)，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridoma technology ）。）。第三十四頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein 第三十五頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體二、雜交瘤技術(shù)二、雜交瘤技術(shù)(jsh)的基本原理的基本原理第三十六頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體三、雜交瘤細(xì)胞三、雜交瘤細(xì)胞(xbo)的制備的制備（一）骨髓瘤細(xì)胞（一）骨髓瘤細(xì)胞(xbo)選擇及選擇性培養(yǎng)基選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇選擇

18、(xunz)次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十七頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基(nj)喋呤（aminopterin， A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine， T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶(jmi)缺陷型（缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十八頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體（二）免疫（二）免疫(miny)小鼠小鼠 免疫程序是取6

19、8周齡BalbC雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次，35天后用于融合。免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理(chl)抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好。抗原量同樣與抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為loog，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對(duì)于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1l06一1107。第三十九頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體（三）脾細(xì)胞（三）脾細(xì)胞(xbo)的制備的制備(1)(1)引頸處死小鼠，用酒精引頸處死小鼠，用酒精(jijng)(jijng)消毒體表；消毒體表；(2)(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用無菌條件下取出脾臟，

20、剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)(3)把脾臟置于已消毒的把脾臟置于已消毒的9090一一100100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗， 令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml3ml無血清培養(yǎng)無血清培養(yǎng) 液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；(5)(5)把

21、細(xì)胞懸液注入把細(xì)胞懸液注入50ml50ml離心管中，加離心管中，加l0l0一一20ml20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中 置置5 5分鐘；分鐘；(6)(6)離心離心(800(800一一10001000轉(zhuǎn)分轉(zhuǎn)分) )計(jì)數(shù)、備用。計(jì)數(shù)、備用。第四十頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體（四）細(xì)胞（四）細(xì)胞(xbo)準(zhǔn)備準(zhǔn)備（1 1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3 3次次(37)(37)，計(jì)數(shù)活力，計(jì)數(shù)活力(hul)(hul)細(xì)胞細(xì)胞( (不少于不少于9090) )；（2 2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗）收集小鼠脾細(xì)胞，用無血清

22、培養(yǎng)液洗3 3次次(37)(37)，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測定活力細(xì)胞；，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測定活力細(xì)胞；（3 3）按）按1 1：5 5或或1 1：1010混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾 紙吸紙吸 凈多余上清。凈多余上清。第四十一頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體（五）細(xì)胞融合（五）細(xì)胞融合(1)將1ml 40的PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微 轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢(mn mn)加完20ml無血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損

23、傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5CO2，溫箱中37培養(yǎng)，24小時(shí)后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。第四十二頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體（六）融合（六）融合(rngh)后細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞培養(yǎng)(1)融合后710天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的) 后每隔23天 半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)23周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大、圓且透明；(4)待集落增殖生長(shngzhng)至13孔時(shí)，

24、應(yīng)進(jìn)行抗體檢測。第四十三頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基(nj)喋呤（aminopterin， A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine， T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷(quxin)型（型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第四十四頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體（七）抗體（七）抗體(kngt)檢測檢測免疫熒光試驗(yàn)(shyn)放射免疫試驗(yàn)(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)第四十五頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體（八）單克隆抗體（八）單克隆抗體

25、(kngt)的大量制備的大量制備體內(nèi)體內(nèi)(t ni)法法培養(yǎng)法培養(yǎng)法第四十六頁，共五十一頁。細(xì)胞融合與單克隆抗體四、單克隆抗體四、單克隆抗體(kngt)的應(yīng)用的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病 診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅(bjn)能大大降低生產(chǎn)成能大大降低生產(chǎn)成 本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛 在技術(shù)。在技術(shù)。單克隆抗體技