生化-研究生實驗3 重組質粒DNA提取及雙酶切鑒定ppt課件

1、2019級研究生級研究生分子生物學技術分子生物學技術銀銀 巍巍生物化學教研室生物化學教研室實驗三實驗目的實驗目的掌握質粒提純的原理和方法掌握質粒提純的原理和方法; ;掌握核酸內切酶切割質粒的原理并學掌握核酸內切酶切割質粒的原理并學會運用內切酶會運用內切酶. . 預習：基因克隆示意圖 載體DNA(限制性內切酶切開)目的基因宿主細胞重組體已轉化的宿主細胞陽性克隆株繁殖表達基因克隆操作過程：基因克隆操作過程： 分分分離載體和目的基因分離載體和目的基因 切切限制酶切載體與目的基因限制酶切載體與目的基因接接拼接重組體拼接重組體 轉轉轉入受體菌轉入受體菌 篩篩篩選重組

2、體篩選重組體 基因載體gene vector）78一一.質粒質粒DNA的制備的制備1 關于質粒的概念關于質粒的概念a.什么是質粒什么是質粒plasmid）？）？b.質粒的本質是什么？質粒的本質是什么？c.質粒有哪些構型？質粒有哪些構型？c.質粒有哪些特點？質粒有哪些特點？d.質粒的用途有哪些？質粒的用途有哪些？9(1)(1)質粒的定義質粒的定義 質粒是存在于細菌體內、獨立于染色質粒是存在于細菌體內、獨立于染色體的、可以自主復制的一類雙鏈環(huán)狀體的、可以自主復制的一類雙鏈環(huán)狀DNADNA，在細胞內它們常以共價閉環(huán)的超螺旋在細胞內它們常以共價閉環(huán)的超螺旋(supercoil)(supercoil)形

3、式存在。形式存在。 10 超螺旋超螺旋DNA(SC DNA)DNA(SC DNA)(2)(2)質粒的三種構型質粒的三種構型11 開環(huán)DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就發(fā)生旋轉而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。12 線狀線狀DNA(linear DNA,L DNA):DNA(linear DNA,L DNA): 如果兩條鏈均斷開，即為線狀如果兩條鏈均斷開，即為線狀DNADNA。電泳時，三者泳動速度大小關系（？）電泳時，三者泳動速度大小關系（？） 13(3)(3)質粒質粒DNADNA的一般特性：的一般特性： 質粒是細菌內的共生

4、型遺傳因子質粒是細菌內的共生型遺傳因子, ,有相對有相對獨立性。獨立性。 它能在細菌中垂直遺傳并賦予宿主細胞它能在細菌中垂直遺傳并賦予宿主細胞一些表型。一些表型。 它是雙鏈閉合環(huán)狀它是雙鏈閉合環(huán)狀DNADNA，分子量大小不等。，分子量大小不等。14(4)(4)提取質粒提取質粒DNADNA的目的與意義（？）的目的與意義（？） 基因載體基因載體/ /基因克隆基因克隆/ /基因工程基因工程2 提取質粒DNA的常規(guī)方法:2.1 核酸分離純化的總原則： 保證核酸一級結構完整 排除其他分子的污染蛋白質、脂類、 糖、有機溶劑、金屬離子、其他DNA、RNA等）3.2 3.2 分離純化質粒分離純化質粒DNA D

5、NA 的主要步驟的主要步驟培養(yǎng)細菌使質粒擴增培養(yǎng)細菌使質粒擴增DNA的擴增與選擇）的擴增與選擇）細菌的收集與裂解細菌的收集與裂解 搜集搜集高速離心的方法高速離心的方法質粒質粒DNA的純化的純化 所有純化方法都是利用了質粒所有純化方法都是利用了質粒DNA相對較小及共價閉合環(huán)相對較小及共價閉合環(huán)狀的性質。狀的性質。3. SDS-3. SDS-堿裂解法提取質粒堿裂解法提取質粒DNADNA3.1 3.1 實驗原理：實驗原理：在有在有EDTAEDTA及去污劑及去污劑SDSSDS存在的條件存在的條件下，用堿處理細菌，可以使細菌的細胞下，用堿處理細菌，可以使細菌的細胞壁破裂，釋放出細胞內容物染色體壁破裂，釋

6、放出細胞內容物染色體DNADNA、質粒質粒DNADNA、蛋白質和、蛋白質和RNARNA等）；處理過程等）；處理過程中，染色體中，染色體DNADNA斷裂成不同長度的雙鏈斷裂成不同長度的雙鏈DNADNA。17強堿環(huán)境pH12.0-12.6時：宿主菌的線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質粒DNA共價閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離；當加入高濃度酸性鹽，pH值恢復至中性時：變性的染色體DNA與變性的蛋白質以及細胞碎片凝聚成網絡狀大分子不溶性沉淀物；而質粒DNA又恢復天然構型，能溶解在上清液中，這樣通過離心可以把染色體DNA、蛋白質-SDS復合物等一起除去。18如果要提高DNA的純度，則可以用R

7、NA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質。19溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTA、TrisCl組成組成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的減少抽提過程中的 機械機械 剪切作用剪切作用,防止破壞質粒防止破壞質粒.(保護作用保護作用) EDTA 的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子,防止防止DNA酶對酶對質粒分子的降解作用。（保護作用）質粒分子的降解作用。（保護作用） TrisCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍緩沖作用范圍緩沖作用）20 溶液溶液II：由：由SDS十二烷基硫酸鈉與十二烷

8、基硫酸鈉與NaOH組成組成 SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之的作用是解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之 變性裂解細胞和蛋白質變性作用）變性裂解細胞和蛋白質變性作用） NaOHPH12的作用是破壞氫鍵，使的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性分子變性DNA變性作用）變性作用） 21溶液溶液IIIIII：HACHAC和和KACKAC組成的高鹽溶液組成的高鹽溶液( (復性作用復性作用) )HACHAC溶液能中和溶液溶液能中和溶液的堿性，使染色體的堿性，使染色體DNA DNA 變性而發(fā)生纏繞并使質粒變性而發(fā)生纏繞并使質粒DNADNA復性。復性。KACKAC會與會與SDSSDS溶解度很低的鹽，并

9、與蛋白質形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質形成 沉淀而除去；溶液中的沉淀而除去；溶液中的DNADNA也會與蛋白質也會與蛋白質-SDS-SDS 復合物纏繞成大分子而與小分子質粒復合物纏繞成大分子而與小分子質粒DNADNA分離。分離。 實實驗驗步步驟驟及及注注意意事事項項加加1.5ml培養(yǎng)物于培養(yǎng)物于EP管，管，12000rpm30S 除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的100 l溶液溶液I，顛倒，顛倒EP管，混勻管，混勻 加入加入200l溶液溶液II，溫和混勻，冰浴，溫和混勻，冰浴35min 加入加入150l冰溶液冰溶液III，溫和混勻，冰浴，溫和混勻，冰浴35min，12000rpm5min 轉移

10、上清到新轉移上清到新EP管，加入等體積酚，管，加入等體積酚，12000rpm5min 轉移上清到新轉移上清到新EP管，加入等體積氯仿管，加入等體積氯仿/異戊醇，異戊醇，12000rpm5min 上層水相轉移到新上層水相轉移到新EP管，加入管，加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，倍體積無水乙醇，顛倒混勻，-20 冰箱中放置冰箱中放置20min，120005min 棄上清，沉淀中加棄上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，乙醇，12000rpm5min 去上清，管平放室溫靜置去上清，管平放室溫靜置1015min ， 20 l TE 溶解溶解DNA 本卷須知：本卷須知： 1、加樣槍正確使用；、加樣槍正確使用；

11、 2、標記自己所提取的質粒類型、標記自己所提取的質粒類型pUC119-U6 ）；）； 3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中；、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要換槍頭；、加不同溶液要換槍頭； 5、離心前把管擦干；、離心前把管擦干； 6、轉移上清時不要吸到沉淀；、轉移上清時不要吸到沉淀； 7、吸取酚時槍頭伸到下層溶液中，注意不、吸取酚時槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到要沾到 皮膚。皮膚。二、限制性內切酶切割重組質粒二、限制性內切酶切割重組質粒 1 限制性核酸內切酶(restriction endonuclease） 能在特異位點酶切位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產生相應的限制

12、性DNA片段。 主要存在于細菌體內。 切割不同來源的DNA分子將產生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應用價值（“分子手術刀”）。25作用作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源限制外源DNA， 保護自身保護自身DNA。分類分類、（基因工程技術中常用（基因工程技術中常用型）型）第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發(fā)現的先后次序。用羅馬數字表示發(fā)現的先后次序。命名命名Hin d

13、 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結構回文結構(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口、粘端切口：平端切口、粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口pUC18/19酶切位點的分布示意圖2 BamHI 、Hind酶切重組質粒及鑒定酶切重組質粒及鑒定1 實驗原理： 利用限制性內切酶特異的識別DNA特異的核苷酸序列，并切割DNA,

14、產生一定長度的DNA片段，通過電泳對酶切前后產物分析可以鑒別目的基因重組質粒DNA）32重組質粒重組質粒BamHIHind III雙酶切雙酶切電泳檢測電泳檢測5-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III2 實驗材料: 重組質粒; BamHI 、Hind 限制性內切酶;反應緩沖液;瓊脂糖凝膠電泳所需試劑和設備。343 實驗步驟:A 建立反應體系B 酶切反應溫育1-3h）C 電泳鑒定354、雙酶切體系： 質粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l ddH2O 6l 36合