免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)一抗,二抗的選擇與搭配原則和方法ppt課件

1、一抗、二抗的選擇一抗的選擇 1.分析實(shí)驗(yàn)運(yùn)用類型 WBWestern Blot 免疫印跡 IHC immunohistochemistry免疫組織化學(xué) ELISAenzyme-linked immunoadsordent assay 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 2.樣本蛋白的構(gòu)造性質(zhì) 樣本蛋白的構(gòu)造域 全長蛋白、蛋白片段、多肽、 細(xì)菌、細(xì)胞 樣本的提取和處置過程 某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處置，例如：許多抗體只識(shí)別復(fù)原和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)構(gòu)造妨礙的蛋白樣本， 某些抗體僅識(shí)別天然折疊形狀的蛋白。中選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)留意某些抗體只識(shí)別未固定的冷凍的組織， 另一些抗體那么適用于無需抗原修復(fù)

2、解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域用含此片段域的免疫原制備出的抗體。用FACS流式檢測(cè)活細(xì)胞的外表蛋白用含該外表蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。 3.樣本的物種 選擇物種一樣或有交叉反響的抗體，抗體能夠與不同物種的同種靶蛋白有交叉反響，因其氨基酸序列同源性較高，假設(shè)樣本的種類未列入抗體闡明書上的交叉反響種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢檢驗(yàn)證過，應(yīng)經(jīng)過序列比對(duì)的方法來預(yù)測(cè)交叉反響，可運(yùn)用Expasy 和 NCBI BLAST來進(jìn)展不同物種蛋白同源性比對(duì)。 4.一抗宿主物種的選擇 普通說來，在運(yùn)用偶聯(lián)二

3、抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿自動(dòng)物的物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡能夠選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而防止二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反響， 例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，那么不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，那么二抗那么可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子酶、熒光素、生物素等的抗兔IgG。 假設(shè)選擇有偶聯(lián)物的一抗那么不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)方法，那么抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含IgG的細(xì)胞裂解物樣本的western blotting檢測(cè)，雖然如此，含有血清的組織裂解物和組織培育上清中含有免疫球蛋白，復(fù)原變性樣本中含IgG，在western

4、 blot檢測(cè)中那么結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。 二抗的選擇 1.一抗的種屬來源 二抗應(yīng)選用與運(yùn)用的一抗一樣的物種來源， 2.二抗的種屬來源 普通來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)絡(luò)，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在普通的實(shí)驗(yàn)里沒有太多的差別。 在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，假設(shè)其中一個(gè)一抗是山羊來源的，一個(gè)是小鼠來源的，那么相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。 3二抗的偶聯(lián)標(biāo)志 主要有酶辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP，熒光基團(tuán)FITC、Rhodamine、Texas

5、Red、PE、Rhodamine、Dylight等、生物素、金顆粒。 選用哪種探針的二抗主要取決于詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)。 對(duì)于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗； 細(xì)胞或組織標(biāo)志實(shí)驗(yàn)細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)中通常運(yùn)用熒光基團(tuán)標(biāo)志的二抗， 免疫組化中也可以運(yùn)用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)志的二抗。 假設(shè)想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以運(yùn)用Biotin/Avidin檢測(cè)系統(tǒng)。 在一些熒光檢測(cè)方案中，那么需求選擇不同的熒光標(biāo)志； 金顆粒標(biāo)志的二抗那么更多的運(yùn)用于免疫電鏡中。 4.能否經(jīng)過血清吸附過的二抗 為減少二抗與樣本的非特異性結(jié)合，可選擇經(jīng)過血清吸附過的二抗 如檢測(cè)樣

6、本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需求選擇抗小鼠源的二抗，假設(shè)對(duì)實(shí)驗(yàn)的特異性要求很高，選擇經(jīng)過人血清吸附過的抗小鼠源的二抗，這種二抗由于經(jīng)過人血清吸附而排除了與人源組織如IgG等能夠發(fā)生非特異性反響的IgG，因此將非特異性結(jié)合降低到最低。 5.二抗的類別亞型 IgM是體液免疫應(yīng)對(duì)首先產(chǎn)生的Ig。 IgA是機(jī)體黏膜防御感染的重要要素。 IgG是初級(jí)免疫應(yīng)對(duì)中最耐久、最重要的抗體，它僅以單體方式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgG IgE是同速發(fā)型過敏反響發(fā)生有關(guān)的Ig。 IgD以膜結(jié)合方式存在于B細(xì)胞，在B細(xì)胞分化發(fā)育中起重調(diào)理有作用 IgM抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷

7、中。間接法ELISA普通僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體，因標(biāo)本中普通同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必需先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處置，以除去IgG的干擾。 【Anti-IgG還是還是Anti-IgG, Fab2 fragment】在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)，通常含有較多的通常含有較多的Fc受體，這時(shí)候選擇二抗時(shí)最好選擇受體，這時(shí)候選擇二

8、抗時(shí)最好選擇Anti-IgG, Fab2 fragment這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于Fc部分與部分與IgG的非特異性結(jié)的非特異性結(jié)合。合。常規(guī)的常規(guī)的Anti-IgG H+L二抗與二抗與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反響，即與的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反響，即與IgG的的Fc的的Fab2片段都能結(jié)合；片段都能結(jié)合；由于由于IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈構(gòu)造域，因此都有保守的輕鏈構(gòu)造域，因此Anti-IgG H+L與它們與它們都有交叉反響。而都有交叉反響。而Anti-IgG, Fab2 fragment經(jīng)過了經(jīng)過了IgG Fc片段的吸附，片段的吸附，因此只與因此只與IgG的的Fab2片段結(jié)合。片段結(jié)合。 針對(duì)某一種屬的抗體能夠會(huì)和其他一些種屬有交叉反響。牛血潔白蛋白和奶粉能夠含有與抗牛IgG、抗山羊IgG、抗馬IgG、抗綿羊IgG等抗