磷酸鹽緩沖液PBS配制方法

1、實(shí)驗(yàn)方案 鑭鈰對(duì)銅脅迫下豌豆種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響1.La()、Ce()對(duì)重金屬脅迫下種子萌發(fā)影響的顯效劑量篩選(1)濃度梯度設(shè)計(jì)：LaCl3/ CeCl 3溶液配置：先配置1gL-1的LaCl3/ CeCl 3溶液母液，然后將母液分別稀釋成濃度為5、10、20、40，60 mgL-1梯度濃度，調(diào)節(jié)PH（HCL/NAOH）至6.5，對(duì)照(CK)為PH調(diào)節(jié)至6.5的去離子水。重金屬Cuso4濃度的設(shè)置： 10、25、50、100、200、400 mgL-1，對(duì)照用蒸餾水。(2)試材培養(yǎng)種子預(yù)處理：選取均勻飽滿(mǎn)的豌豆種子用0.1%HgCl2溶液消毒15min，分別用自來(lái)水和去離子水洗凈，常溫下晾干備

2、用。（3）實(shí)驗(yàn)設(shè)置：CK，La，Ce，Cu（共4組18個(gè)濃度57個(gè)樣品）（4）試材處理：選取LaCl3、 CeCl3和 CuSO4各個(gè)梯度溶液溶液，豌豆種子經(jīng)預(yù)處理后用各個(gè)梯度溶液浸沒(méi)處理，對(duì)照用蒸餾水，置于25±1浸種24h后，將處理后種子均勻排列在直徑9cm、墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每處理加入一定量水培養(yǎng)（以沒(méi)過(guò)種子2/3為標(biāo)準(zhǔn)），每處理3皿重復(fù)，每皿20粒。指標(biāo)測(cè)定方法：種子發(fā)芽第三天測(cè)淀粉酶，第四天測(cè)發(fā)芽勢(shì)，前三天測(cè)發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率，第五天測(cè)量根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)，第六天測(cè)根系活力、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、SOD、POD、CAT、MDA.2 La()和Ce()對(duì)重金屬脅迫下

3、種子萌發(fā)及保護(hù)酶的影響(1)試材培養(yǎng)種子預(yù)處理：選取均勻飽滿(mǎn)的豌豆種子用0.1%HgCl2溶液消毒15min，分別用自來(lái)水和去離子水洗凈，常溫下晾干備用。（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)置：在上一步驟中分別篩選出LaCl3、CeCl3的低劑量、適宜劑量、高劑量三個(gè)有效濃度和CuSO4的一個(gè)有效濃度，分別記為A1，A2，A3；B1，B2，B3；C。（3）實(shí)驗(yàn)步驟：有以下幾組：A+C:A1+C、A2+C、A3+CB+C:B1+C、B2+C、B3+CA+B+C：A1+B1+C 、A1+B2+C 、A1+B3+C、 A2+B1+C、 A2+B2+C、A2+B3+C、A3+B1+C 、A3+B2+C、 A3+B3+C酸鹽緩

4、沖液（PBS）配制方法磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（0.2M） pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml 7.0 61.0 39.07.7 89.5 10.57.8 91.5 8.5 Na2HPO4·2H2O分子量178.05 0.2M溶液含35.61g/L Na2HPO4·12 H2O分子量358.22 0.2M溶液含71.64g/L NaH2PO4·H2O分子量138.01 0.2M溶液含27.6g/L NaH2PO4·2H2O分子量156.03 0.2M溶液含31.21g/L 0.01M PBS PBS (13

5、5 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, and 8 mM K2HPO4，pH 7.2)PBS緩沖液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L 稱(chēng)7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4(or 1.44g Na2HPO4)和1.8g K2HPO4，溶于800 ml 蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L。保存于4冰箱中即可。母液的配制： 0.2M Na2HPO4：稱(chēng)取 71.6g N

6、a2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水0.2M NaH2PO4：稱(chēng)取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水各種濃度PB(pH=7.4)的配制：先配 0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4， 81ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 即可。然后 只需將0.2M PB (pH=7.4)按相應(yīng)比例適當(dāng)稀釋 即可，如：0.1M PB（PH=7.4） ：取 500ml 0.2M PB，加水稀釋至 1000ml 即可。0.01M PB （PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀釋至 1000m

7、l 即可。0.02M PB （PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀釋至 1000ml 即可。 若需要 NaCl的話，加入 NaCl 至0.9%（g/100ml）即可。另：其它各種另 PH值的 0.2M PB（100ml)配方 ：pH       0.2M NaH2PO4（ml）         0.2M Na2HPO4（ml）7.0        &

8、#160;     38                           627.8              8.5   &

9、#160;                      91.5 0.01M 磷酸鹽緩沖液（PBS）配制方法稱(chēng)取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌（至少20分鐘），保存存于室

10、溫或4冰箱中。需要注意的是，通常所說(shuō)的濃度0.01M 指的是緩沖溶液中所有的磷酸根濃度，而非Na 離子或K 離子的濃度，Na 離子和K 離子只是用來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓的。如果是用于免疫組化的話，則需要在配置的時(shí)候分別加入100 u/ml青霉素和鏈霉素之后再調(diào)PH、定容、滅菌消毒。 PH            7.6      7.4         7.2

11、        7.0 H2O       1000     1000     1000     1000 NaCl         8.5      8.5   

12、60;    8.5         8.5 Na2HPO4 2.2      2.2       2.2         2.2 NaH2PO4 0.1      0.2     

13、;  0.3         0.4PBS緩沖液 稱(chēng)取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g，溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，加水定容至1L，常溫保存?zhèn)溆谩?.05mol/L PBS(磷酸緩沖液Phosphate Buffer Solution，PBS)的配制：    甲液：0.05mol/L Na2HPO4溶液 ：稱(chēng)取磷酸氫二鈉9.465g 7.099g,加蒸 餾水至1000ml

14、 ;    乙液：0.05mol/L KH2P04溶液: 稱(chēng)取磷酸二氫鉀, 9.07g 6.803g,加蒸餾水至1000m1。     將甲乙液分裝在棕色瓶?jī)?nèi)，于4冰箱中保存，用時(shí)甲、乙兩液各按不同比例混合，即可得所需pH的緩沖液,見(jiàn)下表: pH    甲液ml   乙液mI 7.17   70.0     30.0 7.38   80.0  &#

15、160;  20.0 7.73   90.0     10.0 8.04   95.0      5.0 實(shí)驗(yàn)01根系活力的測(cè)定（TTC法） （二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計(jì)；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 電子頂載天平（感量0.1g）；4. 溫箱；5. 研缽；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管10ml；10. 刻度試管10ml；11. 試管架；12. 容量瓶10ml；13. 藥勺；1

16、4. 石英砂適量；15. 燒杯10ml、1000ml。 （三）試劑：1. 乙酸乙酯（分析純）。2. 次硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末。3.1TTC溶液準(zhǔn)確稱(chēng)取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用時(shí)稀釋至各需要的濃度。4. 磷酸緩沖液（115mol/L，pH7）。5. 1mol/L硫酸用量筒取比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。6. 0.4mol/L琥珀酸稱(chēng)取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 （1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取0.4TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少許Na2S2

17、O4粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25g、50g、100g、150g、200g的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）稱(chēng)取根尖樣品0.5g，放入10ml燒杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，把根充分浸沒(méi)在溶液內(nèi)，在37下暗保溫13h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反應(yīng)。（與此同時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品，其他操作同上）。 （3）把根取出，吸干水分后

18、與乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出甲月替。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈於?、三次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量?0ml，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485nm下比色，以空白試驗(yàn)作參比測(cè)出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮唑還原量。四、結(jié)果計(jì)算 四氮唑還原強(qiáng)度（mg/g(根鮮重)/h）四氮唑還原量（mg）/根重（g）×時(shí)間(h)實(shí)驗(yàn)02 脯氨酸含量的測(cè)定 （二）儀器設(shè)備：1. 722型分光光度計(jì)；2. 研缽；3. 100ml小燒杯；4. 容量瓶；5. 大試管；6. 普通試管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴鍋；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 濾

19、紙；13 剪刀。 （三）試劑1. 酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，攪拌加熱（70）溶解，貯于冰箱中；2. 3磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）在分析天平上精確稱(chēng)取25mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每ml含脯氨酸100g。（2）系列脯氨酸濃度的配制取6個(gè)50ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為

20、1，2，3，4，5及6g/ml。（3）取6支試管，分別吸取2ml系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30min。（4）冷卻后各試管準(zhǔn)確加入4ml甲苯，振蕩30S，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。（5）用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，于520nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸濃度（X）而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量（g/2ml）。 2. 樣品的測(cè)定（1）脯氨酸的提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取不同處理的待測(cè)植物葉片各0.5g，分別置大管中，然后向各

21、管分別加入5ml3的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取過(guò)程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過(guò)濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。（3）冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下離心5min。（4）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上520nm波長(zhǎng)處比色，求得吸光度值。 四、結(jié)果計(jì)算根據(jù)回歸方程計(jì)算出（或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出）2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量（Xg/2ml），然后

22、計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下： 脯氨酸含量（g/g）X×5/2/樣重（g）。實(shí)驗(yàn)03 葉綠素含量的測(cè)定 （二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計(jì)；2. 電子頂載天平（感量0.01g）；3. 研缽；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量濾紙；7. 吸水紙；8. 擦境紙；9. 滴管。 （三）試劑：96乙醇（或80丙酮）；石英砂；碳酸鈣粉。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。2. 稱(chēng)取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23ml95乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至

23、組織變白。靜置35min。3. 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?4. 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。5. 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95乙醇為空白，在波長(zhǎng)665nm、649nm下測(cè)定吸光度。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：將測(cè)定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A6656.88A649；Cb=24.96A6497.32A665。據(jù)此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、C

24、b：mg/L），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。最后根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量：葉綠素的含量（mg/g）= 葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重（或干重）。實(shí)驗(yàn)04植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（福林酚試劑法） （二）儀器設(shè)備：1. 722分光光度計(jì)；2. 離心機(jī)；3. 恒溫水?。?. 定量加樣器；5. 冷凝回流裝置一套；6. 研缽；7. 離心管；8. 刻度移液管；9. 微量滴定管；10. 試管等； （三）試劑： 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱(chēng)取25mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸餾水中，使終濃度為250gml；試劑甲；試劑乙。首先配制A液：4%碳酸鈉（Na2CO3

25、）溶液與0.2mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液等比例混合（2%Na2CO3，0.1mol NaOH）；B液：1%硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等比例混合（0.5%CuSO4·5H2O，0.1%酒石酸鉀鈉）。在使用前將A液與B液按501的比例混合即成。此為FolIn酚試劑甲液，此試劑只能使用1天。酚試劑（相當(dāng)于Folin試劑）的配備：稱(chēng)取鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g，加蒸餾水700ml溶解于1500Ml的圓底燒瓶中。之后加入85%的H3PO450ml，濃HCl 100ml，安上

26、回流裝置（使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時(shí)，就必須用錫鉑紙包起來(lái)），使其慢慢沸騰10H。冷卻后加入硫酸鋰（Li2SO4·H2O）150g，水50ml，溴水23滴，不用回流裝置開(kāi)口煮沸15min，以釋放出過(guò)量的溴。待冷卻后稀釋至1000ml，并過(guò)濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存（冷卻后溶液呈黃色，倘若仍呈綠色，須再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)煮沸15min）。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，以酚酞作為指示劑，滴定終點(diǎn)由藍(lán)變灰，滴定后算出酸的濃度。使用時(shí)大約加水1倍，使最終濃度相當(dāng)于1mol/L H+酸，此為Folin-酚試劑乙液（Folin試劑）。在測(cè)定時(shí)要注意，因?yàn)榉釉噭﹥H在酸性條件下穩(wěn)定，但

27、此實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)只在PH值為10的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加酚試劑時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會(huì)使顯色程度減弱。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 1. 取18×200mm試管7支，17編號(hào)，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補(bǔ)足1ml，使每管含蛋白量分別為0、25、50、100、150、200、250gml。 2. 用定量加樣器給每支試管中加入5ml甲液，混勻，于30下放置10min。 3. 再向試管中噴射加入0.5ml乙液，立即振蕩混勻，在30下準(zhǔn)確保溫30min。 4. 以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白的1號(hào)管

28、為空白，在650nm下用1cm光徑的比色皿測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （二）樣品的測(cè)定 稱(chēng)取鮮樣0.8g，用5ml蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后，定容25ml過(guò)濾，取濾液1.0ml于試管中，然后重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的24步驟，以空白管調(diào)零，測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品中的蛋白質(zhì)含量。 五、結(jié)果計(jì)算： 樣品中蛋白的含量（mg/g）C×VT/（Vs×FW×1000） 式中：C查標(biāo)準(zhǔn)曲線值（g）；VT提取液總體積（ml）；FW樣品鮮重（g）；Vs測(cè)定時(shí)加樣量（ml）粗蛋白量（）蛋白氮含量×6.2實(shí)驗(yàn)05 植物組織

29、中可溶性糖含量測(cè)定（苯酚法） （二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計(jì)；2. 水浴鍋；3. 刻度試管；4. 刻度吸管。 （三）試劑：1. 90苯酚溶液稱(chēng)取90克苯酚（AR），加蒸餾水10ml溶解，在室溫下可保存數(shù)月；2. 9苯酚溶液取3ml90苯酚溶液，加蒸餾水至30ml，現(xiàn)配現(xiàn)用；3. 濃硫酸（比重1.84）；4. 1蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液將分析純蔗糖在80下烘至恒重，精確稱(chēng)取1.000克。加少量水溶解，轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，加入0.5ml濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度；5. 100g/L 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液精確吸取1蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1ml加入100ml容量瓶中，加水至刻度。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制：向試管內(nèi)加入1ml9苯酚溶液，搖勻，再?gòu)墓芤赫嬉?20S加入5ml濃硫酸，搖勻。比色液總體積為8ml，在室溫下放置30min，比色。然后以空白為參比，在485nm波長(zhǎng)下比色，以糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)直線方程。 2. 可溶性糖的提取?。喝⌒迈r植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱(chēng)取0.100.30g，共3份（或干材料），分別放入3支刻度試管中，加入510ml蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過(guò)濾入25ml容量瓶中，反復(fù)漂洗試管及殘?jiān)?，定容至刻度?. 測(cè)定 吸取0.5ml樣品液于試管中（重復(fù)2次），加蒸餾水1.5ml，同制作標(biāo)準(zhǔn)曲線