LAMP,BDNA,NASBA技術(shù)原理與應(yīng)用比較

1、BJLPbDNA,NASBA,LAMP技術(shù)原理與應(yīng)用比較北京藍(lán)譜生物科技北京藍(lán)譜生物科技日本榮研指定中國日本榮研指定中國LAMP技術(shù)推廣者技術(shù)推廣者北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司核酸檢測技術(shù)變溫檢測技術(shù) PCR (polymerase chain reaction) LCR(ligase amplification reaction)Real-time PCR等溫檢測技術(shù)LAMP等北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司核酸等溫檢測技術(shù)信號的放大bDNA (branched DNA)模板的擴(kuò)增TAS(Transcription-Based Amplification Systems)

2、 (self-sustained sequence replication)(nucleic acid sequence-based amplification)(strand displacement amplification)(loop-mediated isothermal amplification)BJLP一、bDNA技術(shù)原理與應(yīng)用北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司bDNA的合成北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司bDNA檢測應(yīng)用Detection of Trypanosoma brucei spp. in Human Blood

3、by aNonradioactive Branched DNA-Based Technique北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司bDNA檢測技術(shù)特征條探針，其中只有兩條目標(biāo)探針要設(shè)計(jì)，其它探針都可以模塊化。目標(biāo)檢測片段不會進(jìn)行數(shù)量擴(kuò)增。樣本處理十分簡單，不需要純化。防止了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問題。防止了抑制因素可能帶來的假陰性問題。試劑無需冷藏保存。采用儀器或照相機(jī)檢測化學(xué)發(fā)光?？筛咄窟M(jìn)行檢測不同病原體。BJLP二、NASBA技術(shù)原理與應(yīng)用北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司NASBA檢測應(yīng)用北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司NASBA檢測技

4、術(shù)特征使用反轉(zhuǎn)錄酶,RNA酶H,T7RNA聚合酶進(jìn)行循環(huán)反響.上游引物帶有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，下游引物帶有檢測核苷酸序列，此外，還有一條俘獲探針用于固定擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物是單鏈，后續(xù)操作較復(fù)雜連續(xù)等溫反響,特殊儀器進(jìn)行檢測, 特異性強(qiáng)，靈敏度高，但本錢也非常高昂可與分子信標(biāo)探針聯(lián)合使用，進(jìn)行單管實(shí)時熒光檢測BJLPLAMP技術(shù)原理與應(yīng)用北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司53B3B2B1F1CF2CF3CLAMPLAMP引物位置與命名引物位置與命名FIP=F1C+TTTT+F2BIP=B1C+TTTT+B2B3F3(Loop F, Loop B)引物引物m m值的選擇值的選擇F3,B3F2

5、,B2F1,B160F2,B265北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司LAMP引物設(shè)計(jì)原那么引物間的距離 F2與B2之間的堿基數(shù)約為120-180個,F2與F3或者B2與B3間的堿基數(shù)為20個以內(nèi),F2與F1或者B2與B1之間堿基數(shù)為4060個，B1與F1之間可以沒有堿基間隔。引物的Tm值正常情況下或者富含GC區(qū)域?yàn)?0-65度，富含AT區(qū)域?yàn)?5-60度。引物末端的穩(wěn)定性F1C與B1C的5端

6、，F(xiàn)2/B2，F(xiàn)3/B3的3端6個堿基的dG值要小于-4kal/mol.GC含量與二級結(jié)構(gòu)GC含量約40-60%。盡量防止二級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，尤其是3端。其它事項(xiàng)在目標(biāo)區(qū)域引物以外的序列中存在的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，可以用來確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物。北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司常用反響體系FIP,BIP: 40pmolF3,B3: 5pmolloopF,B: 20pmoldNTPBetaineTween20: 0.1%(NH4)2SO4: 10mMMgSO4: 8mMKcL: 10mMTris-Hcl(pH8.8): 20mMBst : 8U北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司Loop引物的引入有

7、助于提高靈敏度，縮短反響時間北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析Ladder-like pattern in gel-electrophoresis注：電泳分析為說明手段，并不建議在研究中使用北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司LAMP結(jié)果分析濁度n有無擴(kuò)增反響可在有無擴(kuò)增反響可在UV燈下觀燈下觀測顏色的變化測顏色的變化模板模板: PSA熒光劑熒光劑: Ethidium Bromide (0.5 ug/ml) n有無擴(kuò)增反響可借助肉眼判斷擴(kuò)有無擴(kuò)增反響可借助肉眼判斷擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂存在與否來斷增副產(chǎn)物焦磷酸鎂存在與否來斷定定模板模板:PSA不需要特殊的試劑或儀

8、器不需要特殊的試劑或儀器北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司LAMP結(jié)果分析熒光在反響液里的鈣黃綠素在反響液里的鈣黃綠素 (一種螯合試劑一種螯合試劑)與鎂離子結(jié)合并處于熄滅狀態(tài)。與鎂離子結(jié)合并處于熄滅狀態(tài)。由于由于LAMP擴(kuò)增反響會生成焦磷酸離子、而這些焦磷酸會與鎂離子結(jié)合并釋放了鈣黃綠擴(kuò)增反響會生成焦磷酸離子、而這些焦磷酸會與鎂離子結(jié)合并釋放了鈣黃綠素、這也導(dǎo)致了自由的鈣黃綠素分子的熄滅效應(yīng)終止并發(fā)出熒光。素、這也導(dǎo)致了自由的鈣黃綠素分子的熄滅效應(yīng)終止并發(fā)出熒光。dNTPs Pyrophosphate Mn( (white precipitate) )擴(kuò)增反響擴(kuò)增反響DNA聚合酶聚合酶結(jié)

9、合結(jié)合Mg2+鈣黃綠素鈣黃綠素Pyrophosphate Mg( (white precipitate) )+熒光目視檢測的反響過程熒光目視檢測的反響過程結(jié)合結(jié)合Template(SARS-CoV)鈣黃綠素鈣黃綠素北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司LAMP結(jié)果分析儀器特點(diǎn)：方法研究/檢測專用，每隔6秒測定反響產(chǎn)物的濁度2.可以設(shè)定相應(yīng)的反響條件與檢測要求3.測定結(jié)果可直接輸入電腦進(jìn)行實(shí)時分析 4.檢測結(jié)果圖像等可以打印5.實(shí)時濁度儀LA-320C可同時檢測32個樣本，LAMP聯(lián)管適用LAMP實(shí)時濁度儀 LA-320C北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司LAMP檢測法特征簡易操作過程（

10、以甲型流感為例、利用榮研試劑盒）簡易操作過程（以甲型流感為例、利用榮研試劑盒）提取咽拭子放在抽取液中加入樣本用干粉試管加入反應(yīng)引物顛倒混合5次干粉狀試劑（可常溫保存）新型A型結(jié)果判斷目測或濁度儀RT-LAMP 反應(yīng) 35分鐘提取樣本檢測完成1小時之內(nèi)小時之內(nèi)LAMP=快速、簡便、高特異、低成本北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司LAMP檢測法特征檢測是連續(xù)等溫進(jìn)行的。擴(kuò)增效率十分高，反響靈敏。采用4條引物，識別6個位點(diǎn)，特異性強(qiáng)。不需要特殊的試劑與儀器，總費(fèi)用很低。反響不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部檢測。利用Bst酶的鏈置換功能進(jìn)行反響。參加反轉(zhuǎn)錄酶，可以完成的一步法檢測。北京藍(lán)譜生物有限公

11、司北京藍(lán)譜生物有限公司LAMP方法與其他基因擴(kuò)增法的比較Temperature65609540606095IsothermalThermal cyclerIsothermalIsothermalThermal cyclerNumber of primers42244Number of enzymes112 or 321 or 2*Special reagentsNoneNoneNTPdNTPSNoneDetectionamplification additional step additional step additional step additional stepAmplification time1560 min.23 hrs23 hrs12 hrs23 hrsTotal costLCRLAMPPCRTMASDA從圖表中可以看出，不管是反響步驟還是反響時間，LAMP方法都優(yōu)于其他方法。北京藍(lán)譜生物有限公司北京藍(lán)譜生物有限公司LAMP檢測法總結(jié)低本低本錢錢只需要一種只需要一種鏈鏈置置換換反響聚合反響聚合酶酶。 。不需要特殊的不需要特殊的試劑試劑或或儀儀器。器。簡易簡易采用恒溫擴(kuò)增反響。不需要先經(jīng)過變性過程。采用恒溫擴(kuò)增反響。不需要先經(jīng)過變性過程?？焖倏?/p>