產(chǎn)品中大腸埃希菌的檢測

1、產(chǎn)品中大腸埃希菌的檢測1實驗?zāi)康模簷z測產(chǎn)品中的大腸埃希菌2實驗步驟2.1 儀器恒溫培養(yǎng)箱（3035C）、生化培養(yǎng)箱（23-28C）、微波爐、電磁爐、勻漿儀、恒溫水浴、電熱干燥箱（250300C）、電冰箱、366nm紫外燈、蒸汽壓力滅菌器（使用時要進行生物指示劑滅菌效果檢查并應(yīng)定期請有關(guān)部門檢定）。電子天平或天平（感量0.1g）,pH系列比色計。錐形瓶、滴管、培養(yǎng)皿、試管、量筒、試管及塞、吸管、載玻片、蓋玻片、火柴、記號筆、酒精燈、酒精棉球或碘伏棉球。無菌氯化鈉溶液、無菌氯化鈉一蛋白月東緩沖液、無菌聚山梨酯80、大腸埃希菌、靛基質(zhì)、接種環(huán)、結(jié)晶紫、碘液、95溫醇、沙黃染液培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊

2、脂、膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基、MU箔養(yǎng)基、EMB2.1.1 0.9%無菌氯化鈉溶液：取氯化鈉9.0g,加水溶解至1000mL121c滅菌20min。2.1.2 pH7.0無菌氯化鈉一蛋白月東緩沖液：取磷酸二氫鉀3.56g,磷酸氫二鈉7.23g,氯化鈉4.30g,蛋白月東1.0g,加水1000mL微溫溶解，分裝，過濾，滅菌。2.1.3 無菌聚山梨酯80氯化鈉溶液：取吐溫801mL加0.9%ft化鈉溶液至100mL121c滅菌20min2.1.4 靛基質(zhì)試液：取對二甲氨基苯甲醛10.0g,加入戊醇150g,充分振搖，完全溶解后，取濃鹽酸50mL徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，置冰箱保

3、存，備用。2.1.5 沙黃染液：取沙黃0.25g,力口95%的乙醇10mL使完全溶解后，加水至100mL2.1.6 結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫1.0g,加95%的乙醇20mL使溶解，加1%勺草酸鏤溶液80mL混勻。靜置#23使用，置密閉棕色瓶中儲存。2.1.7 碘試液：取碘化鉀2.0g，加水3-5mL溶解，加入碘片1.0g,全部溶解后，加水稀釋至300mL置密閉棕色瓶中儲存。2.1.8 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白月東10g,牛肉浸出粉3g,氯化鈉5g,水1000mL取上述成分，混合，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.20.2,滅菌。2.1.9 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：牛肉膏3

4、g蛋白月東10gNaCl5g瓊月旨15-17g蒸儲水1000mLpH7.4將除瓊脂以外的各成分溶解于水中，以1moL/LNaOH溶液校正pH7.4,分裝三角瓶，而后按培養(yǎng)基的量加入1.5%-1.7%瓊脂，0.1Mpa滅菌20min后倒平板備用。2.1.10 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）:蛋白月東20g,乳糖5g,氯化鈉5g,磷酸氫二鉀（&HPQ1g,磷酸二氫鉀（KHPO）1.3g,牛膽鹽（或去氧膽酸鈉0.25g）1.3g,水1000mL除乳糖、牛膽鹽外，取上述成分，混合，加熱溶解后，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.20.2,煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽，分裝，滅菌。2.1.11 4一甲基傘形酮葡萄糖甘酸蛋白月

5、東培養(yǎng)基（MUG：蛋白月東10g,氯化鈣50mg硫酸鎰0.5mg,硫酸鋅0.5mg,硫酸鎂0.1g,氯化鈉10g,磷酸二氫鉀（無水KHPO）0.9g,磷酸氫二鈉（無水NaHPQ,亞硫酸鈉40mg去氧月!酸鈉1g,4一甲基傘形酮葡萄糖甘酸75mg水1000mL除4一甲基傘形酮葡萄糖甘酸外，上述各成分溶解于1000mL水中，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.30.1，加入4一甲基傘形酮葡萄糖甘酸，溶解后，每管分裝5mL115C,滅菌20min。2.1.12 曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100mL20%L糖溶液5mL曙紅鈉指示液2mL亞甲藍指示液1.31.6mL取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至

6、60C,按無菌操作加入滅菌的其它三種溶液，搖勻，傾注平皿。2.1.13 曙紅鈉指示液：取曙紅鈉2.0g,加水溶解成100mL2.1.14 亞甲藍指示液：取亞甲藍0.5g,加水溶解成100mL2.2 對照用菌液的制備：取大腸埃希菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置36c1C,培養(yǎng)1824h,取均勻培養(yǎng)物1mL用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1mL含菌10100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對照試驗的同時用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定。2.3 供試液的制備：取供試品10g,力DpH7.0無菌氯化鈉一蛋白月東緩沖液至1000mL用勻漿儀(30005000r/min2

7、-4min)或其他有效的方法，混勻，作為供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80,并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。2.4 陽性對照試驗各供試品進行控制菌檢查時，應(yīng)做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10-100cfu,供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的各控制菌檢查。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。已做驗證試驗的供試品，在該供試品檢查時不必再做陽性對照。2.5 陰性對照試驗取稀釋劑10ml加入100ml(或200ml)相應(yīng)控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無菌生長。2.6 檢驗程序瞅岫扁哪嘏觸In她附解r崎fBL糊麴Lem瞰1型部轎則鞋電池產(chǎn)加加鞭嬲惆體協(xié)C儺J肅攤2.6.1 增菌培養(yǎng)

8、取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基2份，每份各100ml。1份加入10ml供試液（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm）,另1份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。培養(yǎng)18-24小時，必要時可延至48小時。陰性對照應(yīng)無菌生長。取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5mlMU能養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24小時在366nm紫外光下觀察，同時用未接種的MU箔養(yǎng)基作本底對照。在紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)藍白色熒光，為MUG日性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG1性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照的MU0口靛基質(zhì)試驗應(yīng)為陰性。如MUG日性、靛基質(zhì)陽性，判供試

9、品檢出大腸埃希菌；如MU瑚性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。2.6.2 分離培養(yǎng)如呈現(xiàn)MUG日性、靛基質(zhì)陰性或MUGm生、靛基質(zhì)陽性時，應(yīng)將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1-2環(huán)培養(yǎng)液劃線于;EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18-24h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅業(yè)甲藍瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕

10、潤當(dāng)陽性對照的平板呈典型菌落生長時，若EM限麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與上表所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，應(yīng)挑取可疑菌落進行分離、純化、染色鏡檢和IMViC試驗，確認(rèn)大腸埃希菌。2.6.3 純培養(yǎng)如EMB或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與上表所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2-3個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18-24h,作以下檢查。如平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于EM琳脂平板，培養(yǎng)18-24h,再挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。2.6.4 革蘭染色、鏡檢以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰2-3次（載玻片不燙手）固定。滴加結(jié)晶紫染液，染色1min,水洗。滴加碘液，媒染1min,水洗，以濾紙吸干余水。滴加95溫醇，脫色20-30S,水洗。滴加沙黃染液，復(fù)染1min,待干后，鏡檢。染色結(jié)果判定：革蘭陽性菌呈藍紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，