核酸含量測定ppt課件

1、生物儀器分析技術(shù)生物儀器分析技術(shù)核酸含量測定核酸含量測定紫外分光光度法紫外分光光度法主講教師：林葉副教授實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康? 學(xué)習(xí)和掌握運(yùn)用紫外分光光度法直接測定核酸含量與純度的原理與技術(shù)；2 熟習(xí)核酸定量分析儀的根本原理與運(yùn)用。型號(hào)：型號(hào)：GeneQuant pro GeneQuant pro 品牌：通用品牌：通用GEGE產(chǎn)地：美國產(chǎn)地：美國波長校準(zhǔn)：啟動(dòng)后自動(dòng)波長校準(zhǔn)：啟動(dòng)后自動(dòng)進(jìn)展進(jìn)展 波長范圍：波長范圍：230, 260, 280, 320,546,562, 595,600nm 核酸定量分析儀DNA/RNA計(jì)算器用用 途途1核酸和引物樣品掃描測定；2可檢測低至20ng 的核酸樣品用7微升

2、超微量比色杯，顯示A260/280和A260/230比值作為核酸純度檢測的目的 ；3可采用在 595nm 的Bradford 法、546nm 的雙縮脲法和562nm 的BCA 法進(jìn)展蛋白檢測，樣品經(jīng)過存貯的規(guī)范曲線進(jìn)展丈量，直線的線性回歸結(jié)果可打印出來；4OD600 細(xì)菌細(xì)胞培育測定；5計(jì)算寡核苷酸分子量，實(shí)際Tm值用于PCR退火溫度。l546nm雙縮脲法/lowry法Folin-酚法 l雙縮脲法：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成藍(lán)紫色復(fù)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比。 llowry法的顯色原理與雙縮脲方法是一樣的，只是參與了第二種試劑，即Folin酚試劑，以添加顯色量，從而提高了檢

3、測蛋白質(zhì)的靈敏度。在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基復(fù)原，產(chǎn)生深藍(lán)色鉬蘭和鎢蘭的混合物。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。 l562nmBCA法l在堿性條件下，蛋白質(zhì)將Cu2+ 復(fù)原為Cu+ ,Cu+ 與BCA 試劑構(gòu)成紫色絡(luò)合物，其吸光值與蛋白濃度成正比。l595nm考馬斯亮蘭法Bradford法 l考馬斯亮藍(lán)G-250在游離形狀下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收，其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。lOD600 檢測細(xì)菌培育液的濃

4、度l利用細(xì)菌的吸光來丈量細(xì)菌培育液的濃度，從而估計(jì)細(xì)菌的生長情況，所以通常用來指菌體細(xì)胞密度。l丈量細(xì)菌培育液在600nm處的吸光值，得到的OD600的數(shù)值假設(shè)在0.6-0.8之間，闡明細(xì)菌處于旺盛生長的對(duì)數(shù)生長期，OD6003闡明細(xì)菌曾經(jīng)飽和。l細(xì)菌的生長情況,可以經(jīng)過測OD600來監(jiān)測。細(xì)菌的生長比較好的時(shí)期是在OD600為1時(shí)，此時(shí)可以進(jìn)展傳代等研討。 比色杯l參數(shù)設(shè)定參數(shù)設(shè)定lDNAlSet-uplSelect 修正參數(shù)修正參數(shù)lEnter確認(rèn)確認(rèn)l設(shè)定空白設(shè)定空白l將空白溶液參與比將空白溶液參與比色杯中色杯中l(wèi)Set refl核酸含量和純度測定l將待測核酸樣品按照比例稀釋后，參與比色

5、杯中l(wèi)DNA 或 enter實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 核酸、核苷酸及其衍生物的分子構(gòu)造中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)-C=C-C=C-，可以劇烈吸收250-280nm 波長的紫外光。 核酸DNA、RNA的最大紫外吸收值在260nm 處。遵照Lambert-Beer 定律，可以利用紫外光吸收值的變化來測定核酸物質(zhì)的含量。Lambert-Beer 定律定律 光吸收根本定律光吸收根本定律 l當(dāng)一束平行的單色光經(jīng)過溶液時(shí)，溶液的吸光度 A 與溶液的濃度 C 和厚度 b 的乘積成正比。它是分光光度法定量分析的根據(jù)。 l在不同pH 溶液中，嘌呤、嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差別，它

6、們的摩爾消光系數(shù)也隨之不同。所以，在測定核酸物質(zhì)含量時(shí)均應(yīng)在固定的pH溶液中進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理堿基的互變異構(gòu)堿基的互變異構(gòu)l嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互變異構(gòu)景象，普通生理pH條件下呈酮式。l互變異構(gòu)會(huì)使堿基間發(fā)生錯(cuò)配，使A-C、T-G等 。l當(dāng)胸腺嘧啶以正常方式即酮基型為模板時(shí)，配對(duì)的互補(bǔ)堿基為腺嘌呤；當(dāng)前者變?yōu)橄┐夹蜆?gòu)造時(shí)，經(jīng)過氫鍵配對(duì)的堿基可變?yōu)轼B嘌呤。采用紫外分光光度法測定核酸含量時(shí)，通常規(guī)定：在260nm 波長下，10mm光徑的比色杯中，光密度為1.0的DNA或RNA溶液的濃度為50或40g/ml 。因此，測定未知濃度的DNARNA溶液在OD260nm的吸光度值，即可計(jì)算測出其中核

7、酸的含量。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理DNA濃度計(jì)算 DNA濃度濃度g/mL系數(shù)系數(shù)Abs260系數(shù)系數(shù)=光徑光徑稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)lOD230 表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、苯酚等，Tris，EDTA和其他緩沖液的鹽在這個(gè)波長都有吸收；lOD320 表示檢測溶液的混濁度和其他干擾因子，純樣品OD320普通是0，假設(shè)溶液鹽濃度越高，OD320的數(shù)值也越高。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理lOD260/OD280的比值用于評(píng)價(jià)核酸樣品的純度l純真的DNA OD260/OD2801.8l純真的RNA OD260/OD2802.0l比較純真的核酸樣品 l OD260/OD230 2.0l假設(shè)有小分子及鹽離子存在，如核苷

8、酸、氨基酸、酚等l OD260/OD230 2.0實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理植物基因組植物基因組DNADNA提取提取產(chǎn)品簡介產(chǎn)品簡介 本試劑盒適用于從多種植物的不同組織中快速提取基因組本試劑盒適用于從多種植物的不同組織中快速提取基因組DNA，特別適用于多酚、多糖含量高的植物組織和植物干粉。離，特別適用于多酚、多糖含量高的植物組織和植物干粉。離心柱中獨(dú)特的硅基質(zhì)資料和其配備的緩沖溶液能有效去除植物組心柱中獨(dú)特的硅基質(zhì)資料和其配備的緩沖溶液能有效去除植物組織中多糖、多酚復(fù)合物和酶抑制劑，純化過的基因組織中多糖、多酚復(fù)合物和酶抑制劑，純化過的基因組DNA可直接可直接用作用作PCR模板、酶切、雜交等分子生物學(xué)實(shí)

9、驗(yàn)。模板、酶切、雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)品特點(diǎn)產(chǎn)品特點(diǎn) 簡單快速：簡單快速：1 小時(shí)內(nèi)即可獲得超純的基因組小時(shí)內(nèi)即可獲得超純的基因組DNA。 純度高、質(zhì)量好：純化過的基因組純度高、質(zhì)量好：純化過的基因組DNA 可直接用作可直接用作PCR 模板、模板、酶切、雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。酶切、雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)品運(yùn)用產(chǎn)品運(yùn)用 運(yùn)用廣泛，可運(yùn)用于多種植物的多種組織運(yùn)用廣泛，可運(yùn)用于多種植物的多種組織 特別適宜于多糖、多酚含量高的植物特別適宜于多糖、多酚含量高的植物 特別適宜于植物干粉特別適宜于植物干粉保管條件保管條件: 室溫室溫1 取大豆粉100mg，參與700l 65預(yù)熱的GP1溶液，迅速顛倒混勻

10、后，將離心管放在65水浴20min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；2 參與700l氯仿，充沛混勻，12000rpm 離心5min；3 小心地將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，參與700l緩沖液GP2，充沛混勻；4 將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12000rpm 離心30s，棄掉廢液；5 向吸附柱CB3中參與500l緩沖液GD，12000rpm 離心30s，棄掉廢液，將吸附柱CB3放入搜集管中；操作步驟操作步驟6 向吸附柱CB3中參與700l 漂洗液PW，12000rpm 離心30s，棄掉廢液，將吸附柱CB3放入搜集管中；7 向吸附柱CB3中參與500l 漂洗液PW，12000rpm 離心30s，棄掉廢液；8 將吸附柱CB3放入搜集管中， 12000rpm 離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附資料中剩余的漂洗液；9 將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200l 洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min， 12000rpm 離心2min，將溶液搜集到離心管中。操