蟾酥丸中蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分的含量測定

1、摘 要目的：用高效液相色譜法分離測定蟾蜍丸中2種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物: 華蟾毒它靈、脂蟾毒配基成分含量。方法：利用高效液相色譜儀定量檢測,以Agilent Zorbax SB-C18( 250mm×416mm, 5µm)色譜柱。流動(dòng)相：乙腈- 0.5%磷酸二氫鉀溶液 (55:45，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.2)；檢測波長：296 nm。采用高效液相色譜法可以同時(shí)測定2種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的含量。該測定方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，分離效果好，靈敏度高，適用于蟾酥丸蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的質(zhì)量控制。對(duì)2家醫(yī)療機(jī)構(gòu)、2批號(hào)樣品中2種蟾蜍二烯內(nèi)酯的含量準(zhǔn)確測定了結(jié)果。關(guān)鍵詞 蟾蜍丸，蟾蜍二烯內(nèi)

2、酯，高效液相色譜法目 錄 一、蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分含量測定的目的和意義4二、蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分含量測定的實(shí)驗(yàn)儀器與材料4（一）儀器與試劑 4（二）待測樣品 4三、實(shí)驗(yàn)方法步驟5（一）色譜條件5（二）對(duì)照品溶液配制5（三）系統(tǒng)適應(yīng)性測試5（四）線性關(guān)系考察6（五）精密度試驗(yàn)6（六）穩(wěn)定性試驗(yàn)6（七）重復(fù)性試驗(yàn)6（八）回收率試驗(yàn)6（九）樣品測定7四、討論7五、結(jié)論7六、參考文獻(xiàn)7 一、蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分含量測定的目的和意義中成藥蟾酥丸具有解毒消腫，辟穢療瘡，活血定痛等特點(diǎn)。主治疔毒惡瘡、癰疽發(fā)背、附骨癰疽、乳癰乳發(fā)及無名腫毒等?，F(xiàn)代多用于急性乳腺炎、蜂窩組織炎、全身各部的化膿性感染等屬于熱毒壅盛者。

3、蟾酥丸組方成分一般為：蟾酥、雄黃、朱砂、輕粉、寒水石、枯礬、銅綠、蝸牛、麝香、膽礬、乳香、沒藥。其中蟾酥是蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物，性辛，溫;有毒。歸心經(jīng)。具有解毒，止痛，開竅醒神之功效。蟾酥中含有蟾蜍毒素類、蟾毒配基類、蟾毒色胺類等化學(xué)成分, 此類物質(zhì)有強(qiáng)心等作用，在化學(xué)上屬于甾族化合物，而其C17上再接一個(gè)-吡喃酮基，凡具有此種骨架的物質(zhì)(實(shí)際上，植物中亦有具有此種骨架的物質(zhì))，總名蟾蜍二烯內(nèi)酯，是蟾蜍漿液、蟾酥的主要有效成分。蟾酥中所含的蟾蜍二烯內(nèi)酯有：華蟾毒它靈；蟾毒靈；脂蟾毒配基；華蟾毒配基等。蟾酥具有毒性, 為保證用藥安全, 必須對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。文獻(xiàn)報(bào)道蟾蜍丸中

4、蟾酥的含量測定方法主要為控制蟾毒內(nèi)酯成分的總含量或測定某一種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分，采用的方法有紫外法、二階導(dǎo)數(shù)光譜法、薄層法、高效液相色譜法等。本實(shí)驗(yàn)采用2010版藥典對(duì)蟾酥的成分測量方法-高效液相色譜法，同時(shí)測定2種蟾蜍二烯內(nèi)酯的含量，該方法簡便、準(zhǔn)確, 重復(fù)性好, 可用于蟾酥丸的質(zhì)量控制。通過測定不同配伍方中化學(xué)成分的含量差異，可以從化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的角度揭示中藥配伍減毒增效的合理性。本實(shí)驗(yàn)將高效液相色譜法應(yīng)用于不同2家中醫(yī)院配制的蟾酥丸中2 種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的含量測定中，為其配伍研究提供參考。二、蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分含量測定的實(shí)驗(yàn)儀器與材料（一）儀器與試劑Agilent 1100高效液相色

5、譜儀, 二極管陣列檢測器, ChemStation色譜工作站。Millipore Milli-Q純水器; METTLER萬分之一及十萬分之一電子天平; 離心機(jī)TDL-5-A ( 上海安亭科學(xué)儀器廠)。乙腈(Fisher公司，色譜純)，磷酸二氫鉀(湖州化學(xué)試劑廠，分析純)；華蟾毒它靈(Cinobufotalin，上海哈靈生物科技有限公司，批號(hào)8525-121112)，脂蟾毒配基(中國藥品生物制品檢定所1302-9306)。流動(dòng)相用水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。（二）待測樣品待測樣品來自南京軒德堂中醫(yī)配制蟾酥丸，批號(hào)：121201；南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院配制蟾酥丸，批號(hào)130402。各樣品經(jīng)研缽

6、研成粉末，40目篩過濾，密閉保存。取本品細(xì)粉約200mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10ml， 超聲處理30min，過濾，殘?jiān)尤?ml甲醇，再如上重復(fù)提取2次，合并濾液，轉(zhuǎn)移至20 ml量瓶，用甲醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液，即得待測樣品溶液。三、實(shí)驗(yàn)方法步驟（一）色譜條件采用Agilent Zorbax SB-C18( 250mm×416mm, 5µm)色譜柱。流動(dòng)相：乙腈- 0.5%磷酸二氫鉀溶液 (55:45，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.2)；檢測波長：296 nm；流速：0.8 ml/min；柱溫：40；進(jìn)樣體積：10l。（二）對(duì)照品溶液配制取

7、對(duì)照品華蟾毒它靈、脂蟾毒配基適量，分別精密稱定，分別置于5ml量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為50g/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將該溶液作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品儲(chǔ)備液。（三）系統(tǒng)適應(yīng)性測試1.取對(duì)照品溶液, 在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，理論板數(shù)按華蟾毒它靈及脂蟾毒配基分別計(jì)算均不低于5500。 2.華蟾毒它靈及脂蟾毒配基二者與相鄰峰的分離度均大于1.5，其結(jié)果表明樣品中其他成分對(duì)華蟾酥毒基及脂蟾毒配基的測定無干擾。3. 分析拖尾因子（T）用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性。上述色譜條件下進(jìn)樣分析結(jié)果：拖尾因子在0.951.05之間。（四）線性關(guān)系考察取照品華蟾毒它靈、脂蟾毒配基適量，分別精密稱定，制成含華蟾酥毒基200g/ml

8、、200g/ml的混合溶液, 作為儲(chǔ)備液。分別精密量取混合溶液1，2，5，10，20，25 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述溶液各10l ，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品濃度(g/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表1所示。表1 2種蟾酥成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性相關(guān)系數(shù)和線性范圍標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程r線性范圍/g/ml華蟾毒它靈Y=1.567×104X-3.1400.99994 -100脂蟾毒配基Y=1.498×104X+3.0580.99994 -100結(jié)果表明, 華蟾毒它靈、脂蟾毒配基質(zhì)量濃度在4-100

9、g/ml范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。（五）儀器精密度試驗(yàn) 取40g/ml的華蟾毒它靈、脂蟾毒配基標(biāo)準(zhǔn)品溶液在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定峰面積。結(jié)果華蟾毒它靈、脂蟾毒配基的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD依次為2.1%、1.5%。（六）穩(wěn)定性試驗(yàn)穩(wěn)定性試驗(yàn)考察原料藥或者藥物制劑在溫度，濕度，光線等影響下隨時(shí)間變化規(guī)律。兩種待測樣品溶液，在0，3，6，9，12，15，18，21，24 h分別進(jìn)樣，按上述色譜條件分析，以峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD在0.9%1.6%之間，表明2種待測樣品至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。（七）重復(fù)性試驗(yàn)采用外標(biāo)法評(píng)價(jià)連續(xù)進(jìn)樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。對(duì)同一樣品蟾

10、酥丸(批號(hào):130402) 按待測樣品測定項(xiàng)下進(jìn)行5次平行測定，華蟾毒它靈和脂蟾毒配基的平均含量分別為1.126mg/g和2.092mg/g，RSD分別為1.3%和1.7%。（八）回收率試驗(yàn)采用加樣回收法。精密稱定已知華蟾毒它靈和脂蟾毒配基含量的蟾酥丸樣品細(xì)粉約200mg (批號(hào):130402) 6份研細(xì)，加入濃度為50g/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，以使每種標(biāo)準(zhǔn)品的加入量依次為100g、200g、400g，按待測樣品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下測定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明華蟾毒它靈在3個(gè)加樣水平的回收率在97.6% 101.2%之間，RSD為1.46%；脂蟾毒配基在3個(gè)加樣水平的回收率在96.

11、2%100.6%之間，RSD為2.08%。回收試驗(yàn)結(jié)果見表2。表 2 回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）成分樣品中量g /mg加入量g /mg測得量g /mg回收率%平均回收率%RSD%華蟾毒它靈1.1011.0002.113101.299.281.461.1401.0002.12498.41.1272.0003.10198.71.1312.0003.08297.61.1294.0005.135100.151.1264.0005.11099.6脂蟾毒配基2.1151.0003.121100.698.482.082.1091.0003.08197.22.0892.0004.01396.22.1152.00

12、04.05597.02.0314.0006.045100.352.0924.0006.07499.55（九）樣品測定分別取待測樣品溶液，在上述色譜條件下測定3次，采用外標(biāo)法計(jì)算各樣品中的華蟾毒它靈、脂蟾毒配基的含量，結(jié)果如表3所示。表3 2種蟾酥丸蟾蜍二烯內(nèi)酯成分含量批號(hào)試驗(yàn)次數(shù)華蟾毒它靈(mg/g)脂蟾毒配基(mg/g)12120111.2402.25321.2372.25431.2332.261平均值1.2362.2561304021 1.1302.1032 1.1272.10231.1222.099平均值1.1262.103四、討論（一）超聲波處理在含量測定中，主要針對(duì)蟾酥丸中的主要成分

13、設(shè)計(jì)和選擇提取工藝。考察了索氏提取、回流和超聲3種方法，并分別采用70%乙醇和甲醇兩種溶劑。結(jié)果表明3種方法提取率相當(dāng)。其中，索氏提取方法和回流方法相對(duì)復(fù)雜，在對(duì)蟾蜍二烯內(nèi)酯類的提取方面沒有顯著優(yōu)勢，因此采用超聲方法。乙醇提取液中所具有的色譜峰明顯多于甲醇提取液分析得到的色譜峰。為了避免對(duì)測定造成無謂的干擾，簡化提取工序，優(yōu)選甲醇超聲提取的方法作為提取方法。本試驗(yàn)比較了不同超聲時(shí)間(20、30、40、50、60 min)對(duì)待測樣品提取的影響, 結(jié)果顯示華蟾毒它靈和脂蟾毒配基的提取總量分別為3.359、3.426、3.485、3.482、3.472(mg/g)，表明超聲時(shí)間30min就可以滿足試

14、驗(yàn)需要。（二）流動(dòng)相選擇試驗(yàn)中曾考察了以甲醇一水(60：40)、乙腈一水（50：50）等作為流動(dòng)相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，華蟾毒它靈與脂蟾毒配基基線分離效果不佳。以乙腈- 0.5%磷酸二氫鉀溶液 (55:45，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.2)為流動(dòng)相，在偏酸性條件下，二者得到了很好的分離。（三）檢測波長利用二極管陣列檢測器的特點(diǎn)，繪出了對(duì)照品華蟾毒它靈、脂蟾毒配基對(duì)照品的紫外吸收?qǐng)D譜，結(jié)果表明華蟾毒它靈在293.1nm處有最大吸收，脂蟾毒配基在299.0nm處有最大吸收，且兩者峰形平緩，考慮到同時(shí)測定2種成分，取兩者的平均波長296.0 nm作為檢測波長。五、結(jié)論采用高效液相色譜法同時(shí)測定2種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物

15、的含量，：該測定方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，分離效果好，靈敏度高。適用于蟾酥丸蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的質(zhì)量控制。對(duì)測得的2家醫(yī)療機(jī)構(gòu)、2批號(hào)樣品中2種蟾蜍二烯內(nèi)酯的含量測定結(jié)果表明，不同企業(yè)之間的蟾酥丸中2種蟾蜍二烯內(nèi)酯的含量存在差異，這可能與蟾酥在組方中的比例、原藥材的選取或加工工藝的差異有關(guān)。六、參考文獻(xiàn)1國家藥典委員會(huì)編制：中華人民共和國藥典，中國醫(yī)藥科技出版社，2012年10月；2劉曉秋著：中藥有效成分含量測定，人民衛(wèi)生出版社, 2008年2月； 3姚彤煒主編：藥物分析，浙江大學(xué)出版社，2011年5月；4張英、邱鷹昆、劉珂、姜勇濤、陳繼勇、竇德強(qiáng)：中華大蟾蜍的研究進(jìn)展，中草藥第37卷第12期2006年12月；5 美L.R.施奈德：實(shí)用高效液相色譜法的建立，科學(xué)出版社，2000年5月；6汪秋蘭，王文清，馬永貴：高效液相色譜法在中藥有效成分含量測定中的應(yīng)用，醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)2011年11月第30卷第11期；7嚴(yán)紅：HPLC法同時(shí)測定中藥多種有效成分含量的應(yīng)用，天津藥學(xué)2010年第22卷第1期；8蘇永華、黃雪強(qiáng)、張大志、張亞妮、謝覺民、凌昌：華蟾素注射液中蟾毒內(nèi)酯類成分含量檢測，中成藥2003