酶工程原理及應(yīng)用-06 酶的非水相催化

1、酶工程酶工程( (原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用) )鄭穗平鄭穗平1382215334413822153344E-mail: 第六章 酶的非水相催化酶的非水相催化1、酶催化反應(yīng)的介質(zhì)2、有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系 3、酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 4、有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制 GoGoGoGo5、酶非水相催化的應(yīng)用 Go6.1 6.1 酶催化反應(yīng)的介質(zhì)酶催化反應(yīng)的介質(zhì)水是酶促反應(yīng)最常用的反應(yīng)介質(zhì)。水是酶促反應(yīng)最常用的反應(yīng)介質(zhì)。但對于大多數(shù)有機(jī)化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。因?yàn)榈珜τ诖蠖鄶?shù)有機(jī)化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。因?yàn)樵S多有機(jī)化合物許多有機(jī)化合物(底物底物)在水介質(zhì)中難溶或不溶。在水介質(zhì)中

2、難溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反應(yīng)的發(fā)生。應(yīng)的發(fā)生。是否存在非水介質(zhì)能保證酶催化？是否存在非水介質(zhì)能保證酶催化？1984年，克利巴諾夫（年，克利巴諾夫（Klibanov）等人在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行了酶催化反）等人在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行了酶催化反應(yīng)的研究，他們成功地在利用酶有機(jī)介質(zhì)中的催化作用，獲得酯類、肽應(yīng)的研究，他們成功地在利用酶有機(jī)介質(zhì)中的催化作用，獲得酯類、肽類、手性醇等多種有機(jī)化合物，明確指出酶可以在水與有機(jī)溶劑的互溶類、手性醇等多種有機(jī)化合物，明確指出酶可以在水與有機(jī)溶劑的互溶體系中進(jìn)行催化反應(yīng)體系中進(jìn)行

3、催化反應(yīng)。酶非水相催化的幾種類型有機(jī)介質(zhì)中的酶催化有機(jī)介質(zhì)中的酶催化 有機(jī)介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機(jī)溶劑中進(jìn)行的催化反應(yīng)。適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。酶在有機(jī)介質(zhì)中由于能夠基本保持其完整的結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，所以能夠發(fā)揮其催化功能。氣相介質(zhì)中的酶催化氣相介質(zhì)中的酶催化 酶在氣相介質(zhì)中進(jìn)行的催化反應(yīng)。適用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。 由于氣體介質(zhì)的密度低，擴(kuò)散容易，因此酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點(diǎn)。超臨界介質(zhì)中的酶催化超臨界介質(zhì)中的酶催化 酶在超臨界流體中進(jìn)行的催化反應(yīng)。超臨界流體是指溫度和壓力超

4、過某物質(zhì)超臨界點(diǎn)的流體。 離子液介質(zhì)中的酶催化離子液介質(zhì)中的酶催化 酶在離子液中進(jìn)行的催化作用。離子液（離子液（ionic liquidsionic liquids）是由有機(jī)）是由有機(jī)陽離子與有機(jī)（無機(jī)）陰離子構(gòu)成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點(diǎn)鹽類陽離子與有機(jī)（無機(jī)）陰離子構(gòu)成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點(diǎn)鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點(diǎn)。 本章目錄6.2 6.2 有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系 o非極性有機(jī)溶劑非極性有機(jī)溶劑酶懸浮體系酶懸浮體系( (微水介質(zhì)體系微水介質(zhì)體系) )用非極性有機(jī)溶劑取代所有的大量水，使固體

5、酶懸浮在有機(jī)相中。但仍然含有必需的結(jié)合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。酶的狀態(tài)可以是結(jié)晶態(tài)、凍干狀態(tài)、沉淀狀態(tài)，或者吸附在固體載體表面上。o與水互溶的有機(jī)溶劑與水互溶的有機(jī)溶劑水單相體系水單相體系有機(jī)溶劑與水形成均勻的單相溶液體系。酶、底物和產(chǎn)物都能溶解在這種體系中。 o非極性有機(jī)溶劑非極性有機(jī)溶劑水兩相水兩相/ /多相體系多相體系由含有溶解酶的水相和一個(gè)非極性的有機(jī)溶劑(高脂溶性)相所組成的兩相體系。不管采用何種有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系，酶催化反應(yīng)的介質(zhì)中都含有機(jī)溶劑不管采用何種有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系，酶催化反應(yīng)的介質(zhì)中都含有機(jī)溶劑和一定量的水。它們都對催化反應(yīng)有顯著的影響。和一定量的水。它們

6、都對催化反應(yīng)有顯著的影響。 反應(yīng)體系對酶酯化反應(yīng)的影響反應(yīng)體系含1-三甲基硅-1-乙醇10 mM，戊酸10 mM，內(nèi)標(biāo)正十五烷，脂肪酶50 mg，30，120 rpm條件下振蕩反應(yīng)1：水飽和正已烷10 ml，2pH7.2緩沖液5 ml+正已烷10 ml反應(yīng)體系中水對酶催化反應(yīng)的影響o酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進(jìn)行催化反應(yīng)。所以酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，水是不可缺少水是不可缺少的成分的成分之一。有機(jī)介質(zhì)中的水含量多少對酶的空間構(gòu)象空間構(gòu)象、酶的催催化活性化活性、酶的穩(wěn)定性穩(wěn)定性、酶的催化反應(yīng)速度催化反應(yīng)速度等都有密切關(guān)系，水還與酶催化作用的底物和反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度底物

7、和反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度有關(guān)。 o酶分子只有在空間構(gòu)象完整的狀態(tài)下，才具有催化功能。在無水的條件下，酶的空間構(gòu)象被破壞，酶將變性失活。故此，酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構(gòu)象。維持酶分子完整的維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量稱為必需水（空間構(gòu)象所必需的最低水量稱為必需水（essential wateressential water）。o有機(jī)介質(zhì)中水的含量對酶催化反應(yīng)速度有顯著影響。存在最適水最適水含量含量。反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑對酶催化反應(yīng)的影響o常用的有機(jī)溶劑有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。 o在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以較好地保持其完

8、整的空間結(jié)構(gòu)。在有機(jī)溶劑中，酶分子不能直接溶解，而是懸浮在溶劑中進(jìn)行催化反應(yīng)。根據(jù)酶分子的特性和有機(jī)溶劑的特性根據(jù)酶分子的特性和有機(jī)溶劑的特性的不同，保持其空間結(jié)構(gòu)完整性的情況也有所差別的不同，保持其空間結(jié)構(gòu)完整性的情況也有所差別。 o極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，如甲醇，乙醇等，會奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而降低酶的催化活性,甚至引起酶的變性失活。因此應(yīng)選擇好所使用的溶劑，控制好介質(zhì)中的含水量，或者經(jīng)過酶分子修飾提高酶分子的親水性，避免酶在有機(jī)介避免酶在有機(jī)介質(zhì)中因脫水作用而影響其催化活性質(zhì)中因脫水作用而影響其催化活性。 o有機(jī)溶劑與水之間的極性不同，在反應(yīng)過程中會影響底物和產(chǎn)物

9、底物和產(chǎn)物的分配的分配，從而影響酶的催化反應(yīng)。本章目錄6.3 酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 酶在有機(jī)介質(zhì)中起催化作用時(shí)，由于有機(jī)溶劑的極性與水有很大差別，對酶的表面結(jié)構(gòu)、活性中心的結(jié)合部位和底物性質(zhì)都會產(chǎn)生一定的影響，從而顯示出與水相介質(zhì)中不同的催化特性o 底物特異性底物特異性o 立體選擇性立體選擇性o 區(qū)域選擇性區(qū)域選擇性o 鍵選擇性鍵選擇性o 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性酶在有機(jī)介質(zhì)中由于水分子的減少，相對來說酶分子的構(gòu)象表現(xiàn)出比水溶液中更具有“剛性剛性”特點(diǎn)。因而使通過選擇不同性質(zhì)的溶劑來調(diào)因而使通過選擇不同性質(zhì)的溶劑來調(diào)控酶的某些特性成為可能。控酶的某些特性成為可能。例如在有機(jī)

10、溶劑中，可以利用酶與配體的相互作用性質(zhì)，誘導(dǎo)改變酶分子的構(gòu)象，調(diào)控酶的底物專一性,、立體選擇性和手性選擇性等。由于引起酶變性的許多因素都與水的存在有關(guān)由于引起酶變性的許多因素都與水的存在有關(guān), , 因此在有機(jī)介質(zhì)中因此在有機(jī)介質(zhì)中酶的穩(wěn)定性得到顯著提高。酶的穩(wěn)定性得到顯著提高。由于有機(jī)溶劑的存在由于有機(jī)溶劑的存在, , 水量減少，大大降低了許多需要水參與的副水量減少，大大降低了許多需要水參與的副反應(yīng)反應(yīng)，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和?；D(zhuǎn)移等。在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行的酶促反應(yīng)，可以省略產(chǎn)物的萃取分離過程在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行的酶促反應(yīng)，可以省略產(chǎn)物的萃取分離過程, 提高收率。提高收率。有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)的

11、優(yōu)點(diǎn)有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)某些酶在有機(jī)介質(zhì)與水溶液中的熱穩(wěn)定性某些酶在有機(jī)介質(zhì)與水溶液中的熱穩(wěn)定性 酶 介質(zhì)條件 熱穩(wěn)定性豬胰脂肪酶三丁酸甘油酯水， pH7.0T1/2 26 hT1/2 2 min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2 =1.5 hT1/2 2 min脂蛋白脂肪酶甲苯，90，400 h活力剩余40胰凝乳蛋白酶正辛烷，100水，pH 8.0, 55T1/2 = 80 minT1/2 = 15 min枯草桿菌蛋白酶正辛烷，110T1/2 = 80 min核糖核酸酶壬烷，110，6 h水，pH 8.0, 90活力剩余95T1/2 24 hT1/2 10 min限制性核

12、酸內(nèi)切酶 （Hind ）正庚烷，55，30d活力不降低-葡萄糖苷酶2-丙醇，50，30 h活力剩余80溶菌酶環(huán)己烷，110水T1/2 =140 minT1/2 = 10 min本章目錄6.4 6.4 有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制 o酶在有機(jī)介質(zhì)中可以催化多種反應(yīng)，主要包括：合成反應(yīng)、轉(zhuǎn)移反應(yīng)、醇解反應(yīng)、氨解反應(yīng)、異構(gòu)反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、裂合反應(yīng)等。o主要應(yīng)控制的條件有n酶的種類和濃度n底物的種類和濃度n有機(jī)溶劑的種類n水含量n溫度npHn離子強(qiáng)度本章目錄6.5 6.5 酶非水相催化的應(yīng)用酶非水相催化的應(yīng)用 酶 催化反應(yīng) 應(yīng)用 脂肪酶脂肪酶 肽合成 青霉素

13、G前體肽合成 酯合成 醇與有機(jī)酸合成酯類 轉(zhuǎn)酯 各種酯類生產(chǎn) 聚合 二酯的選擇性聚合 ?；?甘醇的酰基化蛋白酶 肽合成 合成多肽 ?；?糖類酰基化羥基化酶 氧化 甾體轉(zhuǎn)化過氧化物酶 聚合 酚類、胺類化合物的聚合多酚氧化酶多酚氧化酶 氧化 芳香化合物的羥基化 膽固醇氧化酶 氧化 膽固醇測定醇脫氫酶 酯化 有機(jī)硅醇的酯化手性藥物兩種對映體的藥理作用手性藥物兩種對映體的藥理作用 藥物名稱有效對映體的作用另一種對映體的作用普萘洛爾（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Penicillamine）羥基苯哌嗪(Dropropizine)反應(yīng)停（Thalidomide）酮基布洛芬

14、（Ketoprofen）喘速寧（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛爾（Kebivolol）S構(gòu)型，治療心臟病,-受體阻斷劑S構(gòu)型，消炎、解熱、鎮(zhèn)痛S構(gòu)型，抗關(guān)節(jié)炎S構(gòu)型，鎮(zhèn)咳S構(gòu)型，鎮(zhèn)靜劑S構(gòu)型，消炎S構(gòu)型，擴(kuò)張支氣管S,S構(gòu)型，抗結(jié)核病右旋體，治療高血壓,-受體阻斷劑R構(gòu)型，鈉通道阻滯劑R構(gòu)型，療效很弱R構(gòu)型，突變劑R構(gòu)型，有神經(jīng)毒性R構(gòu)型，致畸胎R構(gòu)型，防治牙周病R構(gòu)型，抑制血小板凝集R,R構(gòu)型，致失明左旋體，舒張血管1992年，美國FDA明確要求對于具有手性特性的化學(xué)藥物，都必需說明其兩個(gè)對映兩個(gè)對映體在體內(nèi)的不同生理活性、藥理作用以及藥物代謝動力學(xué)情況體在體內(nèi)

15、的不同生理活性、藥理作用以及藥物代謝動力學(xué)情況。許多國家和地區(qū)也都制定了有關(guān)手性藥物的政策和法規(guī)。這大大推動了手性藥物拆分的研究和生產(chǎn)應(yīng)用。目前提出注冊申請和正在開發(fā)的手性藥物中，單一對映體藥物占絕大多數(shù)。 脂肪酶脂肪酶- -位置選擇性酯化反應(yīng)位置選擇性酯化反應(yīng)OCH2OHOHOHOHOH+RCH2COOH吡啶DMFOCH2OHOHOHOHRCH2COO葡萄糖苷-6-O-?；苌锸且环N可生物降解的非離子表面活性劑，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下進(jìn)行選擇性酯化得到：糖酯的合成糖酯的合成脂肪酶脂肪酶- -消旋化合物選擇性酯化消旋化合物選擇性酯化+ R2OHRR1COOOHRorSR1CO

16、OOHR 有機(jī)溶劑 脂肪酶 R1COOR2+HOOHR潛手性丙二醇以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸為原料，在有機(jī)溶劑介質(zhì)中用脂肪酶(CCL)或豬肝酯酶（PLE）催化酯化反應(yīng)，可得到較高光學(xué)純度的R-或S-酯。脂肪酶脂肪酶- -消旋化合物的拆分消旋化合物的拆分乙酸異丙酯乙酸乙烯醇酯 PSL 消旋化合物 RRSS+RCOOCH3OAcRCOOCH3OHRCOOCH3OHRCOOCH3OAcRCOOCH3OH有機(jī)溶劑有機(jī)介質(zhì)中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于-羥基-,-不飽和酯的拆分?？梢员苊飧狈磻?yīng)的發(fā)生。脂肪酶脂肪酶- -內(nèi)酯合成反應(yīng)內(nèi)酯合成反應(yīng)-羥基酸或它的酯在脂肪酶催化下，發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化作用得

17、到內(nèi)酯化合物。內(nèi)酯可繼續(xù)反應(yīng)形成開鏈寡聚物.內(nèi)酯化產(chǎn)物形式主要取決于羥基酸的長度外，也取決于脂肪酶的類型、溶劑及溫度等。R = H 或烷基寡聚物二聚物 內(nèi)酯有機(jī)溶劑脂肪酶 有機(jī)溶劑 有機(jī)溶劑 脂肪酶 脂肪酶mHO(CH2)nOCOROOC(CH2)nO(CH2)nCO(CH2)nOCO(CH2)nOCOH(CH2)nOROC生物柴油生物柴油生物柴油是利用生物油脂生產(chǎn)的有機(jī)燃料，是由動物、植物或微生生物柴油是利用生物油脂生產(chǎn)的有機(jī)燃料，是由動物、植物或微生物油脂與小分子醇類經(jīng)過酯交換反應(yīng)而得到的脂肪酸酯類物質(zhì)?？晌镉椭c小分子醇類經(jīng)過酯交換反應(yīng)而得到的脂肪酸酯類物質(zhì)?？梢源娌裼妥鳛椴裼桶l(fā)動機(jī)的

18、燃料使用。以代替柴油作為柴油發(fā)動機(jī)的燃料使用。 生物油脂的來源：菜子油，豆油，椰子油，棕櫚油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽 油，廢食用油等優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1） 具有良好的環(huán)境屬性（2） 具有較好的低溫發(fā)動機(jī)啟動性能。（3） 具有較好的潤滑性能。（4） 具有較好的安全性能。（5） 具有良好的燃料性能。（6） 具有可再生性能。從生物質(zhì)到生物柴油生物柴油生產(chǎn)裝備美國生物柴油發(fā)展趨勢美國生物柴油發(fā)展趨勢特性生物柴油常規(guī)柴油冷濾點(diǎn)（CFPP）夏季產(chǎn)品 ()-100 冬季產(chǎn)品 ()-20-2020的密度 (g/mL)0.880.8340動力粘度 (mm2/s)4624閃點(diǎn) ()10060可燃性（十六烷值）5649

19、熱值 (ml/l)3235燃 燒 功 效 （ 柴 油=100%），(%)104100硫含量（w, %0.0010.2氧含量（v, %）100燃燒1 kg燃料按化學(xué)計(jì)算 法 的 最 小 空 氣 耗量(kg)12.514.5水危害等級12三星期后的生物分解率（%）9870國別主要生產(chǎn)公司生產(chǎn)能力(104/)總生產(chǎn)能力(104/)稅率 原料日本東京長野四家公司40廢食用油法國Compiegne4Boussens4Peronne1Verdun4Rousen12Nogent,Sur,Seine12Livomo11.7Citta DiCastello6Milano1.9Solbiate22.8Napoli11.8Bari