蕨菜黃酮類化合物的提取與分析

1、蕨菜黃酮類化合物的提取與分析摘 要:用70 %乙醇提取蕨菜黃酮類化合物,得到粗黃酮,經(jīng)聚酰胺純化,得到精制黃酮。利用分光光度法測定了蕨菜粗黃酮、 精制黃酮中的黃酮含量,利用聚酰胺薄膜層析法及顏色反應并與標準品蘆丁、 槲皮素的試驗做比較。結(jié)果表明:蕨菜干粉中總黃酮含量為 7. 28 % ,粗黃酮、 精制黃酮中黃酮含量分別為27. 03 %和41. 25 %。蕨菜黃酮類化合物主要是黃酮和黃酮醇兩類,其中含有蘆丁成份。聚酰胺純化有一定效果,但純化過程中約70 %黃酮損失。蕨菜別名拳頭菜、 龍爪菜、 如意菜等,是藥食兩用植物,經(jīng)常食用蕨菜會有一的保健作用。它是采自蕨科蕨屬中的蕨 ( Pteridium

2、 aquilinum var . latiusculum )的幼嫩葉。作為藥用,蕨菜具有清熱滑腸,降氣化痰,利水安神,降壓等功效9 作為食用,自古以來就被人們視為山珍野菜。如今更因其生長在山林野地,少受污染,并富含對人體有益的多種營養(yǎng)成分,而倍受人們青睞。對蕨菜黃酮的提取、 純化及含量測定進行了研究,并進行了吸收光譜測定、 聚酰胺薄膜層析定性分析黃酮成分等若干分析,為蕨菜的深度加工與保健功能研究提供依據(jù)。近年來人們對蕨菜的常規(guī)營養(yǎng)成分及其采摘加工甚至人工栽培等方面都有了不少的研究，但是有關(guān)蕨菜黃酮類物質(zhì)的研究卻鮮見報道。1 材料與方法1. 1 材料采摘蕨菜長出地面 1520cm 高的幼嫩葉(嫩

3、葉拳卷期)為試驗材料。采摘地點:六安市郊區(qū)的丘陵林地。1. 2 儀器與試劑TU21201 紫外可見光分光光度計,WFH2203 型三用紫外分析儀,HH24 數(shù)顯恒溫水浴鍋,聚酰胺薄膜,蘆丁,槲皮素,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1. 3 蕨菜黃酮的提取與純化1. 3. 1 蕨菜總黃酮的提取:新鮮蕨菜 70 烘至 8 成干,然后剪成23mm碎段,再 103 烘干后研成粉末狀。準確稱取一定質(zhì)量蕨菜干粉,用索氏提取法(乙醚為抽提劑,45 水浴)脫脂及除脂溶性色素,當乙醚抽提液無色時揮盡蕨菜粉中乙醚,將蕨菜放在燒瓶中加入 70 %乙醇回流提取蕨菜總黃酮:第一次浸提加入蕨菜干粉重量的 5倍體積70 %乙醇,以

4、后每次浸提加入 3 倍體積 70 %乙醇,每次浸提約2h ,浸提溫度為90 ,直到乙醇浸提液基本無色,共浸提10 次。合并所有浸提液并適當濃縮,定容至一定體積,按此體積1 1 加入石油醚再次脫脂,棄上層石油醚,將下層乙醇浸提液定容至蕨菜干粉重量的 20 倍體積,此為蕨菜總黃酮提取液,簡稱為粗黃酮液。取一定體積粗黃酮液在水浴中進行減壓濃縮成漿狀并于103 烘干,粉碎得到粗黃酮粉,可計算粗黃酮粉得率。1. 3. 2 蕨菜黃酮的初步純化:稱取粗黃酮粉 1. 30g ,加水約100ml ,經(jīng)水浴加熱溶解后上聚酰胺柱(聚酰胺事先已105 活化1h) ,裝柱30cm高,柱內(nèi)徑為2. 5cm。上柱充分吸附后

5、,先用蒸餾水洗至無色,然后用 95 %乙醇洗脫,洗脫速度約為 1. 5ml/ min ,洗脫至無色時為止,收集洗脫液在90 水浴上蒸干后于 103 烘 2h ,得粉末狀精制黃酮粉,并可計算其得率。1. 4 蕨菜黃酮提取物及蘆丁的吸收光譜測定取適量體積粗黃酮液用 70 %乙醇稀釋,再取適量精制黃酮粉及蘆丁分別用 70 %乙醇溶解,將上述三種黃酮液分別在可見光范圍及紫外光范圍,以 70 %乙醇為對照進行掃描,得到吸收光譜。1. 5 蕨菜黃酮提取物的顏色反應分別取0. 1g精制蕨菜黃酮粉、 0. 01g 蘆丁用 70 %乙醇定容至100ml ,連同粗黃酮液共三個樣,參照文獻中方法8 ,9 ,10 ,

6、11進行下面的定性顏色反應。1. 5. 1 濃硫酸試驗:分別取粗黃酮液、 精制黃酮液、 蘆丁液約1ml 于試管中,加入濃硫酸數(shù)滴,混勻后,噴在濾紙上,吹干,觀察現(xiàn)象。1. 5. 2 HCl2鎂粉反應:分別取粗黃酮液、 精制黃酮液、 蘆丁液約1ml 于試管中,加入少量鎂粉,再加幾滴濃 HCl ,沸水浴加熱,觀察現(xiàn)象。1. 5. 3 AlCl3 反應:分別取少量粗黃酮液、 精制黃酮液、 蘆丁液涂于濾紙上,吹干后噴 1 %的 AlCl3 乙醇液,再吹干,觀察現(xiàn)象。1. 5. 4 FeCl3 反應:分別取粗黃酮液、 精制黃酮液、 蘆丁液約1ml 于試管中,加入數(shù)滴 1 %的 FeCl3 水溶液,搖勻,

7、觀察現(xiàn)象。1. 5. 5 氨水反應:分別取少量粗黃酮液、 精制黃酮液、 蘆丁液涂于濾紙上,吹干,再將濾紙放在氨水上方熏 0. 5min左右,觀察現(xiàn)象。1. 5. 6 NaOH試驗:分別取粗黃酮液、 精制黃酮液、 蘆丁液約1ml于試管中加入幾滴1 %NaOH溶液,搖勻,觀察現(xiàn)象。1. 6 黃酮含量測定采用分光光度法測定黃酮含量,即利用黃酮類化合物與鋁鹽生成紅色絡合物,以蘆丁為標準品,在510nm處測定吸光度。標準曲制作:準確稱取已于 105 條件下烘至恒重的蘆丁標準品 10. 0mg ,用 70 %乙醇定容至 100ml。精確吸取蘆丁標準液0. 0、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0

8、、 5. 0ml 分別置于6支試管中,并將各管加水補足至5. 0ml ,加入5 %NaNO2 溶液0. 3ml ,搖勻,放置 6min 后,加 10 %Al (NO3 ) 3 溶液 0.3ml 搖勻,放置6min ,再加4 %NaOH溶液4ml ,加水0. 4ml ,搖勻,放置15min后于510nm 處測吸光度(以不加蘆丁的空白管為對照調(diào)零) 。所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理可得到標準曲線的回歸方程。取一定體積樣品液按標準曲線相同方法操作測得吸光度后,由回歸方程計算出黃酮含量。同時對蘆丁及蕨菜黃酮與鋁鹽生成的紅色絡合物在紫外及可見光區(qū)進行掃描得出黃酮2鋁鹽絡合物的吸收光譜。1. 7 蕨菜黃酮的聚酰胺薄膜

9、層析定性分析用70 %乙醇配制0. 1 %的精制黃酮液,用70 %乙醇分別配制 0. 01 %的蘆丁及槲皮素液,連同粗黃酮液共四種溶液分別點樣在聚酰胺薄膜上,以甲醇 冰乙酸 水 =90 5 5為展開劑進行上行層析,以1 %AlCl3 乙醇液為顯色劑,顯色后分別在可見光及紫外光下觀察層析結(jié)果。2 結(jié)果與討論2. 1 蕨菜黃酮提取物與蘆丁的吸收光譜蕨菜粗黃酮、 蕨菜精制黃酮及蘆丁的 70 %乙醇液的紫外光范圍與可見光范圍的吸收光譜見圖1、 圖2。由圖1知,三種溶液在 206nm 附近皆有最大吸收峰。而蕨菜精制黃酮與蘆丁在260nm附近又有第二個吸收峰。但蘆丁在360nm處的吸收峰,另外二者沒有。由

10、圖 2 看出,蕨菜粗黃酮及精制黃酮皆在 660nm 附近有一明顯吸收峰,而蘆丁液無?？梢姽庾V上存在的差異,導致溶液的顏色也有所差異,蕨菜黃酮提取物的 70 %乙醇液呈黃色,而蘆丁的70 %乙醇液則呈黃綠色。因為蕨菜黃酮提取物是一混合物,即使通過聚酰胺純化仍為混合物,所以表現(xiàn)出與蘆丁吸收光譜有較大差異。2. 2 蕨菜黃酮提取物的顏色反應試劑可見光紫外光粗黃酮精制黃酮蘆丁粗黃酮精制黃酮蘆丁濃硫酸灰黃黃色黃色黃綠色熒光黃綠色熒光黃綠色熒光三氯化鋁淡黃淡黃黃色黃綠色熒光黃綠色熒光黃綠色熒光氨水淡黃淡黃淡黃亮黃色熒光亮黃色熒光灰黃色熒光三氯化鐵深綠深綠深綠鹽酸·鎂粉紅色紅色紅色氫氧化鈉黃色黃色

11、黃色 蕨菜黃酮提取物與蘆丁的定性顏色反應結(jié)果見表 1 ,可以初步得出蕨菜黃酮類物質(zhì)主要是黃酮類及黃酮醇類,其母核結(jié)構(gòu)見圖示。2. 3 蕨菜總黃酮含量的分析測定2. 3. 1 蘆丁、 蕨菜黃酮與鋁鹽生成紅色絡合物的吸收光譜分別掃描蘆丁、 蕨菜黃酮與 Al (NO3 ) 3 反應生成的紅色絡合物,得可見光吸收光譜,見圖 3。將蘆丁、 蕨菜黃酮與Al (NO3) 3 反應生成的紅色絡合物用水適當稀釋,在紫外光區(qū)掃描,得到紫外光吸收光譜,見圖 4。由圖 3 可知,蘆丁、 蕨菜粗黃酮、 蕨菜精制黃酮與Al (NO3) 3 形成的紅色絡合物在可見光區(qū)的最大吸收波長皆為 510nm ,且光譜曲線特征相似,這

12、與文獻12 報道的大血藤黃酮與 Al (NO3 ) 3 反應的結(jié)果是一致的。因此,可以以蘆丁為標準,采用與 Al(NO3) 3 反應生成的紅色絡合物在510nm處比色測定蕨菜黃酮含量。圖4 證明蘆丁、 蕨菜黃酮與 Al (NO3 ) 3 生成的紅色絡合物的紫外光吸收光譜也非常的相似,且在253nm處有一顯著吸收峰,提示有可能采用紫外分光光度法在 253nm 處定量測定蕨菜黃酮含量,這需要進一步探討。2. 3. 2 測定黃酮含量的標準曲線:按標準曲線制作方法操作,在 510nm 測定吸光度,得到標準曲線的回歸方程為:C = 0. 8487A + 0. 0097 , C 為蘆丁濃度 mg/ ml

13、,A 為510nm吸光度,相關(guān)系數(shù) r = 0. 9998。2. 3. 3 蕨菜干粉的總黃酮含量:取一定體積的蕨菜總黃酮提取液(粗黃酮液)測定其中黃酮含量,進而計算出蕨菜干粉的總黃酮含量為 7. 28 %。蕨菜總黃酮含量比柚皮粉2 ,銀杏干葉3 ,4 ,黑刺菝葜干粉7 ,穗醋栗葉片干粉11 中黃酮含量高的多,至少都高出 2 倍以上。蔡建秀等13 對22 種藥用蕨菜植物研究結(jié)果顯示,有 8 種蕨類植物的地上或地下部分黃酮含量超過了 3 % ,但除烏蕨地上部分黃酮含量特別高,達干重的 34. 24 %外,其余蕨類黃酮含量尚未有達 7 %的,而蕨菜中黃酮含量高達 7. 28 % ,說明蕨菜是極好的富

14、含黃酮類化合物的植物資源。2. 4 粗黃酮粉、 精制黃酮粉得率及其黃酮含量由蕨菜干粉得到粗黃酮粉的得率為 25. 92 % ,經(jīng)測定粗黃酮粉中的黃酮含量為 27. 03 %;由粗黃酮粉經(jīng)聚酰胺初步純化后的精制黃酮粉相對于蕨菜干粉的得率為5. 10 % ,相對于粗黃酮粉的得率為 19. 67 % ,精制黃酮粉中的黃酮含量為41. 52 %。從上述結(jié)果看出,蕨菜中黃酮類物質(zhì)含量很高,提取的粗黃酮粉得率已達蕨菜干重的四分之一以上,雖未經(jīng)純化但其黃酮含量已達 27 %以上。經(jīng)過初步純化的精制黃酮粉得率也達蕨菜干重的 5 %以上。這些都說明,蕨菜是獲取黃酮類物質(zhì)的很好來源,利用豐富的野生蕨菜資源來提取制

15、備黃酮類化合物有著很大的潛力和價值。這也同時為長期食用蕨菜會有一定的保健功能提供了依據(jù)。2. 5 聚酰胺初步純化的效果經(jīng)聚酰胺純化后,黃酮粉中的黃酮含量由純化前的27. 03 %提高到了純化后的 41. 25 % ,這說明純化有一定效果,但比文獻5 中報告的蒲公英黃酮類化合物的純化后黃酮含量達 67. 4 %要低的多,這說明聚酰胺對不同的黃酮提取物的純化效果有差異,甚至差異很大。結(jié)合黃酮粉得率及黃酮含量計算純化后的黃酮回收率為 30. 22 %。黃酮回收率( %) = (精制黃酮粉得率× 精制黃酮粉中黃酮含量) / (粗黃酮粉得率 ×粗黃酮粉中黃酮含量) ,約 70 %的黃

16、酮類物質(zhì)在純化過程中損失掉了。從圖1 中曲線1、 2 看出,聚酰胺純化前后的吸收光譜的曲線特征雖然發(fā)生了一定的變化,但結(jié)合后面的層析結(jié)相同,這說明通過聚酰胺純化并未改變黃酮粉中的混合物質(zhì)的組成成分。綜合分析,聚酰胺純化有一定效果,但如何進一步提高蕨菜黃酮粉中的黃酮含量,提高純化過程中的黃酮回收率,尚需進一步研究。2. 6 蕨菜黃酮的聚酰胺薄膜層析結(jié)果斑點Rf值斑點Rf值可見光紫外光（365nm）B10. 875C10. 875無色亮藍色熒光B20. 734C20. 719無色亮藍色熒光B30. 672C30. 656無色亮藍色熒光B40. 609C40. 609無色亮藍色熒光B50. 516C

17、50. 516黃色黃綠色熒光B60. 438C60. 438無色黃綠色熒光B70. 344C70. 344無色黃綠色熒光B80. 250C80. 250無色黃綠色熒光B90. 155C90. 141無色黃綠色熒光A槲皮素0. 141亮黃色黃綠色熒光D蘆丁0. 523黃色黃綠色熒光 表2、 圖5 為蕨菜黃酮的聚酰胺薄膜層析結(jié)果。根據(jù)Rf 值及斑點顏色初步可以判斷蕨菜黃酮中有多種黃酮物質(zhì)組成,其中粗黃酮、 精制黃酮的 B5、 C5 斑點的 Rf 值為0. 516 與蘆丁的 Rf 值0. 523 非常接近,而且三者在用 Al2Cl3 顯色后無論在可見光還是紫外光下的斑點顏色都完全相同,說明蕨菜黃酮中

18、含有蘆丁(即蕓香苷,32 2蕓苷糖苷基槲皮素) 。B9斑點的的 Rf 值為 0. 155 與槲皮素的 Rf 值相近,C9 斑點的Rf 值為0. 141 與槲皮素Rf 值相同,且三者在紫外光下皆呈黃綠色熒光,但是在可見光下槲皮素呈明顯的亮黃色,而B9、 C9 斑點看不到亮黃色,這可能是在B9、 C9斑點處所含黃酮的量太少造成的,因此,蕨菜黃酮中可能還含有槲皮素(即 5 ,7 ,3 ,4 2四羥基黃酮醇) ,這與其它的黃酮組分一樣尚需進一步研究確定。參 考 文 獻1 戴寶合.野生植物栽培學.農(nóng)業(yè)出版社 ,1997. 136139.2 楊洋 ,韋小英.柚皮黃酮類化合物提取方法和抗氧化性的研究.食品與發(fā)酵工業(yè) ,2002 ,28 (6) :912.3 田呈瑞 ,李昀.銀杏葉黃酮的乙醇提取