細(xì)菌與酵母表面展示技術(shù)

1、1細(xì)菌表面展示技術(shù)酵母表面展示技術(shù)第七組2定義：細(xì)菌表面展示技術(shù)是利用基因工程手段將某一蛋白或短肽段（靶蛋白）與微生物外膜蛋白（載體蛋白）以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在細(xì)胞表面。3外源蛋白與載體蛋白結(jié)合方式 C端融合端融合 (N端錨定在外膜端錨定在外膜) N端融合端融合 (C端錨定在外膜端錨定在外膜) 夾心融合夾心融合(有些蛋白有些蛋白本身具有信號(hào)肽序列本身具有信號(hào)肽序列及錨定于外膜的序列及錨定于外膜的序列，內(nèi)部合適位點(diǎn)插，內(nèi)部合適位點(diǎn)插 入外源蛋白入外源蛋白)4細(xì)菌表面展示系統(tǒng) 傳統(tǒng)：細(xì)菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面?zhèn)鹘y(tǒng)：細(xì)菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附屬結(jié)構(gòu)亞單位（如菌毛、鞭毛等）附屬結(jié)構(gòu)亞單位（如菌毛

2、、鞭毛等） 近年：冰晶核蛋白、自體運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白、近年：冰晶核蛋白、自體運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白、S2層蛋白等層蛋白等 每種展示系統(tǒng)都有自身的缺點(diǎn)（如展示每種展示系統(tǒng)都有自身的缺點(diǎn)（如展示蛋白大小的限制、錯(cuò)誤定位、形成包涵蛋白大小的限制、錯(cuò)誤定位、形成包涵體、外膜不穩(wěn)定等），因此需要開(kāi)發(fā)新體、外膜不穩(wěn)定等），因此需要開(kāi)發(fā)新的系統(tǒng)，以進(jìn)一步優(yōu)化表面展示系統(tǒng)。的系統(tǒng)，以進(jìn)一步優(yōu)化表面展示系統(tǒng)。5早期研究多集中在革蘭氏陰性菌。原早期研究多集中在革蘭氏陰性菌。原因是遺傳背景清楚，便于控制蛋白展因是遺傳背景清楚，便于控制蛋白展示示。但是從應(yīng)用上來(lái)看，革蘭氏陽(yáng)性菌的某些特性更適合于表面展示。如下表：6缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率低，限制構(gòu)建較

3、大容量的肽庫(kù)；一些革蘭氏陽(yáng)性菌分泌大量蛋白酶，這會(huì)給應(yīng)用帶來(lái)麻煩。7細(xì)菌表面展示技術(shù)，結(jié)合熒光激活細(xì)胞篩選儀或流式細(xì)胞篩選儀，是非常有效的高通量篩選方法。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 1、 能夠決定突變體庫(kù)中每個(gè)克隆的功能特性。能夠決定突變體庫(kù)中每個(gè)克隆的功能特性。 2、目前唯一能夠定量檢驗(yàn)單細(xì)胞水平和大量突變體催化目前唯一能夠定量檢驗(yàn)單細(xì)胞水平和大量突變體催化活性的方法?；钚缘姆椒ā?3、定量分析酶活性定量分析酶活性 4、同時(shí)檢測(cè)多個(gè)參數(shù)并且對(duì)每個(gè)觀(guān)察到的克隆進(jìn)行記錄。同時(shí)檢測(cè)多個(gè)參數(shù)并且對(duì)每個(gè)觀(guān)察到的克隆進(jìn)行記錄。與噬菌體相比：細(xì)菌表面展示技術(shù)在疫苗應(yīng)用上具有獨(dú)特優(yōu)與噬菌體相比：細(xì)菌表面展示技術(shù)在疫苗應(yīng)用

4、上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)；進(jìn)行更快速更高效篩選勢(shì)；進(jìn)行更快速更高效篩選8與傳統(tǒng)的生物陶選技術(shù)相比，熒光激活細(xì)胞篩選儀具有以下特色高富集比高陽(yáng)性率避免“親和效應(yīng)”9基于冰核蛋白的狂犬病毒糖蛋白細(xì)菌表面展示 冰核蛋白是丁香假單胞菌的外膜蛋白，可加速純水的冰晶形成，它通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨定在細(xì)菌表面，利于大分子蛋白的表面呈現(xiàn)。 狂犬病毒糖蛋白是病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的配體，介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞結(jié)合。而且是狂犬病毒的主要保護(hù)性抗原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，保護(hù)機(jī)體抵抗病毒感染。 方法：1 冰核蛋白N末端序列的PCR擴(kuò)增2 狂犬病毒糖蛋白序列的PCR擴(kuò)增3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建4 重組載體的表達(dá)（可以導(dǎo)入大腸埃希菌培養(yǎng)、菌體裂

5、解）5 蛋白表面展示的初步鑒定（結(jié)合ELISA，分光光度法鑒定重組蛋白是否成功展示在細(xì)胞表面）10綜上所述，細(xì)菌表面展示系統(tǒng)靈活多樣，操作簡(jiǎn)便，在多個(gè)領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用前景，隨著新的載體系統(tǒng)的發(fā)展和其自身的不斷完善，細(xì)菌表面展示技術(shù)必將在實(shí)踐中發(fā)揮更大的作用。11酵母表面展示技術(shù)酵母表面展示技術(shù)原理 酵母細(xì)胞表面展示技 術(shù)是近年來(lái)發(fā)展較快的一種真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其基本原理是將外源靶蛋白基因(外源蛋白) 與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞， 利用酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面的機(jī)制使靶蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。13簡(jiǎn)介： 酵母表面展示系統(tǒng)是繼噬菌體展示技術(shù)創(chuàng)立以后發(fā)展起來(lái)的展示系統(tǒng)。酵母的

6、蛋白質(zhì)折疊和分泌機(jī)制與哺乳動(dòng)物的細(xì)胞非常相似，對(duì)人的蛋白質(zhì)表達(dá)和展示具有優(yōu)越性。酵母細(xì)胞顆粒大，可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選和分離。目前報(bào)道的兩種酵母展示系統(tǒng)分別以-凝集素作為融合骨架。1.目的蛋白-凝集素表面展示系統(tǒng) 此系統(tǒng)將目的蛋白作為N端，與-凝集素C端部分融合，目的蛋白經(jīng)-凝集素展示酵母細(xì)胞表面。-凝集素共價(jià)連接到細(xì)胞壁的葡聚糖上，其錨定部位由蛋白質(zhì)C端320個(gè)氨基酸組成，富含Ser/Thr殘基。Ser/Thr富集區(qū)因廣泛存在的O-糖基化而擁有的一個(gè)桿狀構(gòu)象，可作為空間支持無(wú)發(fā)揮作用。 迄今，已有多個(gè)應(yīng)用-凝集素的C端作為融合蛋白的報(bào)道。第一個(gè)通過(guò)此系統(tǒng)表達(dá)的異源蛋白是-半乳糖苷酶。 15

7、Schreuder等將來(lái)自瓜兒豆膠的-半乳糖苷酶的基因插入到釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶分泌信號(hào)和-凝集素C端部分編碼序列之間。-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶-凝集素（-Gal-ACI）融合蛋白，均由固有的磷酸果糖激酶(PGK)啟動(dòng)子控制，并且是多拷貝的。批量培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)了細(xì)胞和生長(zhǎng)介質(zhì)中的酶活性，-半乳糖苷酶被高效分泌入培養(yǎng)介質(zhì)，而Gal-ACI融合蛋白主要與細(xì)胞有關(guān)。162.-凝集素-目的蛋白表面展示系統(tǒng) 這是一種將目的蛋白作為C端與-凝集素Aga2p亞基的N端融合的表面展示系統(tǒng)。-凝集素通過(guò)與-凝集素相似的連接錨定在細(xì)胞壁上。與-凝集素不同，-凝集素由兩個(gè)亞單位的糖蛋白組成。 酵母表面展示系統(tǒng)應(yīng)用在釀酒

8、酵母的-凝集素將外源蛋白質(zhì)展示與細(xì)胞表面。-凝集素由核心亞單位(Agalp)和結(jié)合亞單位(Aga2p)兩個(gè)亞單位組成，Agalp 共725個(gè)氨基酸，合成后被分泌到細(xì)胞外，與酵母細(xì)胞壁共價(jià)連接。Aga2p通過(guò)兩個(gè)二硫鍵與Agalp結(jié)合，外源蛋白通過(guò)與Aga2p的C端融合可展示在酵母細(xì)胞表面。17 天然-凝集素結(jié)合活性部位在Aga2p的C端，因此，此處代表了一個(gè)細(xì)胞外大分子的可及性區(qū)域和展示固定蛋白質(zhì)的有用位點(diǎn)。 酵母有兩種交配類(lèi)型MATa和MATa的單倍體細(xì)胞，這兩種細(xì)胞之間的相互交配融合是通過(guò)細(xì)胞表達(dá)-凝集素和-凝集素的相互作用介導(dǎo)的。18 目前，酵母表面展示技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子的相互識(shí)別、定向進(jìn)化以及新型疫苗的研制等發(fā)面。蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化：酵母表面展示系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)親和力和穩(wěn)定性的定型進(jìn)化已有成功報(bào)道，最先被用于抗體的親和力成熟;活的口服疫苗：在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)易于接近抗體，因此，可被免疫系統(tǒng)識(shí)別，即使很小的肽，當(dāng)展示在細(xì)胞表面時(shí)，也具有免疫原型。因而可通過(guò)在酵母表面表達(dá)異質(zhì)性的抗原蛋白來(lái)發(fā)展疫苗。 酵母是個(gè)足夠大的顆粒，可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選和分離，這就使得基于特異定量親和力改變的的突變體分離成為可能。由于酵母展示的蛋白質(zhì)是緊密錨定在細(xì)胞壁上，可以耐受SDS等的抽取，同時(shí)酵母有發(fā)酵特性且生長(zhǎng)快，因此在工業(yè)上具有很