細(xì)胞表面分子的檢測(cè)與分析學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1細(xì)胞表面分子的檢測(cè)細(xì)胞表面分子的檢測(cè)(jin c)與分析與分析第一頁(yè)，共37頁(yè)。第2頁(yè)/共37頁(yè)第二頁(yè)，共37頁(yè)。一、新鮮實(shí)體組織樣本的制備一、新鮮實(shí)體組織樣本的制備 酶消化法。酶消化法。 常用常用(chn yn)(chn yn)的酶類(lèi)試劑：胃蛋白酶、木瓜的酶類(lèi)試劑：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等 機(jī)械法。機(jī)械法。1 1、剪碎法、剪碎法 2 2、網(wǎng)搓法、網(wǎng)搓法 3 3、研磨法、研磨法 化學(xué)處理法?；瘜W(xué)處理法。 常用常用(chn yn)(chn yn)試劑：試劑：0.2%EDTA 0.25%0.2%EDTA 0.25%胰酶胰酶+0.2%EDTA

2、+0.2%EDTA注意：除消化過(guò)程外，其余步驟最好在注意：除消化過(guò)程外，其余步驟最好在4 4度環(huán)境下操度環(huán)境下操作，提高作，提高 細(xì)胞活性。細(xì)胞活性。第3頁(yè)/共37頁(yè)第三頁(yè)，共37頁(yè)。勻，室溫放置勻，室溫放置10min，離心去上清，離心去上清，再加入溶血?jiǎng)┤苎?，反再加入溶血?jiǎng)┤苎?，反?fù)復(fù)23次，至紅細(xì)胞完全溶解。次，至紅細(xì)胞完全溶解。細(xì)胞重懸后，再進(jìn)行熒光標(biāo)細(xì)胞重懸后，再進(jìn)行熒光標(biāo)記。記。第4頁(yè)/共37頁(yè)第四頁(yè)，共37頁(yè)。(xbo)層；（4）用吸管將上層與中層之間的單個(gè)核細(xì)胞(xbo)層吸出，用生理鹽水洗兩遍，PBS重懸；（5）熒光標(biāo)記。第5頁(yè)/共37頁(yè)第五頁(yè)，共37頁(yè)。四、貼壁細(xì)胞單細(xì)胞懸液

3、的制備 （1）將培養(yǎng)細(xì)胞用0.04EDTA或0.25胰酶消化(xiohu)37分鐘， 至光鏡下見(jiàn)到貼壁細(xì)胞變圓還沒(méi)有漂浮為止，棄消化(xiohu) 液，加PBS； （2）用吸管將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來(lái)，移入離心管中； （3）離心，1000r/min，5min； （4）加PBS洗兩遍； （5）PBS重懸，將細(xì)胞吹打均勻； （6）熒光標(biāo)記。第6頁(yè)/共37頁(yè)第六頁(yè)，共37頁(yè)。n接標(biāo)記。接標(biāo)記。第7頁(yè)/共37頁(yè)第七頁(yè)，共37頁(yè)。n補(bǔ)償對(duì)照補(bǔ)償對(duì)照(duzho)n多色熒光標(biāo)記時(shí)，用于熒光光譜重疊的多色熒光標(biāo)記時(shí)，用于熒光光譜重疊的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)。第8頁(yè)/共37頁(yè)第八頁(yè)，共37頁(yè)。第9頁(yè)/共37頁(yè)第九頁(yè)，共

4、37頁(yè)。 口訣(kuju)：橫平豎直第10頁(yè)/共37頁(yè)第十頁(yè)，共37頁(yè)。第11頁(yè)/共37頁(yè)第十一頁(yè)，共37頁(yè)。第12頁(yè)/共37頁(yè)第十二頁(yè)，共37頁(yè)。樣本樣本(yngbn)的采集的采集n手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本(biobn)取材時(shí)，要避免出血或組織壞 死。深低溫保存，以免組織發(fā)生自溶，DNA降解，造成檢測(cè)結(jié)果的誤差。n采集靜脈血樣本時(shí)，要避免發(fā)生溶血。n收集培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí)，要注意選擇消化的方法和試劑。第13頁(yè)/共37頁(yè)第十三頁(yè)，共37頁(yè)。原則：時(shí)間越短越好肝素抗凝的外周血和骨髓：室溫 72小時(shí)EDTA抗凝的標(biāo)本：室溫 24小時(shí)ACD抗凝的外周血：室溫 72小時(shí)ACD不推薦用作骨髓穿刺液的抗凝粒細(xì)胞、血小

5、板功能檢測(cè)：即刻檢測(cè)單核細(xì)胞表面抗原分析： 1小時(shí)，4嗜酸性(sun xn)粒細(xì)胞表面抗原分析： 24小時(shí)，4淋巴細(xì)胞免疫表型與DNA含量的分析： 72小時(shí)第14頁(yè)/共37頁(yè)第十四頁(yè)，共37頁(yè)。第15頁(yè)/共37頁(yè)第十五頁(yè)，共37頁(yè)。 溶血，即裂解紅細(xì)胞。它是流式細(xì)胞術(shù)分析(fnx)白細(xì)胞的先決條件。溶血不好，白細(xì)胞群不能很好分開(kāi)，溶血好壞直接影響檢測(cè)結(jié)果。因此，必須對(duì)溶血過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格控制。 影響影響(yngxing)溶血的因素：采血過(guò)程溶血的因素：采血過(guò)程 溶血?jiǎng)┑氖褂萌苎獎(jiǎng)┑氖褂?實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程第16頁(yè)/共37頁(yè)第十六頁(yè)，共37頁(yè)。第17頁(yè)/共37頁(yè)第十七頁(yè)，共37頁(yè)。n流式細(xì)胞術(shù)

6、的樣本制備沒(méi)有一個(gè)黃金標(biāo)準(zhǔn)n最佳樣本制備方法需要根據(jù)具體情況獨(dú)立(dl)設(shè)定評(píng)估第18頁(yè)/共37頁(yè)第十八頁(yè)，共37頁(yè)。第19頁(yè)/共37頁(yè)第十九頁(yè)，共37頁(yè)。第20頁(yè)/共37頁(yè)第二十頁(yè)，共37頁(yè)。第21頁(yè)/共37頁(yè)第二十一頁(yè)，共37頁(yè)。淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞粒細(xì)胞粒細(xì)胞這三群細(xì)胞分別由具有不同功能(gngnng)的細(xì)胞組成這些細(xì)胞數(shù)量不等，甚至非常稀少這些細(xì)胞表達(dá)不同的標(biāo)記物，是用來(lái)區(qū)分它們的基礎(chǔ)第22頁(yè)/共37頁(yè)第二十二頁(yè)，共37頁(yè)。第23頁(yè)/共37頁(yè)第二十三頁(yè)，共37頁(yè)。第24頁(yè)/共37頁(yè)第二十四頁(yè)，共37頁(yè)。1.取新鮮抗凝血100ul，置于FCM測(cè)量管中；2.直接標(biāo)記法：加入帶熒

7、光標(biāo)記抗人的單克隆抗體 10ul，充分混勻，4閉光孵育2030min; 3.加入溶血?jiǎng)〢液600ul, 輕輕振蕩15s, 加入溶血?jiǎng)〣液260ul, 輕輕振蕩15s， 加入溶血?jiǎng)〤液100ul, 振蕩10s,上機(jī)檢測(cè)。 ACK溶血?jiǎng)?加入2mlACK溶血?jiǎng)?，充分混勻，反?yīng)5min, 1000r/min離心5min，去上清；重復(fù)一遍，用PBS洗滌1遍，收集(shuj)細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。第25頁(yè)/共37頁(yè)第二十五頁(yè)，共37頁(yè)。置) 第26頁(yè)/共37頁(yè)第二十六頁(yè)，共37頁(yè)。n無(wú)菌濾膜濾過(guò)(l u)，4保存第27頁(yè)/共37頁(yè)第二十七頁(yè)，共37頁(yè)。第28頁(yè)/共37頁(yè)第二十八頁(yè)，共37頁(yè)。第29頁(yè)/共37頁(yè)第二十九頁(yè)，共37頁(yè)。第30頁(yè)/共37頁(yè)第三十頁(yè)，共37頁(yè)。第31頁(yè)/共37頁(yè)第三十一頁(yè)，共37頁(yè)。第32頁(yè)/共37頁(yè)第三十二頁(yè)，共37頁(yè)。第33頁(yè)/共37頁(yè)第三十三頁(yè)，共