高效液相色譜簡介及操作

1、高效液相色譜高效液相色譜 High-Performance Liquid Chromatography，HPLC高效液相色譜概述及原理高效液相色譜概述及原理主要注意事項主要注意事項基本操作步驟基本操作步驟高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)主要內(nèi)容主要內(nèi)容1234一、高效液相色譜概述及原理一、高效液相色譜概述及原理 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）是在）是在20世紀世紀70年代在年代在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上迅速發(fā)展起來經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上迅速發(fā)展起來的一種高效、快速的分離分析技術(shù)。的一種高效、快速的分離分析技術(shù)。1.色譜的演化色譜的演化 色譜色譜：由于不同的組分

2、與固定相作用強弱不同，在一定的推動力下，它們在固定相中滯留的時間長短不一，從而使它們按一定順序從色譜柱中先后流出。經(jīng)典的柱色譜經(jīng)典的柱色譜 漸漸地，人們以傳統(tǒng)色譜為藍本開發(fā)了氣相色譜氣相色譜示意圖經(jīng)典的柱色譜 高效液相色譜高效液相色譜：效仿氣相色譜，用高壓輸液泵將流動相輸入高柱效色譜柱，使其在柱內(nèi)快速流動，并在柱末端附加檢測器檢測分離情況。高效液相色譜就這樣誕生了。高效液相色譜儀就這樣誕生了高效液相色譜儀就這樣誕生了LCGCHPLC填料顆粒?。ㄌ盍项w粒小（210m），受到的阻力較大，為了能迅速地通過），受到的阻力較大，為了能迅速地通過色譜柱，必須對載液施加色譜柱，必須對載液施加1530MPa的

3、高壓。的高壓。由于采用高壓，載液在色譜柱內(nèi)的流速可達由于采用高壓，載液在色譜柱內(nèi)的流速可達l10mLmin，因而，因而所需分析時間少。所需分析時間少。 使用細、規(guī)則、孔淺的顆粒做為固定相，分離效率大大提使用細、規(guī)則、孔淺的顆粒做為固定相，分離效率大大提高。高。采用紫外、熒光、蒸發(fā)激光散射、電化學、采用紫外、熒光、蒸發(fā)激光散射、電化學、質(zhì)譜質(zhì)譜等檢測器，等檢測器，檢測靈敏度高。紫外檢測器檢測限可達檢測靈敏度高。紫外檢測器檢測限可達0.01n g；熒光和電化；熒光和電化學檢測器可達學檢測器可達0.1pg。2.為什么叫高效液相色譜為什么叫高效液相色譜?HPLC和經(jīng)典液相色譜法的比較和經(jīng)典液相色譜法的

4、比較3.高效液相色譜法的分類高效液相色譜法的分類通常將液相色譜法按分離機理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色通常將液相色譜法按分離機理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。譜法和凝膠色譜法四大類。4.如何閱讀色譜圖？如何閱讀色譜圖？tR：保留時間；tM：死時間； ：調(diào)整保留時間；W：峰寬 定性分析：在同一色譜系統(tǒng)中相同物質(zhì)具有相同的保留值 定量分析：組分含量與其響應值（峰高或面積）成正比5.如何評價色譜峰？如何評價色譜峰？ 柱效：描述被分離組分的集中程度。柱效越高，組分越集中，對應色譜峰的峰寬越窄。可用理論塔板高度H描述。H越小，柱效越高。 選擇性：描述不同組分的分離程度。

5、選擇性越高兩個色譜峰頂相距越遠。用R表示nLH （a）柱效和分離度都不好；（b）分離度高，柱效低；（c）理想色譜峰 用分離度R可以描述選擇性和柱效的總效能R值越大，表明兩組分的分離程度越高，R=1.0時，分離程度可達98%，R1.0時兩峰有部分重疊，R=1.5時，分離程度達到99.7%.所以，通常用R=1.5作為相鄰兩色譜峰完全分離的指標.分析未知物質(zhì)分析未知物質(zhì)-聯(lián)用技術(shù)聯(lián)用技術(shù) 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 色譜-核磁共振聯(lián)用 色譜-傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀聯(lián)用二、高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)二、高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu) 液相色譜儀由液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)以以及及檢

6、測和記錄系統(tǒng)檢測和記錄系統(tǒng)四大部分組成。此外，可根據(jù)需要配四大部分組成。此外，可根據(jù)需要配置流動相在線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動進樣系統(tǒng)置流動相在線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動進樣系統(tǒng)、柱后反應系統(tǒng)和全自動控制系統(tǒng)等。、柱后反應系統(tǒng)和全自動控制系統(tǒng)等。高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程圖1 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)有貯液器、高壓泵及壓力表等組成，核心高壓輸液系統(tǒng)有貯液器、高壓泵及壓力表等組成，核心部件是高壓泵。部件是高壓泵。（1） 貯液器貯液器 流動相貯液器，一般由玻璃、不銹鋼或聚四氟乙烯塑料制成，常用流動相貯液器，一般由玻璃、不銹鋼或聚四氟乙烯塑料制成，常用體積為體積為0.52L。 流動相

7、溶劑放入貯液器之前必須經(jīng)過過濾和脫氣處理。流動相溶劑放入貯液器之前必須經(jīng)過過濾和脫氣處理。常用脫氣方法：超聲脫氣、加熱脫氣、真空脫氣、吹氮脫氣等。常用脫氣方法：超聲脫氣、加熱脫氣、真空脫氣、吹氮脫氣等。（2） 高壓輸液泵高壓輸液泵主要部件之一，泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果主要部件之一，泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性，常用的壓力范圍：的可靠性，常用的壓力范圍：(150350)105 Pa。 輸液泵應具備如下性能：輸液泵應具備如下性能： 流量穩(wěn)定；流量穩(wěn)定； 流量范圍寬；流量范圍寬； 輸出壓力高；輸出壓力高； 液缸容積小；液缸容積??； 密封性能好，耐腐蝕密

8、封性能好，耐腐蝕。高壓泵的分類高壓泵的分類往復式柱塞泵分類分類恒流泵恒流泵恒壓泵恒壓泵螺旋注射泵柱塞往復泵柱塞往復泵隔膜往復泵2 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng) 進樣方式：注射器進樣、閥進樣、自動進樣。進樣方式：注射器進樣、閥進樣、自動進樣。 早期使用注射器進樣，現(xiàn)在大都使用耐高壓的早期使用注射器進樣，現(xiàn)在大都使用耐高壓的六通閥進六通閥進樣樣或自動進樣?；蜃詣舆M樣。六通閥的結(jié)構(gòu)：六通閥的結(jié)構(gòu)：色譜柱色譜柱 是高效液相色譜的心臟。是高效液相色譜的心臟。 柱管多用柱管多用不銹鋼不銹鋼制成。制成。 兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，防止填料漏出。兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，防止填料漏出。 填料的粒度多為填料的粒度多為0.2-2

9、0 m(5-10m) 。 發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。 常規(guī)分析柱：內(nèi)徑常規(guī)分析柱：內(nèi)徑25mm(常用常用4.6mm，3.9mm)，柱長柱長1030cm (15cm，25cm居多）。居多）。 3 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。4 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)主要作用：主要作用：監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化，并由監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化，并由工作站記錄數(shù)據(jù)，定性、定量分析。工作站記錄數(shù)據(jù)，定性、定量分析。高效液相色譜常用的檢高效液相色譜常用的檢測器有測器有紫外檢測器紫外檢測器、示示差折光檢測

10、器差折光檢測器和和熒光檢熒光檢測器測器等。等。 原理原理：朗伯：朗伯-比爾定律比爾定律a. 紫外檢測器紫外檢測器(UVD)：應用最廣泛的檢測器。：應用最廣泛的檢測器。特點特點：使用面廣；：使用面廣； 靈敏度高（檢測下限為靈敏度高（檢測下限為10-10gml）；）； 線性范圍寬；線性范圍寬； 對溫度和流速變化不敏感；對溫度和流速變化不敏感； 可檢測梯度溶液洗脫的樣品。可檢測梯度溶液洗脫的樣品。 缺點缺點：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應小于檢測波長。應小于檢測波長。b. 示差折光檢測器示差折光檢測器 (RID)原理原理：監(jiān)測參比池和測量池中

11、溶液的折射率之差：監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測量試樣濃度。來測量試樣濃度。特點特點： 通用性檢測器；通用性檢測器； 對溫度變化比較敏感，要保持在對溫度變化比較敏感，要保持在0.001； 靈敏度低靈敏度低(10-6g)； 對溶劑變化敏感，不適用于梯度洗脫。對溶劑變化敏感，不適用于梯度洗脫。凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統(tǒng)。用此檢測系統(tǒng)。 c. 熒光檢測器熒光檢測器 (FLD)原理原理: 某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見光某

12、些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見光(熒光熒光)的性的性質(zhì)檢測。質(zhì)檢測。特點特點: 選擇性檢測器，靈敏度比紫外檢測器高選擇性檢測器，靈敏度比紫外檢測器高2-3個數(shù)個數(shù)量級，可達到量級，可達到 10-12g；選擇性好，對流量和溫度敏感性低。；選擇性好，對流量和溫度敏感性低。缺點缺點：只適合于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的檢測。：只適合于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的檢測。只適用于只適用于具有熒光的有機化合物（如多環(huán)芳烴、氨基具有熒光的有機化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測定。酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測定。 d. 蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD) 通過檢測光散射程度而測定溶質(zhì)通

13、過檢測光散射程度而測定溶質(zhì)濃度的檢測器。濃度的檢測器。工作原理工作原理:適用檢測揮發(fā)性低于流動相的組分，主要用于檢測糖類，適用檢測揮發(fā)性低于流動相的組分，主要用于檢測糖類，高級脂肪酸，磷脂，高級脂肪酸，磷脂， 維生素，氨基酸，甘油三酯及甾體等。維生素，氨基酸，甘油三酯及甾體等。適用范圍：適用范圍：5 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。開展。三、高效液相色譜基本操作步驟三、高效液相色譜基本操作步驟（1）檢查電源線連接是

14、否正確后打開電源開關(guān)）檢查電源線連接是否正確后打開電源開關(guān)（2）泵體及流路內(nèi)的氣泡排除）泵體及流路內(nèi)的氣泡排除（3）正確連接色譜柱）正確連接色譜柱 注意流向標志，切勿反接注意流向標志，切勿反接（4）系統(tǒng)平衡）系統(tǒng)平衡 第一步：先用甲醇或乙腈沖洗流路約第一步：先用甲醇或乙腈沖洗流路約20分鐘，平衡活化色分鐘，平衡活化色譜柱，并趕走管路中的雜質(zhì)和水分。譜柱，并趕走管路中的雜質(zhì)和水分。第二步：平衡色譜柱第二步：平衡色譜柱 方法一：若流動相為有機相與水相的混合物，則第一方法一：若流動相為有機相與水相的混合物，則第一步完成后，按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)有機相與水相的比例步完成后，按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)有機相

15、與水相的比例后沖洗流路約后沖洗流路約30分鐘后，待基線走平后即可進樣。分鐘后，待基線走平后即可進樣。 方法二：若流動相中含有緩沖鹽溶液、有機方法二：若流動相中含有緩沖鹽溶液、有機/無機酸，無機酸，則第一步完成后，先用則第一步完成后，先用95%的去離子水沖洗流路約的去離子水沖洗流路約20分鐘分鐘后，再按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)流動相的比例，沖洗流路后，再按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)流動相的比例，沖洗流路約約30分鐘，待基線走平后即可進樣。分鐘，待基線走平后即可進樣。 （5）色譜柱平衡后，打開檢測器（開燈）色譜柱平衡后，打開檢測器（開燈）（6）測定樣品）測定樣品（7）清洗儀器）清洗儀器 色譜柱及流路清洗 進樣閥清洗 進樣針清洗 四、主要注意事項四、主要注意事項1 泵使用的注意事項泵使用的注意事項 防止任何固體微粒進入泵體（用0.22 um或0.45 um的微孔濾膜過濾） 流動相不應含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖鹽的流動相不應保留在泵內(nèi)更不允許留在柱內(nèi)。 泵工作時防止溶劑瓶內(nèi)的流動相用完，否則空泵運轉(zhuǎn)一是會使大量空氣進入柱內(nèi)柱床崩塌、也會磨損柱塞、密封圈，最終產(chǎn)生漏液。 輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力