環(huán)境生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義(1)

1、實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌淀粉酶和過(guò)氧化氫酶定性測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)的反應(yīng)原理和用途。了解淀粉酶試驗(yàn)的反應(yīng)原理和用途。通過(guò)對(duì)淀粉酶和過(guò)氧化氫酶的定性測(cè)定，加深對(duì)酶和酶促反應(yīng)的感性認(rèn)識(shí)。二、實(shí)驗(yàn)原理酶是微生物機(jī)體內(nèi)生物合成的一種生物催化劑，它是高分子蛋白質(zhì)，具有催化生物化學(xué)反應(yīng)加速進(jìn)行，并具有傳遞電子、原子和化學(xué)基團(tuán)的作用。微生物的酶按它所在細(xì)胞的部位分為胞外酶、胞內(nèi)酶及表面酶。本實(shí)驗(yàn)對(duì)胞外酶中的兩種即淀粉酶和過(guò)氧化氫酶(亦叫接觸酶)進(jìn)行定性測(cè)定。細(xì)菌淀粉酶能將遇碘呈藍(lán)色的淀粉水解為遇碘不顯色的糊精，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為糖，淀粉被酶催化分解后用碘檢測(cè)不到其變色現(xiàn)象；過(guò)氧化氫酶能將過(guò)氧化氫快速分解為水

2、和氧氣，能用肉眼很容易的觀測(cè)到產(chǎn)生的氣泡。三、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑試管(15mm-150mm)5支、試管架1個(gè)、培養(yǎng)皿(90mm)3套、接種環(huán)。肉膏胨淀粉瓊脂培養(yǎng)基(1L) : 蛋白胨 10g、Nacl 5g、牛肉膏 5g、 可溶性淀粉 2g、 瓊脂 15g、 蒸餾水定容到1000ml 121 滅菌20min。4淀粉溶液1滴瓶:4g可溶性淀粉加水至100ml革氏碘液1滴瓶:碘1g、KI 2g、蒸餾水300ml （將I與KI先行混合，加入蒸餾水少許充 分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300ml。9過(guò)氧化氫1滴瓶：30過(guò)氧化氫 30ml 蒸餾水 70ml枯草桿菌和大腸桿菌斜面各一支?；钚晕勰嗨?、實(shí)驗(yàn)方

3、法(一)生活污水活性污泥混合液中淀粉酶的測(cè)定取3支干凈的試管，按1、2、3對(duì)照編號(hào)。放在試管架上備用。在1號(hào)、2號(hào)試管內(nèi)分別加入 5ml、10ml的活性污泥混合液，再在1號(hào)和2號(hào)試管中分別加10 ml和5 ml蒸餾水。在對(duì)照管內(nèi)加15 ml蒸餾水。在1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)及對(duì)照管中分別加入4的淀粉液4滴(淀粉液的用量，在做預(yù)備實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)樣品中淀粉酶含量多少而定)，迅速搖勻并記下反應(yīng)的初始時(shí)間。在上述3個(gè)管內(nèi)分別加4滴碘液(碘液用量在預(yù)備實(shí)驗(yàn)時(shí)酌定)，迅速搖勻，這時(shí)各管均呈藍(lán)色。觀察結(jié)果。注意各管的變化，記下各管藍(lán)色完全消失時(shí)的時(shí)間(即淀粉酶和淀粉反應(yīng)完全的時(shí)間)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。(二)細(xì)菌淀粉酶在

4、固體培養(yǎng)基中的擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)將肉膏胨淀粉瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待冷至45左右倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)(每皿約10 ml)，共倒3個(gè)，靜置待冷凝即成平板。在無(wú)菌操作條件下，用接種環(huán)分別挑取枯草桿菌、大腸桿菌和活性污泥各一環(huán)分別在3個(gè)平板上點(diǎn)種5個(gè)點(diǎn)。倒置于37恒溫箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。觀察結(jié)果，取出碘液，分別在3個(gè)平板內(nèi)菌落周?chē)渭?0ul碘液，觀察菌落周?chē)伾淖兓?。若在菌落周?chē)幸粋€(gè)無(wú)色的透明圈，說(shuō)明該細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶并擴(kuò)散到基質(zhì)中去。若菌落周?chē)詾樗{(lán)色，說(shuō)明該細(xì)菌不產(chǎn)生淀粉酶。(三)過(guò)氧化氫酶的定性測(cè)定將配備的斜面培養(yǎng)基接種枯草桿菌、大腸桿菌37恒溫箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。用滴管吸取過(guò)氧化氫滴加入到菌落上，觀察菌落是否有氣泡

5、。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告把所觀察到的現(xiàn)象記錄下來(lái)，進(jìn)行分析。六、思考題淀粉酶定性測(cè)定中對(duì)照應(yīng)呈什么顏色?為什么?各菌落呈什么顏色?為什么? 各菌落滴加過(guò)氧化氫后呈什么現(xiàn)象?說(shuō)明什么問(wèn)題?實(shí)驗(yàn)二 處理生活污水的活性污泥微生物總DNA的提取一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆窄h(huán)境樣品DNA提取技術(shù)。掌握瓊脂糖電泳的檢測(cè)原理和方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理：活性污泥是一種以好氧性細(xì)菌為主體的微生物和水中的懸浮物質(zhì)、膠體物質(zhì)混雜在一起形成的肉眼可見(jiàn)的絮狀顆粒，它是廢水生物處理過(guò)程的主體。環(huán)境樣品的微生物總DNA的提取和純化方法主要由兩部分組成：1.溫和裂解細(xì)胞及溶解DNA的技術(shù)，包括物理、化學(xué)或酶解作用裂解細(xì)胞，是DNA釋放出來(lái)。2.在

6、環(huán)境樣品DNA得到充分釋放后，通常采用幾種化學(xué)和酶學(xué)方法中的任一種來(lái)去除雜蛋白、RNA及其他的大分子。瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)使不同大小的DNA分子分離，把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。溴化乙錠（EB）在紫外光照射下發(fā)射熒光，EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物。三、 實(shí)驗(yàn)儀

7、器和試劑：儀器：核酸電泳系統(tǒng)，凝膠成像分析系統(tǒng)，離心機(jī)，移液器，水浴鍋，渦旋振蕩器，EP管。試劑：1、0.1%磷酸鈉緩沖液（PH 8.0）100ml ：1M Na2HPO4 93.2ml、1M NaH2PO4 6.8 ml，加熱配制。2、溶菌酶。3、20% SDS 100ml：20g SDS 加滅菌水定容至100ml，加熱。4、70%乙醇：70ml無(wú)水乙醇，加滅菌水30ml。5、TE緩沖液（PH 8.0）：1M Tris-cl 500ul， 0.2M EDTA 250ul，滅菌水49250ul6、異丙醇，7、8mol/LKAc溶液：392.56g KAC 加滅菌水500ml，121滅菌20mi

8、n。8、1kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。9、1%瓊脂糖：0.5g 瓊脂糖加5ml 10TBE，45ml水。10、10TBE： Tris-base 54g、Boric Acid 27.5g、Na2EDTA 4.65g 加蒸餾水定容至500ml，用HCL調(diào)PH 8.311、核酸上樣緩沖液：10ladder四、 實(shí)驗(yàn)方法：1、 取1g活性污泥，離心12000rpm 3min 去上清，滅菌水洗滌2次，10000rpm 3min,去上清。加1ml 0.1mol/L PH8磷酸鈉緩沖液,漩渦震蕩器震蕩20min。2、 加溶菌酶5mg，使終濃度為2.5mg/ml，振蕩5min,37水浴30min。3、 加120u

9、l20%SDS輕柔振蕩15min，6000rpm離心10min。4、 取上清液加0.2倍體積冰冷的8MKAc，顛倒混勻1min，12000rpm離心10min。5、 吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍體積冰冷的異丙醇，顛倒混勻1min，室溫下放置10min，12000rpm離心10min。6、 去上清，加1ml 70% 乙醇洗滌DNA 沉淀，12000rpm離心2min，去乙醇后于37干燥 10min。7、 重復(fù)做第6步8、 每管加100 ul TE+400ul滅菌水+0.6倍體積冰冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，12000rpm離心10min。9、 棄上清液，將沉淀定容于200

10、ulTE緩沖液中，加0.2倍體積8M KAC，顛倒混勻，室溫靜置5min，12000rpm離心10min。10、 吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍體積冰冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，12000rpm離心10min。11、 棄上清液，用1ml 70% 乙醇洗滌DNA 沉淀、12000rpm離心10min，干燥，溶于200 ul TE緩沖液中。12、 吸取20ul DNA溶液，在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測(cè)DNA提取效果。加上1kbMaker作為DNA大小的標(biāo)準(zhǔn)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告把在1%瓊脂糖凝膠觀察到的現(xiàn)象記錄下來(lái)，進(jìn)行分析。六、思考題SDS和乙酸鉀的作用? 不同濃度的瓊脂糖凝膠

11、電泳的分辨率?實(shí)驗(yàn)三 微生物總DNA中的16SrDNA PCR擴(kuò)增技術(shù)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庖酝ㄟ^(guò)引物進(jìn)行16SrDNA PCR擴(kuò)增的基本原理掌握從活性污泥微生物總DNA中進(jìn)行16SrDNA PCR擴(kuò)增的方法二、 實(shí)驗(yàn)原理RCR是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA的方法，類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。在本實(shí)驗(yàn)中，PCR擴(kuò)增的模板是從活性污泥中提取的微生物總DNA，擴(kuò)增的目的序列是微生物16SrDNA的V3區(qū)。采用的引物是細(xì)菌的一對(duì)通用引物，正向引物338F:5-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG

12、GCG GGG GCG CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3。反向引物518R：5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3。其中，正向引物338F的5端連接有40bp的GC 發(fā)夾，以增加DNA解鏈區(qū)的GC含量，提高解鏈溫度。三、 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑樣品從活性污泥中提取得到的微生物總DNA。儀器及相關(guān)用品PCR擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳所需的設(shè)備，凝膠成像分析系統(tǒng)，移液槍及吸頭，PCR管，高速離心機(jī)。試劑Taq DNA 聚合酶，10PCR反應(yīng)緩沖液，MgCl2 25mmol/L,四種dNTP混合物各為2.5mmol/L。引物：正向引物及反向引物（濃度為25

13、pmol/L），滅菌的去離子水。模板：從活性污泥中提取得到的微生物總DNA，用滅菌的去離子水稀釋10倍后用作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1kbDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：1.0瓊脂糖；核酸上樣緩沖液。四、 實(shí)驗(yàn)方法1. 建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為50ul，向PCR反應(yīng)管中依次加入以下試劑：10PCR反應(yīng)緩沖液5ul；dNTPs 2ul；MgCl25ul；引物各1ul；模板1ul；Taq DNA 聚合酶2.5U; 去離子水35ul。在做上述實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，以去離子水代替擴(kuò)增模板做一次陰性對(duì)照。2設(shè)置PCR反應(yīng)條件 95（5min） 95（1min）55（1min）72（1min）35個(gè)循環(huán)72（

14、10min）4備用3.電泳檢查結(jié)果 PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5ul反應(yīng)液在1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。DNA上樣時(shí)，加上DNA分子量標(biāo)記作為判斷PCR產(chǎn)物大小的參照物。五、 實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 簡(jiǎn)述通用引物進(jìn)行16SrDNA PCR擴(kuò)增的基本原理2. 進(jìn)行結(jié)果和觀察、記錄與分析。六、 注意事項(xiàng)1. 在配制PCR反應(yīng)體系的過(guò)程中，應(yīng)在加入dNTP混合物后再加入Taq DNA 聚合酶，因?yàn)橛行┟傅?5外切酶的活性較強(qiáng)，如果反應(yīng)體系中不含dNTP，可能導(dǎo)致引物分解。2. 應(yīng)對(duì)吸頭和PCR管進(jìn)行高壓滅菌，每次操作前必須更換吸頭，以免試劑相互污染。七、 思考題1. 以細(xì)菌通用引物進(jìn)行16SrDNA PC

15、R擴(kuò)增的目的是什么？2. 影響PCR擴(kuò)增效率的因素有哪些？3. 如果出現(xiàn)非特異性的DNA條帶，可能的原因有哪些？ 實(shí)驗(yàn)四 土壤中微生物數(shù)量的監(jiān)測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)土壤懸液的稀釋方法掌握土壤微生物數(shù)量的檢測(cè)方法二、實(shí)驗(yàn)原理土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境，它具有微生物所需的一切營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微生物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖及生存的各種條件，所以土壤中的微生物的數(shù)量和種類(lèi)都很多，它們參與土壤中的氮、碳、硫、磷等的礦化作用，使地球上的這些元素能被循環(huán)使用。此外，土壤微生物的活動(dòng)對(duì)土壤的形成、土壤肥力和作物生產(chǎn)都有非常重要的作用，因此，查明土壤中的微生物的數(shù)量及其組成情況，對(duì)發(fā)掘土壤微生物資源和對(duì)土壤微生物實(shí)行定向控制無(wú)疑是

16、十分必要的。三、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑1. 培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基: 牛肉膏 1g、酵母膏 2g、蛋白胨 5g、NaCL 5g、瓊脂 15g、加水定容至1000ml調(diào)PH為74查氏培養(yǎng)基：NaNO3 2g 、K2HPO4 1g 、KCl 0.5g 、MgSO4 0.5 g 、FeSO4 0.01g、蔗糖 30 g、 瓊脂 1520 g 、水 1000 mL 、pH 6.7 2. 滅菌稀釋水、滅菌吸管、滅菌培養(yǎng)基3. 土壤樣品、天平、稱(chēng)量紙四、實(shí)驗(yàn)方法1. 取新鮮土壤樣品10g，加入90ml無(wú)菌水中，塞上滅菌塞子，在搖床上震蕩10min，制成土壤懸液。2. 按10倍稀釋法，將上述土壤懸液稀釋至10-6。3.

17、分別吸取10-2、10-3的稀釋土壤懸液0.1ml，至滅菌培養(yǎng)基中。4. 將加熱完全融化后冷卻至45的查氏瓊脂培養(yǎng)基傾入已加有稀釋土壤懸液的平皿中約15ml，搖勻后平置，待其固化。5. 按同樣方法吸取10-5、10-6的稀釋土壤懸液0.1ml，至滅菌平皿中，傾入營(yíng)養(yǎng)瓊脂。6. 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板倒置后于28培養(yǎng)，查氏平板于25培養(yǎng)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告根據(jù)平板上的菌落數(shù)與平皿中土壤懸液稀釋倍數(shù)算得每克土壤中的微生物數(shù)量。六、注意事項(xiàng)1. 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上長(zhǎng)出的菌落以土壤中異養(yǎng)細(xì)胞占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，對(duì)偶然出現(xiàn)的霉菌和放線菌菌落可根據(jù)菌落外現(xiàn)形態(tài)特征的差異而將其刪除，必要是可挑取菌落培養(yǎng)物制成懸滴標(biāo)本后加以觀察。2.

18、查氏培養(yǎng)基含有3蔗糖，它能抑制大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)，而霉菌和放線菌能忍受高滲透壓，故能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所得菌數(shù)為霉菌和放線菌的菌數(shù)。七、思考題1.為什么說(shuō)土壤是微生物最好的培養(yǎng)基？2.如何進(jìn)行土壤中的微生物的分離和計(jì)數(shù)？實(shí)驗(yàn)八 油煙污染物降解菌的分離一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆沼孟♂屍桨宸蛛x法分離可降解環(huán)境污染物的微生物；掌握用劃線法分離微生物；掌握菌體分離的原理和方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理：油煙污染物由多種有害物質(zhì)組成，不易于降解。但在長(zhǎng)期受油煙污染的土壤中存在著降解油煙的降解菌。故以受油煙污染的土壤為菌體來(lái)源分離其降解菌。菌種分離純化的方法有：稀釋混合倒平板法、稀釋涂布平板法、平板劃線分離法、稀釋搖管法、液體培養(yǎng)基分離法、單細(xì)胞分離法和選擇培養(yǎng)分離法等。最常用的為劃線法和稀釋法。油煙污染物降解菌可在以金龍魚(yú)油為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株。為了獲得純種，必須進(jìn)一步進(jìn)行分離純化。三、 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑儀器：培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、接種環(huán)、涂布棒、磁力攪拌器、恒溫培養(yǎng)箱、試劑：長(zhǎng)期受油煙污染的土壤樣品（飯店排油煙口的土壤）、金龍魚(yú)油、富集培養(yǎng)基（%）：100ml蛋白胨1.0g，牛肉膏0.4g，KH