植物體細(xì)胞雜交

1、第十一章植物體細(xì)胞雜交第一節(jié)植物體細(xì)胞雜交的概念與發(fā)展歷程一、植物體細(xì)胞雜交的類型、概念植物體細(xì)胞雜交按照所用親本原生質(zhì)體的性質(zhì)可以分為三類：第一類為常用的體細(xì)胞雜交，即用雙親的體細(xì)胞原生質(zhì)體或其衍生系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)融合，再經(jīng)培養(yǎng)、篩選、鑒定等步驟得到細(xì)胞雜種； 第二類是配子間細(xì)胞雜交，即用雙親的性細(xì)胞原生質(zhì)體為融合親本，其他步驟同第一類； 第三類是配子體細(xì)胞雜交，即一個融合親本為性細(xì)胞原生質(zhì)體，另一個為體細(xì)胞原生質(zhì)體， 其他步驟同第一類。 目前仍以體細(xì)胞雜交為多，其他兩類也開始有所報道（夏鎮(zhèn)澳， 1997）。下面僅對植物體細(xì)胞雜交加以介紹。植物體細(xì)胞雜交即原生質(zhì)體融合（見圖11.9），是在植物原

2、生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上，借用動物細(xì)胞融合方法發(fā)展和完善的新型生物技術(shù)，包括原生質(zhì)體制備、細(xì)胞融合誘導(dǎo)、 雜種細(xì)胞篩選與培養(yǎng)以及雜種植株再生與鑒定等技術(shù)環(huán)節(jié)。早期，在許多植物屬內(nèi)、種間和種內(nèi)的體細(xì)胞雜交獲得雜種細(xì)胞系或雜種植株，如煙草屬、曼陀羅屬等。目前，由于植物原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是禾本科和豆科等重要糧食作物原生質(zhì)體操作關(guān)鍵技術(shù)的突破，使這兩類作物的體細(xì)胞雜交也能產(chǎn)生種間或?qū)匍g雜種（錢迎倩等，1990）。圖 11.9 原生質(zhì)體電融合（引自 Koop and Schweiger ， 1985）二、植物體細(xì)胞雜交發(fā)展歷程1960年， Kocking首次獲得通過酶法制備的高等植物原生質(zhì)體；

3、1970年， Power首次通過硝酸鈉作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行較大規(guī)模原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合；1971年， Takebe離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)首次獲得再生完整植株；1972年， Carlson首次獲得第一個植物細(xì)胞雜種粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種。1974年， Kao 采用聚乙二醇誘導(dǎo)融合法誘導(dǎo)植物細(xì)胞融合，建立了相應(yīng)的融合技術(shù)；1978年， Melchers首次獲得屬間細(xì)胞雜種（番茄馬鈴薯）；1981年， Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念；1987年， Schweiger建立了單對原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。第二節(jié)植物原生質(zhì)體融合的方法目前，誘導(dǎo)體細(xì)胞融合的方法主要有電融合法 （Zimme

4、rmann ，1982）和聚乙二醇 （ PEG）高鈣高 pH 值法（ Kao， 1977 ）。一、電融合法電融合法與 PEG 融合法相比具有三大優(yōu)點(diǎn)： 一是不存在對細(xì)胞的毒害問題； 二是融合效率高；三是融合技術(shù)操作簡便。電融合的基本過程：1、細(xì)胞膜的接觸； 2、膜的擊穿。 電融合的主要參數(shù)包括交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理時間、直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。二、聚乙二醇（ PEG）高鈣高 pH 值法優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點(diǎn)是融合過程繁瑣，PEG 可能對細(xì)胞有毒害。第三節(jié)雜種細(xì)胞的發(fā)育動態(tài)及體細(xì)胞雜種應(yīng)注意的問題一、

5、雜種細(xì)胞的發(fā)育動態(tài)誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合后會產(chǎn)生不同的融合結(jié)果（見圖胞質(zhì)雜種是指所得到的細(xì)胞雜種完全沒有供體的核基因，體基因。11.10），包括雜種和胞質(zhì)雜種。而僅僅是轉(zhuǎn)入供體的葉綠體和線粒線粒體葉綠體融合 (fusion)核異核體 (heterokaryon)胞質(zhì)雜種雜種 (hybrid)雜種 (hybrid)胞質(zhì)雜種(cybrid)(cybrid)圖 11.10 兩種遺傳上不同植物原生質(zhì)體融合后可能產(chǎn)生的結(jié)果核質(zhì)重組、細(xì)胞器重組、部分核物質(zhì)或細(xì)胞器丟失、核分裂的非同步性二、體細(xì)胞雜種選擇應(yīng)注意的問題體細(xì)胞融合可以克服常規(guī)植物育種中遠(yuǎn)緣雜交不孕性，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的交流，用以將控制優(yōu)良性狀的基因?qū)?/p>

6、入被改良的受體內(nèi)，獲得細(xì)胞雜種， 創(chuàng)造新的育種材料或優(yōu)良品系，豐富植物基因庫。 但為了將體細(xì)胞雜交技術(shù)更好地應(yīng)用于生物資源開發(fā)和作物品種改良，在進(jìn)行體細(xì)胞雜交研究時，應(yīng)考慮以下主要問題： 雜交組合的選擇。近緣種內(nèi)或種間的體細(xì)胞雜交具有較強(qiáng)的目的性，因此，在進(jìn)行雜交組合選擇時，應(yīng)選擇再生能力強(qiáng)、具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀（高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等）的野生種或近緣種， 通過細(xì)胞融合將優(yōu)良特性導(dǎo)入相應(yīng)的栽培種或近緣種，創(chuàng)造新的育種材料或新品種。 原生質(zhì)體的制備。體細(xì)胞融合一般要求新鮮、制備時間較短的原生質(zhì)體，因分離時間過長，原生質(zhì)體開始長壁，影響融合效果。 融合方法。經(jīng)改良的電融合法要優(yōu)于PEG 法，而且操作

7、簡便，對細(xì)胞無毒害作用（ Bates and Hazenkampt， 1985），誘導(dǎo)頻率較高。但由于電融合需要昂貴的電融合儀，這種方法現(xiàn)在應(yīng)用并不普遍。 PEG 法操作比較復(fù)雜，融合效果受原生質(zhì)體的生理狀態(tài)、純度、密度， PEG 的質(zhì)量和濃度，處理時間，鈣離子濃度，洗液成分以及誘導(dǎo)融合程序等因素影響較大，在融合時應(yīng)加以考慮。 選擇雜種的方法。應(yīng)用遺傳或生理互補(bǔ)的選擇方法能夠在愈傷組織水平或再生植株中有效地選擇雜種。 但應(yīng)考慮到雜種細(xì)胞生長發(fā)育過程中染色體的丟失，即通過遺傳互補(bǔ)選擇法進(jìn)行雜種細(xì)胞選擇時， 淘汰了喪失標(biāo)記基因的體細(xì)胞雜種。 因此，進(jìn)行雜種選擇時要小心謹(jǐn)慎。 由雜種細(xì)胞誘導(dǎo)獲得再生植株是否為雜種的鑒定方法。根