WB灰度值測定

1、ImageJ測到了WB條帶灰度值關于用ImageJ量化westernblot條帶灰度值，在網(wǎng)上一直盛傳著兩種操作方法，然鵝小伙伴們卻一直不確定到底哪種才是正確的測量灰度方法，甚至將灰度與光密度弄混淆。今天咱們一起就這個時機學習下，請先看看你是用以下那種方法測量灰度值？以下是兩種方法的具體操作。方法一：1、翻開ImageJ軟件一左上角file一Open選擇自己的條帶圖片（事先把條帶擺正）2、把圖片轉化成灰度圖片：Imagetype-8-bit3、第一個矩形工具一選上所有條帶Iqidq+J7才以,x|I4、analyzeGels一selectfirstlaneGels一plotlanes在這第四步

2、也可以分開選取,如：框選第一個條帶一analyzeGels一selectfirstlane一將第一個框拖移到余下條帶一Gelsfselectnextlane5、選中直線工具，將開口波峰關閉6、選中魔棒工具正數(shù)第七個，點擊波峰，就得出所有area值。方法二1、翻開ImageJ軟件一左上角fileOpen選擇自己的條帶圖片（事先條帶弄正）2、把圖片轉化成灰度圖片：Imagetype-8-bit3、扣除背景：ProcessfSubtractBackground-50pixels并勾選LightBackgroundMin & max5、設定參數(shù)：Analyzefsetmeasurement勾選

3、Area、Meangrayvalue、grayvalue、Integrateddensity6、Analyzefsetscalefunitoflength選項里改為pixels,確定SetSea電Distanceinpixels:300Knowndistance;1Q0Pixelaspectratio:1.0Unitoflength:inchClicktoRemoveScaleCGlobalScale:300pixels/inchHelpCancelOK/不規(guī)那么圓圈心靈手6、圖像分割。EditInvert一選中橢圓圈手殘黨首選巧黨義無反顧，手動圈上單個條帶、|A|d|<*>|&g

4、t;M <.'ZI» <11? 5>h v- i, TO(T一草7、AnalyzefMeasurement即得到Intden,重復6、7步就得到所有Intden值. Re 密 LlltSAreaMean |Mlf|MEDcn RawtntDcn 0.009 73.790 13135 0.641 57704小伙伴們，你們是哪種方法呢？首先先把結論說出來，其實兩者得出的area和Intden嚴格來說都不是灰度值，前者是面積而后者是光密度值，但用來量化WB條帶都是OK的。ImageJ這個軟件在將westernblot條帶量化時存在兩種參數(shù)：灰度與光密度假，暫且這么

5、稱呼，原因下文再說，這兩者在理解使用ImageJ量化WB條帶十分重要，請務必仔細看以下幾個概念。1、灰度（gray）:是指圖像中各種顏色的深淺程度，它以整數(shù)值表示，一般的圖像分析軟件將圖像每個像素點的顏色分為0-255共256級，每一像素點對應的數(shù)值即灰度，灰度值越小物體顏色越深。有興趣的小伙伴，可以隨意用ImageJ翻開一X圖片，光標在圖片上任意移動，得到的value值最小為0純黑，最大為255純白。rL_£I、?Imaged2.53(760),y=1.22(365),value=6'A|刎，|2、光密度（OD,真）：也就是吸光度A，光線通過溶液或某一物質前的入射光強度Io

6、與該光線通過溶液或物質后的出射光強度Ib比值的對數(shù)OD=lgIo/Ib，其實就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比爾定律。入射光1。整出射光Tb#明確這兩個概念后，我們再來看為什么稱ImageJ里的光密度是"假，因為在圖像分析中的光密度假是由灰度值再經(jīng)計算得到的，它是一個相對值，但其算法與OD值的算法類似。只是它的入射光強度由Westernblot膠片上最亮區(qū)域的平均灰度值代替，而出射光強度那么由待測目標平均灰度值代替。即:圖像分析系統(tǒng)的光密度值=lg（WB膠片上最亮區(qū)域的平均灰度值/待測目標的平均灰度值），再簡單點來說，就是光密度假和正兒八經(jīng)的灰度值有血緣關系?？偨Y起來說灰度與光密度假都

7、能用來量化westernblot條帶，兩種量化任君隨意挑。現(xiàn)在說回兩種操作方法：方法一：是通過每個條帶上眾多像素點對應的灰度值勾畫出一條曲線，最后魔棒點出算出的area值其實就是該條帶所對應的面積大小。條帶越大，area值越大。方法二：是通過上文說到的光密度假計算方法得出來的，最后得出的Intden值是所圈面積下的總光密度值，再除以圈下面積area,得出的是平均光密度值圖像中陽性區(qū)域每一像素點的OD值疊加后除以測量的面積。條帶顏色反轉后越白越亮那么Intden/area越大。所以嚴格意義上來說，方法一方法二最后得出的數(shù)據(jù)都不屬于正兒八經(jīng)的灰度值，但又與灰度值有著千絲萬縷白聯(lián)系。如果只是量化WB

8、條帶，兩種方法是都能選用的，記得標注你得到的結果是area還是Intden，但如果你想測出真正的灰度值，那么我們下節(jié)課再來好好談談，咦？我說話怎么越來越像教師的風格呢，哈哈，同學們,下課.今天主要講述如何用photoshop測量WB灰度值，在講述操作方法之余，小石頭先給大家理一理原理，以便大家更好的理解文末附操作方法。照例最先展示下最后的成果圖其實最后可以用Graphpad做圖，在此不贅述：；:fit=AN-CNACDE女屋館（平均館）自積,景灰度帕赤帶菽疾惇可侑總菽度4&5762711770,02633145.3493BIHD52.5225&2010.02699132.236

9、E:9i123.392398410.026991123.365399103750.3006131名1口95712950.026931170/2.14SE)0.02699124H14&62UH1&36203715120.0269d1163593379247353169條帶總灰度好了，開場今天的課程，現(xiàn)在手里有X這樣的WB條帶圖，如何將各條帶灰度值測量出來？首先我們從根本原理聊起，圖片大小的存儲根本單位是字節(jié)，每個字節(jié)是有8個比特bit,音譯為比特，也稱為“位'組成。一般的圖片都是由眾多像素點構成的，灰度模式下一個像素一個字節(jié)，也同時就是8bito在上一堂課中，我們曾用Im

10、ageJ將圖片轉化為灰度圖，就是通過image一type-8-bit這一步。如果把黑-灰-白連續(xù)變化的灰度值量化為256個灰度級，灰度值的X圍也就為0-255,表示亮度由深到淺。從上圖我們可以得知純黑為0,純白為255,中間0-255代表各個不同亮度等級。而通常我們所得到的WB圖片是這樣的：前者A是沒有轉化為灰度模式的，后者B是灰度模式下的。而在灰度模式下，如果按灰度值描述的話，顯然有明顯條帶的的灰度數(shù)據(jù)根本都與0相近，數(shù)值很小,這樣不利于互相比擬。所以通常的做法是進展"反相，也就是將白的地方變?yōu)楹?，黑的地方變?yōu)榘?，顏色顛倒。也就是這樣：至此條帶上的灰度值就成了越亮越白那么灰度值越大

11、有沒有小伙伴看過那種原始照片底片，記不記得底片上人物的頭發(fā)都是白的發(fā)亮，這種就是灰度值255哦；還有做電泳凝膠的小伙伴，得到的凝膠圖就不需要反相了，可以直接進展灰度值分析哦。我們目前要想測量條帶的灰度值，就只需把那發(fā)光發(fā)亮的地方圈出來，讀取灰度值就可以了，而這一局部就交給photoshop來計算吧。在這里小石頭想敲敲黑板，提醒大家注意下三點：1、由于Photoshop得出的灰度值是平均灰度值，而在比擬WB條帶灰度值時，我們還應考慮面積的關系，以面積與平均灰度相乘得出的總灰度，我們才能更準確地得出條帶之間的表達差異。2、條帶上得出的數(shù)據(jù)其實是相對于背景而言的，這個背景雖然反相之后非常黑了，但畢竟

12、不是全黑的，我們還需要扣除背景的灰度值。并且，背景盡量干凈，這就要求我們在做WB時多努力了。3、不同圖片的背景是不一樣的，不同圖片的WB條帶是不能進展相互比擬的哦。接下來附上Photoshop測量WB條帶的灰度值的操作方法，其中每一步的意義根本已在上文所介紹，對哪一步操作有不明白的小伙伴可以回過頭再看看的。步驟1:翻開軟件Photoshop一左上角翻開圖片步驟2:將圖片轉為灰度模式如果已經(jīng)為灰度，此步跳過：圖像一模式一灰度一扔掉步驟3:將條帶擺正兩種方法方法一：直接點擊正上方“拉直圖層此操作簡便，但有可能使邊緣條帶挪出界外AdobePhotoshopCC2017t比例拉直圖層清除Ximg014

13、.tif50%（灰色/8）*方法二：圖像一圖像旋轉一任意角度一確定步驟4:得到的灰度圖進展適當調(diào)整：圖像一調(diào)整一色階一調(diào)整下列圖中三個點，適當將自己的WB圖片轉成黑白比照稍明顯的樣子，如圖此步也可通過更改亮度比照度實現(xiàn)：圖像一調(diào)整一亮度/比照度步驟5:反相：圖像一調(diào)整一反相 .境事圖層文竽選捋 褪式自助眄調(diào)09t_自 5 對EtzfSt'。掘 L福經(jīng) 30 視圖 施：HH博大小1*1畫布大打、rzaec圖津4硯切顯理金HP力副國:用圖值步驟6:最左側多邊形套索工具一延條帶邊緣圈選一圖像一分析一記錄測量分析一選擇數(shù)據(jù)點可以只顯灰度值-平均值和面積，依此步依次測量各個條帶，同樣的方法選取任意一個背景測量背景灰度值。二灰度值平均值）面積OOO145.676271177.000000000232.2636S2ot.oooooo1TL0003123.392390BA1.OOOOOO0004131.8109571236,000000OOO&170.10692315.000000oooe63.6NQS/O1&12.000000LOO-Q-0.0269914446,000000步驟7:導出數(shù)據(jù)，進展處理J*+AJ3Ac£>£任借購¥漏KMl 露，Eh里事建叫修4SJ5.742-711