第七章 免疫學方法及其應用

1、英國醫(yī)生英國醫(yī)生 Jenner 17961796年首年首例接種牛例接種牛痘預防天痘預防天花花第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用病原微生物感染病原微生物感染機體對抗機體對抗免疫免疫幾個基本概幾個基本概念念免疫免疫(immunity)：是人和動物機體的一種是人和動物機體的一種保護性反應，保護性反應，其作用是其作用是“識別識別”和排除抗原性和排除抗原性“異物異物”，以維持機，以維持機體生理的平衡和穩(wěn)定。體生理的平衡和穩(wěn)定。免疫學：免疫學：研究機體自我識別和對抗原性異物排斥反應研究機體自我識別和對抗原性異物排斥反應的一門科學。的一門科學。傳統(tǒng)的免疫概念：傳統(tǒng)的免疫概念：機體抵抗病原微生

2、物的能力，即機體抵抗病原微生物的能力，即抗傳染免疫抗傳染免疫1.1.免疫免疫和免疫學和免疫學幾個基本概念幾個基本概念2.2.免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)：免疫系統(tǒng)：具有自身的運行機制并可與其他系統(tǒng)相互具有自身的運行機制并可與其他系統(tǒng)相互配合、相互制約，共同維持機體在生命過程中總的生配合、相互制約，共同維持機體在生命過程中總的生理平衡。理平衡。免疫系統(tǒng)的任務是消滅免疫系統(tǒng)的任務是消滅“異己異己”“異己異己”來自兩個方面來自兩個方面: :(1)(1)外來的入侵者：外來的入侵者： 侵入身體的各種侵入身體的各種致病菌致病菌包括哪些？包括哪些？(2)“(2)“變壞了的變壞了的”自身細胞。自身細胞。 細胞癌變

3、細胞癌變免疫系統(tǒng)的生理功能免疫系統(tǒng)的生理功能免疫防御免疫防御機體機體排斥排斥外源性抗原異物的能力。外源性抗原異物的能力。免疫自穩(wěn)免疫自穩(wěn)機體機體識別和清除識別和清除自身衰老殘損的組織自身衰老殘損的組織 、細胞，維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。、細胞，維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。免疫監(jiān)視免疫監(jiān)視機體機體殺傷和清除殺傷和清除異常突變細胞，機體異常突變細胞，機體 監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長。監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長。(1)(1)探針帶來探針帶來 細菌入侵細菌入侵(2)(2)吞噬細胞趕吞噬細胞趕 赴赴“現(xiàn)場現(xiàn)場”(3)(3)消滅入侵消滅入侵恢復健康恢復健康 4.4.機機體防御機制體防御機制人體第一道防線人體第一道防

4、線天然免疫天然免疫(非特異性免非特異性免疫疫)屏障結(jié)構(gòu)、非特異性免疫細胞和免疫分子組成。屏障結(jié)構(gòu)、非特異性免疫細胞和免疫分子組成。人體第二道防線人體第二道防線獲得性免疫獲得性免疫(特異性免特異性免疫疫)分類：分類：n體液免疫體液免疫 n細胞免疫細胞免疫 抗感染免疫的構(gòu)成因素抗感染免疫的構(gòu)成因素天然免疫與獲得性免疫的關系天然免疫與獲得性免疫的關系在抗感染免疫過程中，天然免疫與獲得性免疫在抗感染免疫過程中，天然免疫與獲得性免疫相互依相互依賴與協(xié)作，共同發(fā)揮消除病原微生物感染的作用。賴與協(xié)作，共同發(fā)揮消除病原微生物感染的作用。吞噬細胞的吞噬和殺菌過程示意圖吞噬細胞的吞噬和殺菌過程示意圖第七章第七章

5、免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 一、抗原一、抗原 二、抗體二、抗體第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用 免疫學及其試驗技術對免疫學及其試驗技術對食品安全檢測食品安全檢測具有重要意義！具有重要意義！第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 一、抗一、抗 原原(antigen) 包括兩個基本內(nèi)容：包括兩個基本內(nèi)容：（1 1）免疫原性：免疫原性：抗原刺激有機體產(chǎn)生特異性免疫反抗原刺激有機體產(chǎn)生特異性免疫反 應的能力；應的能力；（2 2）反應原性：反應原性：抗原與相應抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生抗原與相應抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生 特異性結(jié)合反應的能力；特異性

6、結(jié)合反應的能力；抗原性：抗原性：免疫原性和反應原性的統(tǒng)稱。免疫原性和反應原性的統(tǒng)稱。 定義：定義：凡是能刺激有機體凡是能刺激有機體( (人或動物體人或動物體) )產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生抗體， 并能與相應抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。并能與相應抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。一、抗一、抗 原原1 1、抗原的基本性質(zhì)、抗原的基本性質(zhì)（1 1）異物性）異物性 （2 2）大分子量）大分子量 （3 3）特異性特異性 抗原刺激機體后只能產(chǎn)生相應的抗體并能與之結(jié)合。抗原刺激機體后只能產(chǎn)生相應的抗體并能與之結(jié)合。 特異性是由抗原表面的抗原決定基特異性是由抗原表面的抗原決定基( (簇簇) ) 決定的。決定的。 抗原決定基（表位）

7、：抗原決定基（表位）：抗原分子中決定抗原特異性的基抗原分子中決定抗原特異性的基 本結(jié)構(gòu)或具有化學活性的基團。本結(jié)構(gòu)或具有化學活性的基團。 抗原決定基抗原決定基是與抗體特異性結(jié)合的基本單位。是與抗體特異性結(jié)合的基本單位。（4 4）化學結(jié)構(gòu)復雜化學結(jié)構(gòu)復雜 免疫原性的形成還要求蛋白質(zhì)分子的化學結(jié)構(gòu)復雜。極性基團愈多或含支鏈氨基酸愈多，以及帶芳香族氨基酸多的蛋白質(zhì)抗原性愈強。 第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 一、抗一、抗 原原2 2、抗原的種類、抗原的種類 按抗原性的完整與否及其在機體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生的特點，按抗原性的完整與否及其在機體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生的特點， 可分為完全抗原和不完全抗原?？煞譃橥耆?/p>

8、抗原和不完全抗原。（1 1）完全抗原與不完全抗原）完全抗原與不完全抗原 完全抗原完全抗原 既有免疫原性又有反應原性。即能刺激機體產(chǎn)生抗體，并既有免疫原性又有反應原性。即能刺激機體產(chǎn)生抗體，并 與產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)或體外與產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)或體外( (試管內(nèi)試管內(nèi)) )發(fā)生反應的抗原。發(fā)生反應的抗原。 如細菌、病毒、外毒素、血清白蛋白、花粉蛋白、 不完全抗原（半抗原）不完全抗原（半抗原） 只有反應原性而沒有免疫原性。即不能單獨刺激機體產(chǎn)生只有反應原性而沒有免疫原性。即不能單獨刺激機體產(chǎn)生 抗體，若與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合，形成大分子復合物成抗體，若與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合，形成大分子復合物成 為完全抗原

9、，則可刺激機體產(chǎn)生抗體。為完全抗原，則可刺激機體產(chǎn)生抗體。 如各種低分子量的藥物、脂類和多糖等都屬于不完全抗原。第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 （2 2）細菌抗原）細菌抗原一、抗原一、抗原菌體抗原菌體抗原 （O O抗原）抗原）在細胞壁上，主要抗原。主要成分為脂多糖。根據(jù)在細胞壁上，主要抗原。主要成分為脂多糖。根據(jù)O O抗原的抗原的組成不同進行分群。組成不同進行分群。O O抗原抗原耐熱耐熱，121121，2h2h不被破壞。不被破壞。如沙門氏菌屬的O抗原不同分成67個血清群。 鞭毛抗原（鞭毛抗原（H H抗原）抗原）在鞭毛中，由蛋白質(zhì)組成，具有不同的種和型特異性，可作在鞭毛中，由蛋白質(zhì)組成，具有

10、不同的種和型特異性，可作菌型鑒別。菌型鑒別。H H抗原不耐熱，抗原不耐熱，56568080，303040min40min即被破壞。即被破壞。在制備O抗原時常用煮沸法消除H抗原。2 2、抗原的種類、抗原的種類（2 2）細菌抗原）細菌抗原第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 一、抗原一、抗原表面抗原（表面抗原）表面抗原（表面抗原）包圍在細菌細胞壁最外面，故稱。表面抗原隨菌種和結(jié)構(gòu)的包圍在細菌細胞壁最外面，故稱。表面抗原隨菌種和結(jié)構(gòu)的不同可有不同的名稱。不同可有不同的名稱。如肺炎鏈球菌莢膜抗原；大腸桿菌、痢疾志賀氏菌 包膜抗原或K抗原，沙門氏菌屬Vi抗原等。菌毛抗原菌毛抗原 存在于菌毛中的抗原，也具有

11、特異的抗原性。存在于菌毛中的抗原，也具有特異的抗原性。外毒素和類毒素外毒素和類毒素 細菌外毒素具有很強的抗原性，能刺激機體產(chǎn)生抗毒素抗體。細菌外毒素具有很強的抗原性，能刺激機體產(chǎn)生抗毒素抗體。外毒素經(jīng)外毒素經(jīng)0.3%0.3%0.4%0.4%甲醛溶液處理后使其失去毒性，但仍保持甲醛溶液處理后使其失去毒性，但仍保持抗原性，即成為類毒素?？乖?，即成為類毒素。2 2、抗原的種類、抗原的種類（2 2）細菌抗原）細菌抗原第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 二、抗二、抗 體體(antibody,Ab)定義：定義：抗原刺激有機體抗原刺激有機體( (人或動物人或動物) )所產(chǎn)生的具有特異性的免疫所產(chǎn)生的具有特

12、異性的免疫 球蛋白。球蛋白?？贵w是由B細胞識別抗原后增殖分化為漿細胞所產(chǎn)生的一類糖蛋白，能與相應抗原表位結(jié)合，是介導體液免疫的重要免疫分子。免疫球蛋白免疫球蛋白(immunoglobulin, ,Ig)：將具有抗體活性或化學：將具有抗體活性或化學結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)與 抗體相似的球蛋白?？贵w相似的球蛋白。分泌型分泌型(secreted Ig, ,sIg)：膜型膜型(membrane Ig, ,mlg)：在在血清血清和組織液中，和組織液中，占全部機體血清的占全部機體血清的20%25%。具有抗體的各種免疫功能具有抗體的各種免疫功能是是B細胞表面的抗原受體。細胞表面的抗原受體。含有免疫球蛋白的血清，稱為含有免

13、疫球蛋白的血清，稱為免疫血清或抗血清。免疫血清或抗血清。第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 二、抗二、抗 體體1 1、抗體的性質(zhì)、抗體的性質(zhì)（1 1）免疫球蛋白是一種糖蛋白，具有蛋白質(zhì)的通性。）免疫球蛋白是一種糖蛋白，具有蛋白質(zhì)的通性。 凡能破壞球蛋白的各種理化因素均能使之滅活；能被多 種蛋白水解酶裂解；可以在乙醇、三氯醋酸或中性鹽類 中沉淀，生產(chǎn)上常用50%飽和硫酸銨或硫酸鈉從免疫血 清中提取抗體球蛋白。（2 2）在體外）在體外 ( (試管內(nèi)試管內(nèi)) )，抗體可與相應的抗原發(fā)生特異性結(jié)，抗體可與相應的抗原發(fā)生特異性結(jié) 合并出現(xiàn)可見反應；合并出現(xiàn)可見反應； 在體內(nèi)，與其他防御機能協(xié)同作用下殺滅

14、病原菌，起在體內(nèi)，與其他防御機能協(xié)同作用下殺滅病原菌，起 到抗感染作用。到抗感染作用。但某些抗體在機體內(nèi)與相應的抗原相遇時，能引起變態(tài)反應變態(tài)反應。如青霉素過敏等。第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 二、抗二、抗 體體（3 3）由不同細胞克隆產(chǎn)生的抗體具有不均一性和結(jié)構(gòu)的）由不同細胞克隆產(chǎn)生的抗體具有不均一性和結(jié)構(gòu)的 多樣性。多樣性。 例如將血清電泳時，免疫球蛋白主要分布于球蛋白區(qū)，因而曾稱抗體為球蛋白，也有少量延伸到區(qū)和2區(qū)。每一個Y字形的Ig單體分子能結(jié)合2個抗原表位，稱之為兩價； 分泌型IgA為4價；五聚體IgM理論上為10價，但由于立體構(gòu)型 的空間阻位，一般只能結(jié)合5個抗原表位。 抗體

15、作為一種球蛋白，對異種動物又是很好抗原。因此抗體作為一種球蛋白，對異種動物又是很好抗原。因此, ,抗體抗體 即是抗體，又是抗原。利用此種特性可以制備抗免疫球蛋白即是抗體，又是抗原。利用此種特性可以制備抗免疫球蛋白 抗體抗體( (或稱抗抗體或稱抗抗體) )，用于熒光抗體技術中，用于熒光抗體技術中( (間接法間接法) )。1 1、抗體的性質(zhì)、抗體的性質(zhì)第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 二、抗二、抗 體體2 2、抗體的基本結(jié)構(gòu)、抗體的基本結(jié)構(gòu)兩條重鏈兩條重鏈(H(H鏈鏈) )兩條輕鏈兩條輕鏈(H(H鏈鏈) )440440個氨基酸殘基組成，分子量約個氨基酸殘基組成，分子量約505070kD70kD2

16、20220個氨基酸組成，分子量約個氨基酸組成，分子量約22.5kD22.5kD。二硫鍵二硫鍵(-S(-SS-)S-)根據(jù)根據(jù)VH/VLVH/VL氨基酸順序同源程度的差異，可將氨基酸順序同源程度的差異，可將IgIg分為類和亞分為類和亞類。人的免疫球蛋白共類。人的免疫球蛋白共5 5類：類：IgG IgG 、IgA IgA 、Ig MIg M、IgDIgD和和IgEIgE第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 二、抗二、抗 體體2 2、抗體的基本結(jié)構(gòu)、抗體的基本結(jié)構(gòu)N N端端可變區(qū)可變區(qū)恒定區(qū)恒定區(qū)鍵間二硫鍵鍵間二硫鍵輕鏈輕鏈重鏈重鏈C C端端CDR區(qū)區(qū)識別抗原識別抗原構(gòu)架區(qū)構(gòu)架區(qū)第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗

17、體抗原與抗體 二、抗二、抗 體體免疫抗體免疫抗體3 3、抗體的種類、抗體的種類 （1 1）根據(jù)抗體獲得方式分類）根據(jù)抗體獲得方式分類天然抗體天然抗體自身抗體自身抗體（2 2）根據(jù)抗體作用對象分類）根據(jù)抗體作用對象分類抗菌性抗體抗菌性抗體抗毒性抗體抗毒性抗體抗病毒性抗體抗病毒性抗體過敏性抗體過敏性抗體動物患傳染病后或經(jīng)人工注射疫苗后產(chǎn)生動物先天就有的抗體，可以遺傳給后代 機體對自身組織成分產(chǎn)生的抗體 細菌或內(nèi)毒素刺激機體所產(chǎn)生的抗體 細菌外毒素刺激機體產(chǎn)生的抗體 病毒刺激機體而產(chǎn)生的抗體，阻止病毒侵害異種動物血清進入機體后所產(chǎn)生的使動物發(fā)生過敏反應的抗體 第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 二、

18、抗二、抗 體體4 4、人工制備抗體、人工制備抗體用抗原免疫動物，或通過細胞融合技術和基因工程技術分別用抗原免疫動物，或通過細胞融合技術和基因工程技術分別制備多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。制備多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。（1 1）多克隆抗體）多克隆抗體( (polyclonal antibody，PoAb) ) 定義：定義：將抗原免疫動物，刺激動物體內(nèi)多個將抗原免疫動物，刺激動物體內(nèi)多個B B細胞克隆產(chǎn)生細胞克隆產(chǎn)生 的抗體，是針對多種抗原決定基的混合抗體。的抗體，是針對多種抗原決定基的混合抗體。特點：特點： 來源廣泛、制備容易，但不易大量制備；來源廣泛、制備容易，但不易大量制

19、備； 特異性不高，常出現(xiàn)交叉反應；特異性不高，常出現(xiàn)交叉反應；評價：評價：應用受到限制。應用受到限制。第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 二、抗二、抗 體體4 4、人工制備抗體、人工制備抗體（2 2）單克隆抗體單克隆抗體(monoclonal antibody(monoclonal antibody，McAbMcAb) ) 雜交瘤細胞和單克隆抗體技術雜交瘤細胞和單克隆抗體技術 原理：原理：淋巴細胞增殖分化的漿細胞淋巴細胞增殖分化的漿細胞( (來自脾臟，有抗原特異性來自脾臟，有抗原特異性 ，能產(chǎn)生抗體，但短壽，能產(chǎn)生抗體，但短壽) )與骨髓瘤細胞與骨髓瘤細胞( (無抗原特異無抗原特異 性，但長壽

20、，能在體外無限繁殖性，但長壽，能在體外無限繁殖) )利用原生質(zhì)體融合利用原生質(zhì)體融合 技術進行細胞融合，獲得既能在體外培養(yǎng)又能產(chǎn)生單技術進行細胞融合，獲得既能在體外培養(yǎng)又能產(chǎn)生單 一抗體的雜交瘤細胞。一抗體的雜交瘤細胞。 特點：特點：純度高、特異性強、效價高、無或少血清交叉反應，純度高、特異性強、效價高、無或少血清交叉反應， 制備成本低等特性。制備成本低等特性。 已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。 第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 二、抗二、抗 體體4 4、人工制備抗體、人工制備抗體第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 單克隆抗體制備示意圖單克隆抗體制備示

21、意圖單克隆抗體制作過程單克隆抗體制作過程二、抗二、抗 體體4 4、人工制備抗體、人工制備抗體（2 2）單克隆抗體）單克隆抗體(monoclonal antibody(monoclonal antibody，McAbMcAb) ) 應用：應用：已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。 對微生物病原體的鑒定。對微生物病原體的鑒定。 特異性抗原或特異性抗原或腫瘤相關蛋白質(zhì)的檢測和鑒定。腫瘤相關蛋白質(zhì)的檢測和鑒定。 疾病的被動免疫治療和生物導向藥物的制備。疾病的被動免疫治療和生物導向藥物的制備。 檢測血液中的藥物含量。檢測血液中的藥物含量。 分離某些昂貴的生物活性物質(zhì)。

22、分離某些昂貴的生物活性物質(zhì)。 第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 二、抗二、抗 體體4 4、人工制備抗體、人工制備抗體（3 3）基因工程抗體）基因工程抗體（重組抗體）重組抗體）定義：定義：在充分認識在充分認識IgIg基因結(jié)構(gòu)與功能的基礎上，應用基因結(jié)構(gòu)與功能的基礎上，應用DNADNA重組重組 和蛋白質(zhì)工程技術，按人們的意愿在基因水平上對和蛋白質(zhì)工程技術，按人們的意愿在基因水平上對IgIg分分 子進行切割、拼接或修飾，重新組裝成的新型抗體分子。子進行切割、拼接或修飾，重新組裝成的新型抗體分子。關鍵問題之一是鼠源抗體可引起人抗小鼠抗體關鍵問題之一是鼠源抗體可引起人抗小鼠抗體(HAMA)(HAMA)

23、的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。特點：特點：保留天然抗體的特異性和主要生物學活性，去除或減少保留天然抗體的特異性和主要生物學活性，去除或減少 了無關結(jié)構(gòu)，并可賦予抗體分子以新的生物學活性。了無關結(jié)構(gòu)，并可賦予抗體分子以新的生物學活性。迄今已成功構(gòu)建多種基因工程抗體，如人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體(ScFv)、雙特異性抗體(BsAb)及噬菌體抗體等。 第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用第一節(jié)第一節(jié) 抗原與抗體抗原與抗體 第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用一、抗原抗體反應的一般特點一、抗原抗體反應的一般特點二、影響抗原抗體反應的因

24、素二、影響抗原抗體反應的因素三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應四、現(xiàn)代免疫學技術四、現(xiàn)代免疫學技術第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用抗原抗體反應：抗原抗體反應：抗原與相應抗體之間在體內(nèi)或體外所發(fā)生的抗原與相應抗體之間在體內(nèi)或體外所發(fā)生的 特異性結(jié)合反應。特異性結(jié)合反應。體內(nèi)反應體內(nèi)反應：介導吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；：介導吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應體外反應：根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應的：根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應的 介質(zhì)不同，可出現(xiàn)凝集反應、沉淀反應、補體結(jié)介質(zhì)不同，可出現(xiàn)凝集反應、沉淀反應、補體結(jié) 合反應及中和

25、反應等各種不同的反應類型。合反應及中和反應等各種不同的反應類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多用血清作因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多用血清作試驗，故體外抗原抗體反應亦稱為試驗，故體外抗原抗體反應亦稱為血清學反應血清學反應。一、抗原抗體反應的一般特點一、抗原抗體反應的一般特點1.1.特異性與交叉性特異性與交叉性 特異性：一種抗原只能與它相應的抗體結(jié)合。特異性：一種抗原只能與它相應的抗體結(jié)合。交叉性：兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、交叉性：兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、 抗體間構(gòu)型部分相同，就可出現(xiàn)交叉反應?？贵w間構(gòu)型部分相同，就可出現(xiàn)

26、交叉反應。2.2.可逆性可逆性 抗體與抗原的結(jié)合是分子表面的一種物理結(jié)合即非共價鍵的結(jié)抗體與抗原的結(jié)合是分子表面的一種物理結(jié)合即非共價鍵的結(jié)合，在一定條件下可以發(fā)生解離。分開后，二者的性質(zhì)不變。合，在一定條件下可以發(fā)生解離。分開后，二者的性質(zhì)不變。3.3.定比性定比性 抗原物質(zhì)是多價的；抗體是雙價的。抗原物質(zhì)是多價的；抗體是雙價的?？乖贵w的結(jié)合是抗原抗原抗體的結(jié)合是抗原抗體抗體抗原抗原抗體這樣順次結(jié)合，只有抗體這樣順次結(jié)合，只有當兩者比例合適時，聚集成較大的復合物才能出現(xiàn)可見反應。當兩者比例合適時，聚集成較大的復合物才能出現(xiàn)可見反應。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用

27、一、抗原抗體反應的一般特點一、抗原抗體反應的一般特點3.3.定比性定比性第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用圖圖7-4 7-4 沉淀反應的曲線沉淀反應的曲線一、抗原抗體反應的一般特點一、抗原抗體反應的一般特點4.4.階段性階段性 第一階段：發(fā)生特異性反應，特點是反應快，不被肉眼所見。第一階段：發(fā)生特異性反應，特點是反應快，不被肉眼所見。第二階段：可見階段，是非特異性的。反應較慢，受到電解第二階段：可見階段，是非特異性的。反應較慢，受到電解 質(zhì)、質(zhì)、pHpH值和溫度的影響。值和溫度的影響。5.5.敏感性敏感性 高度的敏感性，用于定性，還可用于定量和定位。高度的敏感性，用于定

28、性，還可用于定量和定位。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用二、影響抗原抗體反應的因素二、影響抗原抗體反應的因素1.1.電解質(zhì)電解質(zhì)4.4.雜質(zhì)異物雜質(zhì)異物0 0. .8585的的NaClNaCl生理鹽水生理鹽水2.2.溫度溫度 37 37水浴水浴3.pH3.pH值值多數(shù)血清學反應的適宜多數(shù)血清學反應的適宜pHpH值為值為6 68 8第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應1 1、凝集反應、凝集反應2 2、沉淀反應、沉淀反應3 3、免疫電泳、免疫電泳4 4、補體結(jié)合實驗、補體結(jié)合實驗 第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及

29、其應用抗原與抗體反應及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應1 1、凝集反應、凝集反應 定義：定義：顆粒性抗原與相應的抗體在有電解質(zhì)合適條件下反應顆粒性抗原與相應的抗體在有電解質(zhì)合適條件下反應 并出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。（并出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。（凝集原，凝集素） 一般稀釋抗體一般稀釋抗體( (抗血清抗血清) )，使其與抗原有一合適比例。，使其與抗原有一合適比例。（1 1）直接凝集反應）直接凝集反應 玻片法玻片法 定性試驗。用已知抗體檢測未知抗原。定性試驗。用已知抗體檢測未知抗原。 用途：鑒定菌種，菌種分型，測定ABO血型等。 試管法試管法 定量試驗。用已知抗原測定血清中抗體有無

30、及相對含量定量試驗。用已知抗原測定血清中抗體有無及相對含量 發(fā)生明顯凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度（抗體效價，滴度發(fā)生明顯凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度（抗體效價，滴度 ) )，以表示血清中抗體的相對含量。，以表示血清中抗體的相對含量。 用途：測定患傳染病的人或家畜血清中的抗體，診斷第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應1 1、凝集反應、凝集反應（2 2）間接凝集反應）間接凝集反應定義：定義：利用某些與免疫無關的均一的小顆粒物質(zhì)作為載體，利用某些與免疫無關的均一的小顆粒物質(zhì)作為載體， 將可溶性抗原將可溶性抗原( (或抗體或抗體) )吸附于表面，如

31、與相應的抗體吸附于表面，如與相應的抗體 ( (或抗原或抗原) )結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，發(fā)生結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，發(fā)生 凝集現(xiàn)象。凝集現(xiàn)象。表面吸附抗原表面吸附抗原( (或抗體或抗體) )的載體微球稱為免疫微球。的載體微球稱為免疫微球。特點：特點：增大體積，敏感，可檢測極微量抗原。增大體積，敏感，可檢測極微量抗原。根據(jù)所用載體不同，常用的間接凝集反應有間接血球凝集反根據(jù)所用載體不同，常用的間接凝集反應有間接血球凝集反應，碳凝集反應，乳膠凝集反應等。還有間接凝集抑制反應，應，碳凝集反應，乳膠凝集反應等。還有間接凝集抑制反應，第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應

32、及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應2 2、沉淀反應、沉淀反應 定義：定義：可溶性抗原與相應抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在條可溶性抗原與相應抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在條 件下，形成肉眼可見的沉淀物。（件下，形成肉眼可見的沉淀物。（沉淀原，沉淀素） 凝集反應與沉淀反應的區(qū)別：凝集反應與沉淀反應的區(qū)別： 凝集反應的抗原是顆粒性抗原，總表面積小，做抗體稀釋。凝集反應的抗原是顆粒性抗原，總表面積小，做抗體稀釋。 沉淀反應的抗原是可溶性的膠體溶液，單位面積抗原多，需沉淀反應的抗原是可溶性的膠體溶液，單位面積抗原多，需 抗體量多，抗原稀釋。抗體量多，抗原稀釋。 以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價

33、以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價。 類型：類型：環(huán)狀法、絮狀法和瓊脂擴散法（單向和雙向）。環(huán)狀法、絮狀法和瓊脂擴散法（單向和雙向）。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應圖圖7-5 7-5 瓊脂雙向擴散的幾種不同方式結(jié)果示意圖瓊脂雙向擴散的幾種不同方式結(jié)果示意圖第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應 3 3、免疫電泳、免疫電泳 將瓊脂擴散和電泳技術相結(jié)合的血清學檢驗方法。將瓊脂擴散和電泳技術相結(jié)合的血清學檢驗方法。 特點：特點：特異性強、很高的靈敏性和分辨力。特異性強、很高的

34、靈敏性和分辨力。 用途：用途：分析抗原或抗體純度。分析抗原或抗體純度。 類型：類型：對流免疫電泳、火箭電泳、雙向免疫電泳、瓊脂免疫對流免疫電泳、火箭電泳、雙向免疫電泳、瓊脂免疫 電泳。電泳。（1 1）對流免疫電泳）對流免疫電泳 這是一種將雙向擴散與電泳技術結(jié)合而成的方法。這是一種將雙向擴散與電泳技術結(jié)合而成的方法。 原理：原理：抗原與抗體分別置于凝膠板電場負、正極附近的小孔抗原與抗體分別置于凝膠板電場負、正極附近的小孔 中，通電后，抗原向正極移動，而抗體則向負極移動中，通電后，抗原向正極移動，而抗體則向負極移動 ，結(jié)果在兩孔間合適的抗原、抗體濃度處會形成一條，結(jié)果在兩孔間合適的抗原、抗體濃度處

35、會形成一條 沉淀線。沉淀線。 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲種胎兒蛋白(AFP)等的檢測。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應3 3、免疫電泳、免疫電泳（2 2）火箭免疫電泳）火箭免疫電泳定義：定義：抗原在含定量抗抗原在含定量抗體的瓊脂中向一個方向體的瓊脂中向一個方向泳動，兩者比例合適時泳動，兩者比例合適時，在較短時間內(nèi)生成如，在較短時間內(nèi)生成如火箭狀或錐狀的沉淀火箭狀或錐狀的沉淀線。線。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體

36、反應及其應用圖圖7-67-6 火箭電泳結(jié)果示意圖火箭電泳結(jié)果示意圖三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應3 3、免疫電泳、免疫電泳（3 3）雙向免疫電泳）雙向免疫電泳這是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合的方法這是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合的方法定義：定義：先將血清用電泳分離出各成分，然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移先將血清用電泳分離出各成分，然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移 至另一已加有抗血清的凝膠上，進入垂直方向的第二至另一已加有抗血清的凝膠上，進入垂直方向的第二 次電泳，形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。次電泳，形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。 第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用 圖圖7-7 7

37、-7 雙向免疫電泳示意圖雙向免疫電泳示意圖 三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應3 3、免疫電泳、免疫電泳（4 4）瓊脂免疫電泳）瓊脂免疫電泳先進行瓊脂平板電泳再做雙向瓊脂先進行瓊脂平板電泳再做雙向瓊脂擴散的血清學檢驗技術。擴散的血清學檢驗技術。定義：定義：先將抗原樣品在瓊脂凝膠中電先將抗原樣品在瓊脂凝膠中電泳，不同抗原成分因其遷移率的不同泳，不同抗原成分因其遷移率的不同而分離成區(qū)帶，挖一條平行的抗體槽，而分離成區(qū)帶，挖一條平行的抗體槽，加入抗血清做雙向擴散，在兩者比例加入抗血清做雙向擴散，在兩者比例適合處形成可見的弧形沉淀線。適合處形成可見的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，即根

38、據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，即可分析樣品中所含的抗原成分和含量。可分析樣品中所含的抗原成分和含量。瓊脂免疫電泳示意圖第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應4 4、補體結(jié)合實驗、補體結(jié)合實驗定義：定義：有補體參與，并以綿羊紅血球和溶血素有補體參與，并以綿羊紅血球和溶血素( (紅細胞的紅細胞的 特異抗體特異抗體) )是否發(fā)生溶血反應作指示的一種高靈敏是否發(fā)生溶血反應作指示的一種高靈敏 度的抗原與抗體結(jié)合反應。度的抗原與抗體結(jié)合反應。原理：原理：補體沒有特異性，可與任何抗原抗體復合物發(fā)生結(jié)補體沒有特異性，可與任何抗原抗體復合物發(fā)生結(jié) 合合(

39、 (即不能與單獨的抗原或抗體結(jié)合即不能與單獨的抗原或抗體結(jié)合) )，一旦結(jié)合后，一旦結(jié)合后 并不再游離，但不能顯示肉眼可見現(xiàn)象。并不再游離，但不能顯示肉眼可見現(xiàn)象。通常應用通常應用溶血系統(tǒng)作為指示劑溶血系統(tǒng)作為指示劑，以判定補體是否已被抗原抗，以判定補體是否已被抗原抗體復合物結(jié)合。游離補體，就會出現(xiàn)肉眼可見的溶血反應。體復合物結(jié)合。游離補體，就會出現(xiàn)肉眼可見的溶血反應。補體結(jié)合試驗補體結(jié)合試驗有抗原、抗體、補體、紅血球、溶血素有抗原、抗體、補體、紅血球、溶血素5 5種種成分參加，并分屬于反應系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。成分參加，并分屬于反應系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應

40、及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應4 4、補體結(jié)合實驗、補體結(jié)合實驗 第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用圖圖7-9 7-9 補體結(jié)合實驗示意圖補體結(jié)合實驗示意圖 第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用三、主要抗原抗體反應三、主要抗原抗體反應4 4、補體結(jié)合實驗、補體結(jié)合實驗（1 1）反應系統(tǒng)）反應系統(tǒng)( (試驗系統(tǒng)、結(jié)合系統(tǒng)試驗系統(tǒng)、結(jié)合系統(tǒng)) ) 由已知由已知抗原抗原( (或抗體或抗體) )、被檢抗體、被檢抗體( (或抗原或抗原) )和補體組成。和補體組成。先加入抗原、抗體，再加入補體，混合后作用一定時間。先加入抗原、抗體，再加入補體，混合后

41、作用一定時間。如果抗原和抗體相對應，形成如果抗原和抗體相對應，形成抗原抗體復合物，抗原抗體復合物，則補體就被則補體就被結(jié)合，否則即為游離狀態(tài)。結(jié)合，否則即為游離狀態(tài)。（2 2）指示系統(tǒng)）指示系統(tǒng)( (溶血系統(tǒng)溶血系統(tǒng)) )由紅血球由紅血球( (抗原抗原) )和溶血素和溶血素( (抗體抗體) )組成。組成。在反應系統(tǒng)完畢后，再向試管內(nèi)加入綿羊紅血球和溶血素。在反應系統(tǒng)完畢后，再向試管內(nèi)加入綿羊紅血球和溶血素。不發(fā)生溶血：不發(fā)生溶血：補體被抗原抗體復合物結(jié)合，陽性反應。補體被抗原抗體復合物結(jié)合，陽性反應。發(fā)生溶血：發(fā)生溶血： 液體中的抗原抗體不相對應，沒有發(fā)生結(jié)合，液體中的抗原抗體不相對應，沒有發(fā)

42、生結(jié)合， 補體依然游離存在，反應陰性。補體依然游離存在，反應陰性。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術現(xiàn)代免疫學技術包括免疫標記技術、免疫定位分析、免疫親現(xiàn)代免疫學技術包括免疫標記技術、免疫定位分析、免疫親和層析和免疫生物傳感器技術等，其中尤以免疫標記技術發(fā)和層析和免疫生物傳感器技術等，其中尤以免疫標記技術發(fā)展最快，應用最廣。展最快，應用最廣。免疫標記技術免疫標記技術：將某些小分子物質(zhì)作為標記劑（如熒光素、：將某些小分子物質(zhì)作為標記劑（如熒光素、酶、放射性同位素或電子致密物質(zhì)等）結(jié)合到抗原或

43、抗體上酶、放射性同位素或電子致密物質(zhì)等）結(jié)合到抗原或抗體上，不影響抗原抗體反應，更容易觀察，提高檢測的靈敏度。，不影響抗原抗體反應，更容易觀察，提高檢測的靈敏度。標記劑：與抗原或抗體結(jié)合的小分子物質(zhì)。標記劑：與抗原或抗體結(jié)合的小分子物質(zhì)。優(yōu)點：優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，應用范圍廣，反應速度快，容特異性強，靈敏度高，應用范圍廣，反應速度快，容 易觀察；易觀察； 既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術免疫標

44、記技術免疫標記技術1 1、免疫熒光技術、免疫熒光技術2 2、免疫酶技術、免疫酶技術3 3、放射免疫測定法、放射免疫測定法4 4、免疫電鏡技術、免疫電鏡技術第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術1 1、免疫熒光技術、免疫熒光技術（熒光抗體法）熒光抗體法）定義：定義：一種將結(jié)合有熒光素的熒光抗體與抗原反應，以提高一種將結(jié)合有熒光素的熒光抗體與抗原反應，以提高 免疫反應靈敏度和適合顯微鏡觀察的免疫標記技術。免疫反應靈敏度和適合顯微鏡觀察的免疫標記技術。熒光素濃度在熒光素濃度在1010-8-8時，仍可

45、受激發(fā)而射出肉眼可見的熒光。時，仍可受激發(fā)而射出肉眼可見的熒光。原理：原理：在一定條件下以化學方法將熒光素與抗體結(jié)合，制成在一定條件下以化學方法將熒光素與抗體結(jié)合，制成 熒光素抗體，但不影響抗體的免疫活性。如果標本中熒光素抗體，但不影響抗體的免疫活性。如果標本中 的抗原與熒光素抗體結(jié)合著染后，在熒光顯微鏡下成的抗原與熒光素抗體結(jié)合著染后，在熒光顯微鏡下成 為發(fā)出熒光的可見物體，即可達到檢出抗原的目的。為發(fā)出熒光的可見物體，即可達到檢出抗原的目的。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)(FITC)和羅丹明和羅丹明(RB200)(RB200)，在藍紫光激發(fā)下，分別發(fā)出

46、鮮明的綠色熒光和橙黃色熒光。在藍紫光激發(fā)下，分別發(fā)出鮮明的綠色熒光和橙黃色熒光?；痉椒ǎ夯痉椒ǎ褐苯臃?，間接法、補體結(jié)合法和標記法。直接法，間接法、補體結(jié)合法和標記法。 第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術1 1、免疫熒光技術、免疫熒光技術（熒光抗體法）（熒光抗體法）（1 1）直接法）直接法（2 2）間接法）間接法（3 3）補體結(jié)合法）補體結(jié)合法（4 4）標記法）標記法第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用圖圖7-107-10 免疫熒光抗體法原理示意圖免疫熒光抗體法原

47、理示意圖直接免疫熒光法直接免疫熒光法第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用間接接免疫熒光法間接接免疫熒光法第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術 免疫熒光技術基礎上發(fā)展起來的血清學檢驗方法。免疫熒光技術基礎上發(fā)展起來的血清學檢驗方法。 一種酶作標記的抗體或抗抗體的一種酶作標記的抗體或抗抗體的高靈敏度高靈敏度的免疫標記技術。的免疫標記技術。原理：原理：利用酶與抗原或抗體結(jié)合后，既不改變抗原或抗體的利用酶與抗原或抗體結(jié)合后，既不改變抗原或抗體的 疫學反應特異性，也不影響酶本身的

48、活性，在特異抗疫學反應特異性，也不影響酶本身的活性，在特異抗 原抗體反應后，于相應而合適的酶底物作用下，產(chǎn)生原抗體反應后，于相應而合適的酶底物作用下，產(chǎn)生 可見的不溶性可見的不溶性有色產(chǎn)物有色產(chǎn)物。與免疫熒光技術區(qū)別：與免疫熒光技術區(qū)別：有色的沉淀物可在光學顯微鏡下進行細胞水平的抗原追蹤，有色的沉淀物可在光學顯微鏡下進行細胞水平的抗原追蹤，也可在電子顯微鏡下進行分子水平的觀察，又能用分光光度也可在電子顯微鏡下進行分子水平的觀察，又能用分光光度計定量測定酶作用底物分解的量。計定量測定酶作用底物分解的量。2 2、免疫酶技術、免疫酶技術（酶免疫測定技術）（酶免疫測定技術）目前常用辣根過氧化物酶目前常

49、用辣根過氧化物酶(HRP)(HRP)，也有用堿性磷酸酶標記抗體，也有用堿性磷酸酶標記抗體第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用2 2、免疫酶技術、免疫酶技術（酶免疫測定技術）（酶免疫測定技術）（1 1）酶聯(lián)免疫吸附法）酶聯(lián)免疫吸附法( (enzyme linked immunosorbant assay， ELISAELISA，酶標法，酶標法) ) ELISA ELISA 是目前應用最廣泛的生物學技術之一。是目前應用最廣泛的生物學技術之一。 原理：原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持免疫活性。使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持免疫活性。使抗原或抗體與某種

50、酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標 抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISAELISA試驗中需要有試驗中需要有3 3種試劑：種試劑：固相的抗原或抗體。固相的抗原或抗體。 目前多用聚苯乙烯酶標板目前多用聚苯乙烯酶標板( (微量滴定板微量滴定板) )作為固相載體作為固相載體酶標記的抗原或抗體。酶標記的抗原或抗體。酶作用的底物。酶作用的底物。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術抗原捕獲抗原捕獲ELISAELISA1 1、把抗體固定在、把抗體固

51、定在固相支持物上固相支持物上（9696孔板）；孔板）；2 2、加入蛋白質(zhì)樣、加入蛋白質(zhì)樣品保溫，再洗去品保溫，再洗去未結(jié)合的雜蛋白；未結(jié)合的雜蛋白；3 3、加入第二抗體，、加入第二抗體，第二抗體結(jié)合一第二抗體結(jié)合一個供檢測用的酶個供檢測用的酶（辣根過氧化物（辣根過氧化物酶）酶）4 4、洗去未結(jié)合第、洗去未結(jié)合第二抗原，酶活測二抗原，酶活測定。定。ELISA for HIV antibodyMicroplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用2 2、免疫酶技術、

52、免疫酶技術（酶免疫測定技術）（酶免疫測定技術）（1 1）酶聯(lián)免疫吸附法）酶聯(lián)免疫吸附法優(yōu)點：優(yōu)點：靈敏度高，特異性強。靈敏度高，特異性強。酶標抗體制備容易，且高度穩(wěn)定而有效期長。酶標抗體制備容易，且高度穩(wěn)定而有效期長。操作簡便操作簡便應用范圍廣泛。應用范圍廣泛。 ELISA技術用于檢測多種病原菌抗原或抗體、血液及其 他體液中微量蛋白成分、細胞因子等。 在食品加工領域，ELISA技術可用于測定蛋白質(zhì)，也可 用于測定各種生物活性成分，如異黃酮半抗原。在食品安全方面，用于檢測食品中農(nóng)藥殘留，以及檢測食品中的病原菌及其毒素，如沙門氏菌及其內(nèi)毒素和腸毒素、大腸桿菌及其腸毒素和腸細胞出血毒素、金黃色葡萄球

53、菌及其腸毒素、霉菌和真菌毒素。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用2 2、免疫酶技術、免疫酶技術（酶免疫測定技術）（酶免疫測定技術）（1 1）酶聯(lián)免疫吸附法）酶聯(lián)免疫吸附法ELISAELISA方法：方法：將可溶性抗體或抗原吸附到聚苯乙烯等固相載體將可溶性抗體或抗原吸附到聚苯乙烯等固相載體 上，再滴加酶標記的抗原或抗體，然后添加底物上，再滴加酶標記的抗原或抗體，然后添加底物 ，進行免疫酶反應，以酶標儀測定。，進行免疫酶反應，以酶標儀測定。 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 本法用于檢測抗原。本法用于檢

54、測抗原。圖圖7-11 7-11 雙抗體夾心法測抗原示意圖雙抗體夾心法測抗原示意圖 標本標本（含抗體）（含抗體）酶標酶標抗體抗體 底物底物 固相抗體固相抗體第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用2 2、免疫酶技術、免疫酶技術（酶免疫測定技術）（酶免疫測定技術）（1 1）酶聯(lián)免疫吸附法）酶聯(lián)免疫吸附法間接法間接法 圖圖7-11 7-11 間接法測抗原示意圖間接法測抗原示意圖 標本標本（含抗體）（含抗體）酶標酶標抗體抗體 底物底物 固相抗原固相抗原第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及

55、其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用2 2、免疫酶技術、免疫酶技術（酶免疫測定技術）（酶免疫測定技術）（1 1）酶聯(lián)免疫吸附法）酶聯(lián)免疫吸附法斑點酶免疫吸附法斑點酶免疫吸附法 (dot-ELISA) (dot-ELISA) 本法原理與上述兩法相同，方法上的不同之處是：本法原理與上述兩法相同，方法上的不同之處是：A A 用硝酸纖維薄膜取代上述微量滴定板；用硝酸纖維薄膜取代上述微量滴定板；B B 最終顯色反應是不溶于水的有色沉淀物，最終顯色反應是不溶于水的有色沉淀物，例如，堿性磷酸酶的底物不能用對硝基酚磷酸鹽，而要用氮藍四唑(NBT)等。最終可從

56、薄膜上沉淀物顏色的有無或多少確定結(jié)果。優(yōu)點：優(yōu)點：靈敏度高靈敏度高( (比普通比普通ELISAELISA高高1010100100倍倍) )，與放射免疫測定相當。，與放射免疫測定相當。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用2 2、免疫酶技術、免疫酶技術（酶免疫測定技術）（酶免疫測定技術）（1 1）酶聯(lián)免疫吸附法）酶聯(lián)免疫吸附法生物素生物素- -親和素系統(tǒng)（親和素系統(tǒng)（BAS)BAS)在在ELISAELISA中的應用中的應用 親和素親和素是存在于蛋清中的堿性糖蛋白，一個親和素分子由是存在于蛋清中的

57、堿性糖蛋白，一個親和素分子由4 4個亞個亞基組成，可與基組成，可與4 4個生物素分子穩(wěn)定結(jié)合；個生物素分子穩(wěn)定結(jié)合；生物素生物素是存在于蛋黃中的維生素是存在于蛋黃中的維生素H H，化學方法制成的生物素衍生，化學方法制成的生物素衍生物物生物素生物素- -羥基琥珀亞胺酯羥基琥珀亞胺酯(BNHS)(BNHS)可與蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原、可與蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原、抗體、酶、熒光素、核苷酸等結(jié)合形成生物素化的分子。抗體、酶、熒光素、核苷酸等結(jié)合形成生物素化的分子。生物素與親和素結(jié)合具有高度親和力，且均能耦聯(lián)抗體、抗原生物素與親和素結(jié)合具有高度親和力，且均能耦聯(lián)抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影響其生物學活性。和辣根

58、過氧化物酶而不影響其生物學活性。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用四、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用2 2、免疫酶技術、免疫酶技術（酶免疫測定技術）（酶免疫測定技術）（1 1）酶聯(lián)免疫吸附法）酶聯(lián)免疫吸附法生物素生物素- -親和素系統(tǒng)（親和素系統(tǒng)（BAS)BAS)在在ELISAELISA中的應用中的應用 在生物素在生物素- -親和素系統(tǒng)中，借助所形成的親和素親和素系統(tǒng)中，借助所形成的親和素- -生物素酶復合生物素酶復合物，追蹤生物素標記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，可物，追蹤生物素標記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，

59、可檢出相應的抗體或抗原。檢出相應的抗體或抗原。由于抗原或抗體分子可耦聯(lián)多個生物素，且由于抗原或抗體分子可耦聯(lián)多個生物素，且1 1個親和素分子可結(jié)個親和素分子可結(jié)合合4 4個生物素分子，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種個生物素分子，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。如此組成的新生物放大系統(tǒng)，進一步提高類似晶格的復合體。如此組成的新生物放大系統(tǒng)，進一步提高ELISAELISA檢測的靈敏度。檢測的靈敏度。BASBAS除用于抗原抗體檢測外，還可用于檢除用于抗原抗體檢測外，還可用于檢測測DNADNA和和RNARNA。第二節(jié)第二節(jié) 抗原與抗體反應及其應用抗原與抗體反應及其應用四

60、、現(xiàn)代免疫技術四、現(xiàn)代免疫技術第七章第七章 免疫學方法及其應用免疫學方法及其應用2 2、免疫酶技術、免疫酶技術（酶免疫測定技術）（酶免疫測定技術）（1 1）酶聯(lián)免疫吸附法）酶聯(lián)免疫吸附法生物素生物素- -親和素系統(tǒng)（親和素系統(tǒng)（BAS)BAS)在在ELISAELISA中的應用中的應用 生物素生物素- -親和素系統(tǒng)在親和素系統(tǒng)在ELISAELISA中的應用有多種形式，可用于間接中的應用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應放大。可以在固相上預先包被親和素，包被，亦可用于終反應放大?？梢栽诠滔嗌项A先包被親和素，再用吸附法包被固相的抗體或抗原，進而再與生物素結(jié)合，通再用吸附法包被固相的抗體或抗原