偽狂犬病檢測(cè)方法參考模板

1、十一、偽狂犬病檢測(cè)方法偽狂犬病病毒分離鑒定1 材料準(zhǔn)備 DMEM培養(yǎng)基、BHK-21細(xì)胞、新生犢牛血清、青霉素、鏈霉素溶液、0.22ul微孔濾膜、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。溶液配制見(jiàn)附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)2 操作步驟2.1 病料的采集 對(duì)于剛死亡或活體送檢并處死的動(dòng)物，無(wú)菌采取肝、脾、肺、腎及其腦組織，尤其是三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球， 4送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2.2 樣品處理 待檢組織在滅菌乳缽內(nèi)剪碎，加入滅菌玻璃砂研磨，用滅菌生理鹽水或DME培養(yǎng)基制成1：5乳劑，70反復(fù)凍融后，經(jīng)3000rpm離心30分鐘后，取上清液經(jīng)0.22m微孔濾膜過(guò)濾后，加入青鏈霉素溶液至最終濃度為100U/mL，70保存

2、作為接種材料。2.3 病料接種 將病料濾液接種已長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞，接種量為培養(yǎng)基量的10%，37恒溫箱中吸附1小時(shí)后，加入含10%新生犢牛血清（經(jīng)過(guò)56水浴滅活30分鐘，過(guò)濾除菌，無(wú)支原體）的DMEM培養(yǎng)基，置37溫箱中培養(yǎng)。2.4 觀察結(jié)果 接種后2448小時(shí)，BHK-21細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)（Cyto pathogenic effect, CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，脫落。如第一次接種不出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代，如仍無(wú)CPE，則判為偽狂犬病病毒陰性。2.5 病毒的鑒定 將出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融后，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光抗體試驗(yàn)等兩種方法中任一方法作進(jìn)

3、一步鑒定。偽狂犬病聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1 材料準(zhǔn)備:待檢組織、組織勻漿器、蛋白酶K，十二烷基磺酸鈉（SDS），苯酚、氯仿，異戊醇（分析純）、TEN緩沖液。溶液配制見(jiàn)附錄C(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)引物：擴(kuò)增偽狂犬病病毒基因中434651bp之間217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。序列為，上游引物P1：5-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3，下游引物P2：5-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 儀器設(shè)備有：凝膠電泳紫外線檢測(cè)儀， PCR擴(kuò)增儀，電泳儀2操作步驟：21 樣品的采集：對(duì)于病死或撲殺動(dòng)物，取腦組織；對(duì)于待檢活豬，用已滅菌的棉簽，伸入豬鼻腔中，采取鼻粘液，即為鼻拭子，冷藏條

4、件送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2.2 樣品處理 所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi)，-70反復(fù)凍融3次，7000r/min離心5min，如樣品為鼻試子，則加入2ml TEN緩沖液，充分?jǐn)D壓，取出棉簽，7000rpm，離心5分鐘，取上清液。取上清液472.5l,加入25l 10SDS和2.5l的20mg/ml 蛋白酶K，50水浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚500l，渦旋20s。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：異戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20l雙蒸水溶解，-20貯存?zhèn)溆谩?.3. PCR的操作程序

5、先將制備的模板DNA置100水浴10分鐘作變性處理，然后立即放于冰浴中。PCR反應(yīng)體系為：總體積25l，含有50m mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1Triton X-100，100mol/L dNTPs，0.35mol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1l模板DNA。常用的反應(yīng)體系組成如下 10×緩沖液 2.5 l 15mM MgCl2 2.5 l dNTPs 2.0 l 引物 各2.0l Taq聚合酶 1.0l DNA模板 2.0l 滅菌去離子水 11.0l 礦物油 約 20l 擴(kuò)増條件為:94變性3分鐘

6、，進(jìn)入循環(huán)，9460秒，6560秒，7260秒，40個(gè)循環(huán)后72延伸5分鐘。2.4 PCR產(chǎn)物的檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，在紫外光下觀察結(jié)果。為進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性鑒定，可取PCR產(chǎn)物用SalI酶切，酶切產(chǎn)物在2瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外光下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，可見(jiàn)產(chǎn)生的140bp和77bp兩個(gè)片段。偽狂犬病熒光抗體試驗(yàn)1材料準(zhǔn)備：碳酸鹽緩沖甘油、磷酸鹽緩沖液、丙酮（分析純），偽狂犬病熒光抗體、冰凍切片機(jī)，熒光顯微鏡。溶液配制見(jiàn)附錄D(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)2操作步驟21樣品采集 撲殺可疑動(dòng)物，取大腦、淋巴結(jié)、扁桃體迅速送檢實(shí)驗(yàn)室，如不能及時(shí)送出，

7、必須凍結(jié)保存，避免腐敗、自溶。本法也可用于對(duì)疑似偽狂犬病病毒的培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。22 切片制備 將樣品組織塊切成1cm×1cm的面，不經(jīng)任何固定處理，直接貼于冰凍切片托上，進(jìn)行切片，切片厚度要求57um，將切片展貼于0.8mm×1mm厚的潔凈載玻片上。23固定：將切片置純丙酮中固定15分鐘，取出立即放入0.01mol/L，pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，輕輕漂洗34次，取出，自然干燥后盡快進(jìn)行熒光抗體染色。24 染色 將偽狂犬病熒光抗體滴加于切片表面，置溫盒內(nèi)于37作用30分鐘，取出后放入磷酸鹽緩沖液中充分漂洗，再用0.5moL/L，pH9.09.5碳酸鹽緩沖甘油封固蓋片（0.1

8、mm厚），染色后應(yīng)盡快鏡檢，必要時(shí)可放置低溫待檢。25 觀察 將染色后的切片標(biāo)本置激發(fā)光為藍(lán)紫光或紫外光的熒光顯微鏡下觀察。26判定：于熒光顯微鏡視野中，見(jiàn)細(xì)胞中出現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，判為偽狂犬病病毒感染陽(yáng)性。偽狂犬病微量中和試驗(yàn)（固定病毒，稀釋血清法）1 材料準(zhǔn)備0. 25%胰酶（配制見(jiàn)附錄B）、BHK-21細(xì)胞,多道可調(diào)微量移液器, ,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,CO2培養(yǎng)箱, 倒置顯微鏡。2 操作步驟2.1 病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染量（TCID50）的測(cè)定：2.1.1 病毒培養(yǎng)和收獲 將偽狂犬病毒接種于長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞，接種量為液體培養(yǎng)基量的10%,37培養(yǎng)，待出現(xiàn)病變后，凍融，收獲病毒。2

9、.1.2 病毒的滴定 用DMEM培養(yǎng)基將偽狂犬病病毒作連續(xù)10倍稀釋?zhuān)?01、102每個(gè)稀釋度取100L加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，隨后加入經(jīng)0.25%胰酶消化的BHK-21細(xì)胞100L（細(xì)胞含量以105/mL左右 為宜），每個(gè)稀釋度作8個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照。置37 5%CO2培養(yǎng)箱中。 2.1.3 TCID50計(jì)算 逐日觀察細(xì)胞病變，并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，直到對(duì)照細(xì)胞老化脫落為止。按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50（具體的計(jì)算示例見(jiàn)附錄B）。2.2 中和試驗(yàn) 將無(wú)菌采集的待檢豬血清置56水浴滅活30分鐘。用DMEM培養(yǎng)基作倍比稀釋?zhuān)诩?xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入50L培養(yǎng)基，隨后

10、在第一孔中加入經(jīng)待檢豬血清50L混合后，用微量移液器取出50L，加到第二孔中，混勻后取出50L再加入第三孔中，依此類(lèi)推。血清稀釋度即為1：2、1：4、1：8，每份待檢血清稀釋度作24個(gè)重復(fù)。將50L含200個(gè)TCID50的病毒液加入到不同稀釋度血清孔中，37作用1小時(shí)，每孔中再加入100L經(jīng)胰酶消化分散的BHK-21細(xì)胞，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照、陽(yáng)性血清、陰性血清，待檢血清、正常細(xì)胞對(duì)照。2.3計(jì)算抗體中和效價(jià) 逐日觀察，直至細(xì)胞對(duì)照出現(xiàn)老化脫落為止，按Reed-Muench兩氏法，計(jì)算抗體中和效價(jià)。如抗體效價(jià)為1：2及1：2以上，則判為偽狂犬病抗體陽(yáng)性。偽狂犬病酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接法）1材料準(zhǔn)備：

11、抗原、酶標(biāo)抗體，底物（OPDH2O2），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；溶液配制見(jiàn)附錄F(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)2 操作步驟：2.1 包被 將PRV抗原加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100uL，37作用1h后置4冰箱過(guò)夜。2.2 洗滌 棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3次，每次3min，用吸水紙拍干2.3 封閉 各孔加入封閉液100uL 37作用1h。按2.2步驟洗滌24 加入待檢血清 待檢血清經(jīng)56oC30分鐘滅活將待檢血清用洗滌液稀釋?zhuān)靠?00uL，37作用1h。重復(fù)2.2步驟。25 加入酶標(biāo)抗體 用洗滌液將酶標(biāo)抗體按工作濃度稀釋?zhuān)靠?00uL，37作用1h。重復(fù)2.2步驟。26 加入底物（OPD-H22）：每孔100uL，室溫

12、避光顯色25分鐘。27 終止反應(yīng) 每孔加入50uL終止液終止反應(yīng)。28 測(cè)定OD值 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490nm波長(zhǎng)處讀數(shù)。29血清陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 取60份經(jīng)中和試驗(yàn)檢測(cè)為PRV抗體陰性的豬血清，按1:20稀釋后進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)定490nm波長(zhǎng)處OD值，規(guī)定以60份血清的平均OD值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為判定陰陽(yáng)性的臨界值。偽狂犬病乳膠凝集試驗(yàn)1材料準(zhǔn)備：偽狂犬病乳膠凝集抗原、偽狂犬病陽(yáng)性血清、陰性血清、稀釋液，玻片，溶液配制見(jiàn)附錄E(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)2操作步驟：21待檢血清不須經(jīng)熱滅活或其它方式的滅活處理22將待檢血清用稀釋液作倍比稀釋后，各取15L與等量乳膠凝集抗原在潔凈干燥的玻片上

13、用竹簽攪拌充分混合，在35分鐘內(nèi)觀察結(jié)果；可能出現(xiàn)以下幾種凝集結(jié)果，即： 100%凝集：混合液透亮，出現(xiàn)大的凝集塊 75%凝集：混合液幾乎透明，出現(xiàn)大的凝集塊 50%凝集：約50%乳膠凝集，凝集顆粒較細(xì) 25%凝集；混合液渾濁，有少量凝集顆粒 0%凝集：混合液渾濁，無(wú)凝集顆粒出現(xiàn) 如出現(xiàn)50%凝集程度以上的（含50%凝集程度），判為偽狂犬病抗體陽(yáng)性，否則判為抗體陰性。如為陰性，可用微量中和試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)。偽狂犬病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)1材料準(zhǔn)備 瓊脂擴(kuò)散抗原、陰性血清和陽(yáng)性血清；優(yōu)質(zhì)瓊脂粉、平皿2操作步驟21 0.8%瓊脂板的制作 將1克瓊脂粉溶于100毫升Tris鹽酸緩沖液(Tris 6.5克, Na

14、Cl 2.9克, NaN3 0.2克, 蒸餾水 1000毫升, 用HCl調(diào)pH值至7.2)中，趁熱傾倒于玻璃平皿上，厚度為23mm，待冷卻凝集后，打孔，中央一孔，周?chē)?孔，孔徑為2mm，周?chē)字g距離2mm，周?chē)着c中央孔間距為4mm6mm，用酒精燈微熱封底。22加樣 將瓊脂擴(kuò)散抗原加到中央孔中，周?chē)准咏?jīng)熱滅活的待檢血清，設(shè)陰性血清和陽(yáng)性血清對(duì)照。置溫盒37作用，2448小時(shí)后觀察結(jié)果。23結(jié)果判定 在抗原孔與待檢血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線，抗體可判為陽(yáng)性；如待檢血清抗體水平較低，可以觀察到與待檢血清相鄰的陽(yáng)性血清沉淀線末端略向抗原抗彎曲。陰性血清與抗原孔之間則沒(méi)有沉淀線。偽狂犬病區(qū)分強(qiáng)弱毒感

15、染鑒別乳膠凝集試驗(yàn)1豬偽狂犬病gG鑒別診斷乳膠凝集試驗(yàn)偽狂犬病gG鑒別診斷乳膠凝集試驗(yàn)是用偽狂犬病毒gG基因的基因工程表達(dá)產(chǎn)物致敏乳膠抗原來(lái)檢測(cè)動(dòng)物血清、全血或乳汁中抗gG蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gG基因缺失疫苗注苗豬的免疫學(xué)鑒別診斷。11材料準(zhǔn)備：偽狂犬病毒gG蛋白致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒陽(yáng)性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸頭等。12操作步驟121對(duì)照試驗(yàn) 檢測(cè)之前應(yīng)做對(duì)照試驗(yàn)，出現(xiàn)如下結(jié)果試驗(yàn)方可成立，否則應(yīng)重試，如重試仍不出現(xiàn)如下結(jié)果則停止使用：偽狂犬病毒陽(yáng)性血清加gG蛋白致敏乳膠抗原呈陽(yáng)性凝集；注射gG基因缺失疫苗血清加gG蛋白致敏乳膠抗原呈陰

16、性凝集；偽狂犬病毒陽(yáng)性血清與注射gG基因缺失疫苗血清加偽狂犬病毒致敏乳膠抗原均呈陽(yáng)性凝集。122檢測(cè)試驗(yàn)1221待檢血清不須經(jīng)熱滅活或其它方式的滅活處理1222待檢血清一滴，置于玻片上。加gG蛋白致敏乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動(dòng)1-2分鐘，于3-5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果(注：gG蛋白致敏乳膠抗原與血清反應(yīng)的凝集顆粒較細(xì))；可能出現(xiàn)以下幾種凝集結(jié)果，即： “+”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明； “+”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁； “+”約一半乳膠凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁； “+”有少許凝集，液體呈混濁； “”液滴呈原有的均勻乳狀。以出現(xiàn)“+”以上凝集者判為陽(yáng)性凝集。2

17、豬偽狂犬病gE鑒別診斷乳膠凝集試驗(yàn)偽狂犬病gE鑒別診斷乳膠凝集試驗(yàn)是用偽狂犬病毒gE基因的基因工程表達(dá)產(chǎn)物致敏乳膠抗原來(lái)檢測(cè)動(dòng)物血清、全血或乳汁中抗gE蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gE基因缺失疫苗注苗豬的免疫學(xué)鑒別診斷。11材料準(zhǔn)備：偽狂犬病毒gE蛋白致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒陽(yáng)性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸頭等。12操作步驟121對(duì)照試驗(yàn) 檢測(cè)之前應(yīng)做對(duì)照試驗(yàn)，出現(xiàn)如下結(jié)果試驗(yàn)方可成立，否則應(yīng)重試，如重試仍不出現(xiàn)如下結(jié)果則停止使用：偽狂犬病毒陽(yáng)性血清加gE蛋白致敏乳膠抗原呈陽(yáng)性凝集；注射gE基因缺失疫苗血清加gE蛋白致敏乳膠抗原呈陰性凝集；偽狂犬病毒陽(yáng)

18、性血清與注射gE基因缺失疫苗血清加偽狂犬病毒致敏乳膠抗原均呈陽(yáng)性凝集。122檢測(cè)試驗(yàn)1221待檢血清不須經(jīng)熱滅活或其它方式的滅活處理1222待檢血清一滴，置于玻片上。加gE蛋白致敏乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動(dòng)1-2分鐘，于3-5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果(注：gE蛋白致敏乳膠抗原與血清反應(yīng)的凝集顆粒較細(xì))；可能出現(xiàn)以下幾種凝集結(jié)果，即： “+”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明； “+”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁； “+”約一半乳膠凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁； “+”有少許凝集，液體呈混濁； “”液滴呈原有的均勻乳狀。以出現(xiàn)“+”以上凝集者判為陽(yáng)性凝集。偽狂犬病區(qū)分強(qiáng)弱毒感染

19、鑒別ELISA1偽狂犬病gG-ELISA鑒別診斷（間接法）偽狂犬病gG-ELISA鑒別診斷是用偽狂犬病毒gG基因的基因工程表達(dá)產(chǎn)物包被的ELISA板用來(lái)檢測(cè)動(dòng)物血清中抗gG蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gG基因缺失疫苗注苗豬的免疫學(xué)鑒別診斷。11材料準(zhǔn)備：gG蛋白包被的ELISA板、酶標(biāo)抗體，底物（OPDH2O2），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；溶液配制見(jiàn)附錄F(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)12 操作步驟：12.1加入待檢血清 待檢血清經(jīng)56oC30分鐘滅活后用保溫液作40倍稀釋?zhuān)靠准尤耄?7作用30min。12.2 洗滌 棄去孔內(nèi)液體，每孔用200uL洗滌液洗3次，每次3min，用吸水紙拍干。12.3 加入酶標(biāo)抗體

20、 用洗滌液將酶標(biāo)抗體按工作濃度稀釋?zhuān)靠?00uL，37作用30min,重復(fù)2.2步驟。 124 加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室溫避光顯色25分鐘。125 終止反應(yīng) 每孔加入50uL終止液終止反應(yīng)。 126 測(cè)定OD值 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490nm波長(zhǎng)處讀數(shù)。測(cè)定490nm波長(zhǎng)處OD值，記為P值，陰性對(duì)照OD值記為N值，N值如小于0.1時(shí)，按0.1計(jì)算，大于0.1時(shí)為實(shí)際值。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔OD值陰性對(duì)照OD值大于0.25時(shí)，試驗(yàn)成立。127結(jié)果判定：P/N2.1判為gG抗體陽(yáng)性P/N1.9判為gG抗體陰性,1.9<P<N2.1,判為可疑2偽狂犬病gE-ELISA鑒別

21、診斷（間接法）偽狂犬病gE-ELISA鑒別診斷是用偽狂犬病毒gE基因的基因工程表達(dá)產(chǎn)物包被的ELISA板用來(lái)檢測(cè)動(dòng)物血清中抗gE蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gE基因缺失疫苗注苗豬的免疫學(xué)鑒別診斷。21材料準(zhǔn)備：gE蛋白包被的ELISA板、酶標(biāo)抗體，底物（OPDH2O2），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；溶液配制見(jiàn)附錄F(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)22 操作步驟：22.1加入待檢血清 待檢血清經(jīng)56oC30分鐘滅活后用保溫液作40倍稀釋?zhuān)靠准尤耄?7作用30min。22.2 洗滌 棄去孔內(nèi)液體，每孔用200uL洗滌液洗3次，每次3min，用吸水紙拍干。22.3 加入酶標(biāo)抗體 用洗滌液將酶標(biāo)抗體按工作濃度稀釋?zhuān)靠?0

22、0uL，37作用30min,重復(fù)2.2步驟。 224 加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室溫避光顯色25分鐘。225 終止反應(yīng) 每孔加入50uL終止液終止反應(yīng)。 226 測(cè)定OD值 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490nm波長(zhǎng)處讀數(shù)。測(cè)定490nm波長(zhǎng)處OD值，記為P值，陰性對(duì)照OD值記為N值，N值如小于0.1時(shí)，按0.1計(jì)算，大于0.1時(shí)為實(shí)際值。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔OD值陰性對(duì)照OD值大于0.25時(shí)，試驗(yàn)成立。227結(jié)果判定：P/N2.1判為gE抗體陽(yáng)性P/N1.9判為gE抗體陰性1.9<P<N2.1,判為可疑偽狂犬病病毒血凝（HA）與血凝抑制（HI）試驗(yàn)方法 （一）紅血球的制備：將小

23、白鼠尾尖剪斷，插入盛有滅菌的阿氏液的離心管的抽氣瓶中，負(fù)壓抽吸，采血完畢后，將離心管取出，用PBS洗滌3次，每次1 500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，使用時(shí)加PBS配成0.1%的紅血球懸液。 （二）待測(cè)血清的預(yù)處理：取待測(cè)血清0.1毫升加PBS 0.3毫升，56滅活30分鐘，加入0.4毫升 25%白陶土25振蕩1小時(shí)，離心取上清液加入0.1毫升配好的0.1%紅血球懸液37作用1小時(shí),離心除去紅血球,上清液作為1:8稀釋的血清用于HI試驗(yàn). （三） HA試驗(yàn)操作:選用96孔V型板每孔加入PBS 50微升,在第一排孔的前6孔內(nèi)加入50微升 PrV病毒液,后兩孔作為空白對(duì)照,用微量加樣器作倍比稀釋,從1:

24、2至1:1024,即將第一排孔病毒液混勻后吸出50微升至第二排孔均勻混合,再?gòu)牡诙趴孜?0微升至第三排孔,依次類(lèi)推至最后一排孔取50微升棄掉,每孔加入50微升 0.1%的紅血球，在振蕩器較微振蕩混合均勻，以一定的溫度作用2小時(shí)，觀察結(jié)果，以完全凝集紅血球的最大稀釋倍數(shù)作為一個(gè)血凝單位。 （四）HI試驗(yàn)操作：在96孔V型板中每孔加入50微升 PBS液，然后在第一排孔的前6孔內(nèi)加入50微升已處理的血清作為對(duì)照，用微量加樣器將血清倍比稀釋從1：2至1：1 024，然后各孔加入50微升用PBS稀釋好的4個(gè)血凝單位的病毒液，每孔分別加入50微升 0.1%紅血球懸液，混合均勻后室溫放置2小時(shí)，觀察結(jié)果

25、。(吳 斌 何啟蓋)進(jìn)口偽狂犬病抗體檢測(cè)試劑盒（用于普查）一、 試劑 貯存在2-71 PRV包被酶標(biāo)板 5塊2 抗豬辣根過(guò)氧化物酶（HRP）連結(jié)物（酶標(biāo)抗體） 60ml3 PRV陽(yáng)性對(duì)照血清 4ml4 PRV陰性對(duì)照血清 4ml5 樣品稀釋液 175ml6 洗滌液（10×） 250ml7 TMB底物 60ml8終止液 60ml二、樣品的準(zhǔn)備用樣品稀釋液按1：20稀釋待檢血清。（如20ul樣品加380ul樣品稀釋液）。注意：陰、陽(yáng)性對(duì)照不稀釋。每一樣品必須更換吸嘴，并記錄樣品在板上的位置，在樣品加到酶標(biāo)孔內(nèi)之前必須混合均勻。三、洗滌液的準(zhǔn)備濃縮洗滌液（10×）應(yīng)置室溫并搖動(dòng)使

26、沉淀的鹽能充分溶解。在用之前，濃縮洗滌液（10×）應(yīng)用蒸餾水或去離子水接1：10稀釋?zhuān)ㄈ?0ml濃縮洗滌液加 270ml蒸餾水或去離子水即可用于一塊板的洗滌）。四、試驗(yàn)過(guò)程在使用之前所有試劑必須置室溫并輕輕搖動(dòng)或渦旋。1取出酶標(biāo)板并記錄樣品在板上的位置。2在A1、A2、A3孔內(nèi)各加未稀釋的陰性對(duì)照100ul。3在A4、A5、A6孔內(nèi)各加未稀釋的陽(yáng)性對(duì)照100ul。4加100ul已稀釋的樣品（1：20）到相應(yīng)的孔內(nèi)，每一樣品應(yīng)同時(shí)做2孔。5室溫作用30分鐘。6傾去孔內(nèi)液體到廢液缸內(nèi)。7每孔用近300ul的洗滌液洗3-5次，每次洗后傾去孔內(nèi)的液體。在加酶標(biāo)抗體之前應(yīng)避免孔內(nèi)干燥，最后一次

27、洗滌后應(yīng)在吸水材料上拍干酶標(biāo)板。8 在每一孔內(nèi)加入100ul抗豬的酶標(biāo)抗體。9 室溫作用30分鐘。10重復(fù)步驟6和7。11 在每一孔內(nèi)加入TMB底物溶液100ul。12 室溫顯色15分鐘。13 每一孔內(nèi)加入100ul終止劑以終止反應(yīng)。14 空氣調(diào)零。15 在650nm測(cè)量并記錄樣品和對(duì)照的吸收值。16 計(jì)算結(jié)果。五、結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照的平均值（PCX）與陰性對(duì)照的平均值（NCX）之差（P-N）大于或等于0.15時(shí)試驗(yàn)方成立。而且陰性對(duì)照平均值（NCX）必須小于或等于0.15。如果試驗(yàn)不成立，可能操作有誤，試驗(yàn)應(yīng)在熟悉產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)后重試。每一樣品內(nèi)針對(duì)PRV抗體的有無(wú)是由樣品與陽(yáng)性對(duì)照的比率（S/P）

28、來(lái)確定。陽(yáng)性對(duì)照已標(biāo)準(zhǔn)化且有很高水平的PRV抗體。六、 結(jié)果的說(shuō)明1 S/P比值小于0.4的樣品確定為PRV抗體陰性。2 S/P比值大于或等于0.4的樣品確定為PRV抗體陽(yáng)性。在該試驗(yàn)中定為陽(yáng)性的樣品應(yīng)再用“偽狂犬病抗體確認(rèn)試劑盒”來(lái)進(jìn)一步證明其陽(yáng)性的真假。七、計(jì)算1 陰性對(duì)照平均值（NCX）的計(jì)算 A1A（650）+A2A（650）+A3A（650） 0.06+0.063+0.069NCX= 例如：=0.064 3 3 2 陽(yáng)性對(duì)照平均值（PCX）的計(jì)算 A4A（650）+A5A（650）+A6A（650） 0.313+0.299+0.33NCX= 例如：=0.314 3 3 3 S/P比值

29、的計(jì)算 例如：某樣品平均值=0.350 Sample A（650）NCX 0.350-64 0.286S/P= S/P= = =1.14 PCXNCX 0.314-0.064 0.250（華中農(nóng)大覃雅麗、唐勇譯）偽狂犬病gE抗體試劑盒（進(jìn)口）一、試劑 貯存在2-71. PRV包被酶標(biāo)板 6塊2. 抗 PRV-gE辣根過(guò)氧化物酶（HRP）連結(jié)物（酶標(biāo)抗體） 60ml3. 陰性豬血清對(duì)照-不與PRV-gE 反應(yīng)的豬血清 5ml4. 陽(yáng)性對(duì)照血清-抗PRV-gE 5ml5. 樣品稀釋液 120ml6. 洗滌液（10×） 235ml7. TMB底物 60ml8. 8終止液 60ml二、樣品的準(zhǔn)備用樣品稀釋液按1：2 的比例稀釋待檢血清。每一樣品必須更換吸嘴，樣品加到酶標(biāo)孔內(nèi)