第2次課天然藥物的研究與開(kāi)發(fā)

1、第二講第二講 天然藥物研究與開(kāi)發(fā)天然藥物研究與開(kāi)發(fā)一、天然藥物的研究開(kāi)發(fā)程序二、天然藥物中生物活性成分的研究方法三、我國(guó)中藥、天然藥物化學(xué)研究存在的主要問(wèn)題。一、天然藥物的研究開(kāi)發(fā)程序一、天然藥物的研究開(kāi)發(fā)程序（一）（一）從天然藥物或中藥中開(kāi)發(fā)新藥的五種從天然藥物或中藥中開(kāi)發(fā)新藥的五種形式形式：經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)資料或民間用藥的調(diào)研或通過(guò)現(xiàn)代藥理學(xué)的篩選研究，發(fā)現(xiàn)某種動(dòng)物、植物、礦物或微生物具有藥用價(jià)值，然后將其開(kāi)發(fā)成新藥。已知某種成分或某類(lèi)成分具有藥用價(jià)值或已成為新藥，根據(jù)動(dòng)植物的親緣關(guān)系，尋找含有這種或這類(lèi)成分的動(dòng)植物，進(jìn)而將其開(kāi)發(fā)成新藥。3. 在不明確有效成分的基礎(chǔ)上，將臨床療效明確的經(jīng)典方、經(jīng)驗(yàn)

2、方或經(jīng)藥效學(xué)研究具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的復(fù)方中藥開(kāi)發(fā)成新藥，或?qū)F(xiàn)有新藥改變劑型。4. 在基本上搞清了有效成分和有效部位的基礎(chǔ)上，將有效部位開(kāi)發(fā)成新藥。5. 通過(guò)天然藥物或中藥中的有效成分或生物活性成分的研究，從中發(fā)現(xiàn)有藥用價(jià)值的活性單體或潛在藥用價(jià)值的活性單體即先導(dǎo)化合物先導(dǎo)化合物。什么叫先導(dǎo)化合物呢? 有一定的生物活性，但因其活性不夠顯著或毒副作用較大，無(wú)法將其開(kāi)發(fā)成新藥的具有潛在藥用價(jià)值的化合物。（二）（二）天然物藥品（一類(lèi)新藥）的開(kāi)發(fā)研天然物藥品（一類(lèi)新藥）的開(kāi)發(fā)研究過(guò)程究過(guò)程：臨床前臨床前臨床臨床試生產(chǎn)試生產(chǎn)活性跟蹤指導(dǎo)下的活性成分(結(jié)構(gòu)新穎和作用機(jī)制新穎)的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定將是天然產(chǎn)物化學(xué)

3、研究的主要形式。選定研究對(duì)象收集資料篩選活性有活性者跟蹤分離得單體或活性部位確認(rèn)結(jié)構(gòu)動(dòng)物試驗(yàn)（藥效、毒性、藥代） 申報(bào)臨床研究臨床研究（1、2期） 申請(qǐng)新藥證書(shū)及生產(chǎn)批文號(hào)試生產(chǎn)（3期） 正式生產(chǎn)。（原料供應(yīng)保障研究、制劑工業(yè)化研究。需1015年時(shí)間、 1.52.5億美元）二、天然藥物中生物活性成分的研究方法二、天然藥物中生物活性成分的研究方法（一）天然藥物及中藥中原生生物活性成分（一）天然藥物及中藥中原生生物活性成分的研究的研究:通過(guò)調(diào)研或廣泛篩選需要開(kāi)發(fā)的天然藥物。根據(jù)原料藥中化學(xué)成分的性質(zhì)將其粗分成幾個(gè)部分，通過(guò)活性測(cè)試確定有效部位。1. 在活性測(cè)試指導(dǎo)下，采用各種色譜方法和其它方法對(duì)活

4、性部位進(jìn)行跟蹤分離，最終得到活性成分。文文 獻(xiàn)獻(xiàn) 古古 籍、民籍、民 族族 、 民民 間、臨間、臨 床床 名名 方、天方、天 然然 產(chǎn)產(chǎn) 物、國(guó)外天然藥物、老藥物、國(guó)外天然藥物、老藥活性篩選活性篩選收集樣品收集樣品提取提取粗提物粗提物體外方法體外方法體內(nèi)方法體內(nèi)方法有活性有活性無(wú)活性無(wú)活性分離分離結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)構(gòu)鑒定活性跟蹤活性跟蹤有效部位有效部位有效成分有效成分活性先導(dǎo)化合物活性先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化結(jié)構(gòu)優(yōu)化構(gòu)效關(guān)系研究構(gòu)效關(guān)系研究活性化合物活性化合物新藥研發(fā)新藥研發(fā)新藥研發(fā)新藥研發(fā)有效部有效部位新藥位新藥有效成有效成分新藥分新藥新藥研發(fā)新藥研發(fā)新化學(xué)藥新化學(xué)藥代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物體內(nèi)代謝研究體內(nèi)代謝研

5、究活性篩選活性篩選活性化合物活性化合物根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)確定單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。對(duì)有開(kāi)發(fā)價(jià)值的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系的研究，進(jìn)而將其按國(guó)際慣例開(kāi)發(fā)成創(chuàng)新藥物。 從天然藥物或中藥中開(kāi)發(fā)創(chuàng)新藥物的關(guān)鍵是能否從天然藥物或中藥中分離得到有藥用價(jià)值藥用價(jià)值或潛在藥用價(jià)值潛在藥用價(jià)值的活活性化合物性化合物； 中藥是創(chuàng)新藥物及其先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。 基于高通量活性篩選跟蹤的活性成分研究基于高通量活性篩選跟蹤的活性成分研究細(xì)胞、靶酶水平細(xì)胞、靶酶水平的高通量篩選的高通量篩選親和色親和色譜技術(shù)譜技術(shù)生物芯生物芯片技術(shù)片技術(shù)中藥樣品中藥樣品粗提物粗提物分離部位分離部位單體化合物單體化合物分子

6、烙分子烙印技術(shù)印技術(shù)（二）天然藥物及中藥中前體活性成分的研究（二）天然藥物及中藥中前體活性成分的研究 有些中藥中的化學(xué)成分本身并無(wú)生物活性，但經(jīng)體內(nèi)代謝后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有很強(qiáng)的生物活性（前體藥物 prodrug）； 例如：秦皮素 3,4-二羥基苯丙酸（抗菌）（體內(nèi)代謝）體內(nèi)代謝法： 即將天然藥物或其成分給動(dòng)物食用后，分別收集動(dòng)物的糞便、尿、膽汁，然后采用各種提取分離方法分離它們中的代謝產(chǎn)物，并采用譜學(xué)和與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的方法確定它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)已知的情況下進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)，對(duì)有開(kāi)發(fā)價(jià)值的化合物再進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。（三）血清藥化學(xué)和血清藥理學(xué)（三）血清藥化學(xué)和血清藥理學(xué) 除了治療消化道系統(tǒng)或

7、某些特殊的成分，通常天然藥物中成分只有吸收入血吸收入血后才能發(fā)揮藥效。 目前進(jìn)展就較慢，原因如下： 不同化學(xué)成分在天然藥物中含量相差巨大（百分之幾至百萬(wàn)分之幾）； 不同化學(xué)成分與血漿蛋白結(jié)合率不同； 同一成分在不同時(shí)間在血中含量不同（吸收入血成分很快被代謝、分布、排泄）； 天然藥物成分在動(dòng)物體內(nèi)難以積累到足量樣品； 結(jié)構(gòu)測(cè)定方法有限，多數(shù)只能依靠LC-MS。（四）天然藥物的化學(xué)修飾或結(jié)構(gòu)改造（四）天然藥物的化學(xué)修飾或結(jié)構(gòu)改造 從天然藥物或中藥中篩選追蹤得到活性化合物只是一類(lèi)創(chuàng)新藥物研究的前期階段。不少天然活性化合物因?yàn)榇嬖谀承┤毕荻y以直接開(kāi)發(fā)利用： 藥效不理想； 存在一定的毒副作用； 含量太

8、低，難以從天然原料中取材； 因結(jié)構(gòu)過(guò)于復(fù)雜，合成也十分困難； 水溶性差、生物利用度差等等 以它們?yōu)橄葘?dǎo)化合物，在經(jīng)過(guò)一系列的化學(xué)修飾或結(jié)構(gòu)改造后，對(duì)得到的衍生物進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系比較研究，可能發(fā)現(xiàn)比較理想的活性化合物，并開(kāi)發(fā)成新藥。 例 青蒿素的構(gòu)效關(guān)系研究 4.4.數(shù)據(jù)庫(kù)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)檢索5. 5. 活性化合活性化合物的分離和物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)構(gòu)鑒定3.3.聯(lián)用光譜聯(lián)用光譜MSUV2 2. 生物活性測(cè)試生物活性測(cè)試1. HPLC 分離分離HPLC天然藥物（五）從中藥或天然藥物中跟蹤分離活性化合物一級(jí)色譜一級(jí)色譜二級(jí)色譜二級(jí)色譜三級(jí)色譜三級(jí)色譜高通量篩選高通量篩選LC-MS、LC-NMR色譜高通量

9、篩選快速結(jié)構(gòu)鑒定色譜高通量篩選快速結(jié)構(gòu)鑒定(LC-MS、LC-NMR)聯(lián)用技術(shù)聯(lián)用技術(shù)流流份份Planta Med. 67, 411-16 (2001)0102030405060I II III IV V VI VII VIII IX X XICOX-2 Inhibition in Mono Mac 6 cells %Injected: 200 gFor bioassay: 50 gTryptanthrinNNOOIndirubinONHNHOPlanta Med. 68, 64-5 (2002)MeOH Extract of SupernatantColumn ChromatographyH

10、PLCGel ChromatographyCompounds 1 + 2RP low-pressure LC Kieselgel 60 F254; CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5)1 Extrakt 2OOHCH3OHOHOHOCH3OHOH1246712467552OHOHCH3OOOOHOHOHCH312445713576OOHCH3OHOHHHHH12467HMBCOOHCH3OHOHOHOCH3OHOH12467471246755OHOHHHOHOOHOHOHOCH3HOHOOHOHOHHHHOCH3HHHOHOHHH13657H3C13467COSYHMBC13567

11、13657H3C 1H-1H 仙鶴草根芽干粉 石油醚提取 殘?jiān)?石油醚提取物 （） 氯仿提取 殘?jiān)?氯仿提取物（） 乙醇提取 殘?jiān)?乙醇提取物（） 鶴草芽中驅(qū)絳有效成分agrimonophol的追蹤分離： 仙鶴草根芽是薔薇科植物龍牙草根莖的芽。民間用其干粉內(nèi)服驅(qū)絳蟲(chóng)，療效顯著。但謂水煎液無(wú)效、醇浸后蒸去醇去渣(沉淀)服用也無(wú)效，連渣服用有效。研究者選用體外滅囊蟲(chóng)試驗(yàn)，按下列程序進(jìn)行活性追蹤。 結(jié)果，石油醚提取物示有明顯體外滅囊活性。TLC檢查示含有十幾種酚性成分。將石油醚提取物隨用不同堿液作pH梯度萃取，由NaHCO3萃取部分分到有效單體鶴草酚，最后經(jīng)一系列化學(xué)降解及光譜測(cè)試，確定結(jié)構(gòu)如圖所示

12、，并經(jīng)化學(xué)全合成得到確認(rèn)。 CH3CH3OOHCH3CH2CH2COOHCH2HOCH3CH3OHCOCHCH2CH3OCH3鶴草酚（Agrimonophol）紫杉醇的發(fā)現(xiàn)紫杉醇的發(fā)現(xiàn)： 1971年：提取分離，結(jié)構(gòu)確定，活性確認(rèn) 1975-76年：在多種瘤株上實(shí)驗(yàn)有效； 1977年：臨床前研究； 1979年：作用機(jī)理探明； 1982年：期臨床實(shí)驗(yàn)； 1985-86年：期臨床實(shí)驗(yàn)(卵巢癌)； 1986年：紫杉醇側(cè)鏈的全合成； 1988年：紫杉醇半合成； 1990-93年：側(cè)鏈合成方法的改進(jìn)； 1992年：FDA批準(zhǔn)； 1994年：首次全合成。 紅豆杉莖12kg濃縮物95%乙醇提取氯仿-甲醇萃取水

13、層(棄去) 氯仿30管液滴逆流層析8-18管(14g,T/C=30%,23mg/kg)400管液滴逆流層析170-189管(2.4g,T/C=16%,15mg/kg)析出Taxol(0.5g,T/C=24%,5mg/kg)加苯研磨10974321HOCOCH3OOCOC C C OOHH HNHCOOCH3COOOHOHOHH喜樹(shù)堿的發(fā)現(xiàn)： 喜樹(shù)原料12kg熱正己烷提取正己烷提取物植物殘?jiān)?無(wú)活性,棄去)乙醇提取用4倍體積的氯仿+1/4體積的5%含水乙醇處理氯仿層(222g)(高活性)水層氯仿處理氯仿層(32g)水層(高活性)(低活性)NNOOOOHABCDF12310987654141211

14、181920211716茜草根中抗腫瘤活性成分的追蹤分離： 茜草根的抗腫瘤活性系采用S-180荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的。通過(guò)活性成分的追蹤分離；最后得到了具有抗腫瘤活性的RA-5及RA-7等環(huán)肽類(lèi)活性物質(zhì)。 HNOOCH3NOHNNHOROOOOONRA-5 HRA-7 CH3R 分離過(guò)程中，活性測(cè)試系在接種了p-388白血病瘤細(xì)胞的CDFl系小鼠身上進(jìn)行。每個(gè)小鼠接種的瘤細(xì)胞數(shù)為1106。抑瘤活性以給藥組動(dòng)物平均存活天數(shù)（T）相對(duì)于對(duì)照組動(dòng)物平均存活天數(shù)（C）的百分率，即延命效果（T/C）表示。T/C125時(shí)始認(rèn)為有活性。 各個(gè)分離部分或餾分的活性篩選均按等劑量原則進(jìn)行。甲醇

15、、苯、乙酸乙酯及水提取物均按200 mg/kg小鼠劑量進(jìn)行投藥，但從苯提取物出發(fā)分離得到的各個(gè)組分，以苯提取物數(shù)量為100時(shí)各個(gè)餾分的收率為Y，按200 (Y/100) mg/kg小鼠劑量投藥。故實(shí)際上各個(gè)組分（子體）的投藥劑量與苯提取物（母體）投藥量相當(dāng)，測(cè)得的活性強(qiáng)弱有定量比較意義。 投藥方法均為腹腔注射，每日1次，從植入腫瘤細(xì)胞后次日起連續(xù)進(jìn)行5天。說(shuō)明：說(shuō)明：（六）天然藥物中生物活性成分研究需（六）天然藥物中生物活性成分研究需要注意的幾個(gè)問(wèn)題要注意的幾個(gè)問(wèn)題:創(chuàng)新藥物的開(kāi)發(fā)是一個(gè)高技術(shù)、高風(fēng)險(xiǎn)、高投入、高回報(bào)、知識(shí)密集型的系統(tǒng)工程, 涉及化學(xué)、藥理、制劑、臨床醫(yī)學(xué)、毒理等多學(xué)科領(lǐng)域。（

16、1個(gè)創(chuàng)新藥物需 1012年，耗資23億美元；但年銷(xiāo)售額可達(dá)百億美元）創(chuàng)新藥物與活性化合物是兩碼事（體內(nèi)藥效、毒性、臨床療效、制劑、吸收、分布、代謝、排泄、原料、成本、市場(chǎng)）。要注重知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)（活性部位或活性單體）。 選擇適當(dāng)?shù)幕钚詼y(cè)試方法 天然活性化合物的追蹤分離能否取得成功，關(guān)鍵在于有無(wú)好的生物活性測(cè)試體系。試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢杂姓w動(dòng)物、器官、組織、細(xì)胞、酶或受體以及體內(nèi)生物活性物質(zhì)等。近來(lái)并已開(kāi)始注意在基因調(diào)控水平上建立起新的篩選體系。（1）動(dòng)物模型優(yōu)點(diǎn)：采用整體動(dòng)物進(jìn)行的試驗(yàn)與人比較相近。缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)費(fèi)錢(qián)，現(xiàn)象復(fù)雜，而且動(dòng)物個(gè)體差異以及病理模型難于建立。 用動(dòng)物模型作為指導(dǎo)分離過(guò)程的活性

17、篩選方法不太適宜。 （2）體外模型優(yōu)點(diǎn)：靈敏、簡(jiǎn)便、可用于微量樣品的測(cè)試。利用對(duì)酶、受體或體內(nèi)生物活性物質(zhì)的抑制或促進(jìn)作用，以及利用基因調(diào)控影響進(jìn)行的活性測(cè)試方法簡(jiǎn)便易行、可定量。缺點(diǎn)：有時(shí)體外活性測(cè)試方法所得結(jié)果與藥物實(shí)際在體內(nèi)的作用并不平行。 體外活性測(cè)試方法在實(shí)際工作中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。3. 確保供試材料具有活性 這是追蹤分離活性化合物的前提。為了確?；钚猿煞值姆蛛x工作在可靠的基礎(chǔ)上進(jìn)行，對(duì)供試天然藥物或中藥有時(shí)須采用多項(xiàng)指標(biāo)、體內(nèi)外結(jié)合進(jìn)行測(cè)試加以確認(rèn)。 植物粗提物 體外多項(xiàng)指標(biāo)篩選抗腫瘤活性 示有抗腫瘤活性 體內(nèi)篩選抗腫瘤活性（P-388荷瘤小鼠） 有抗腫瘤活性 無(wú)抗腫瘤活性 確

18、定抗腫瘤活性或作用機(jī)制有無(wú)新穎性 萃取分離 示有新穎性 萃取物 體外篩選抗腫瘤活性 追蹤分離活性成分 示有抗腫瘤活性 體外復(fù)篩抗腫瘤活性 有活性 無(wú)活性（棄去） 美國(guó)國(guó)立癌癥研究中心篩選抗腫瘤活性粗提取物的方法:優(yōu)點(diǎn)： 活性低或含最少的化合物不至于丟失； 增加了檢出新化合物的機(jī)會(huì)； 可能分離得到具有不同作用機(jī)制的化合物。4、在眾多生物活性中力求找出最本質(zhì)的作用 天然藥物或中藥在臨床治療上可能作用于多個(gè)靶點(diǎn)，因而具有多種療效，即表現(xiàn)出多方面的活性。研究者應(yīng)當(dāng)力求找出其中最本質(zhì)的作用，選擇建立反映臨床治療作用特點(diǎn)、且效果與之平行的活性測(cè)試體系，才有可能追蹤分離出目的活性成分或甚至有效成分。供試材料

19、 生理作用 生理活性測(cè)定方法 目的活性物質(zhì) 烏頭 強(qiáng)心、利尿、興奮、鎮(zhèn)痛 離體蛙心 去甲基烏藥堿 大黃 健胃、緩瀉 致瀉活性(小鼠) 番瀉苷 茵陳蒿 利膽、抗炎 膽汁分泌促進(jìn)作用 茵陳色原酮等 貝(日本產(chǎn)) 口渴、視力減退、瞳孔散大、言語(yǔ)障礙、便秘 小鼠散瞳率試驗(yàn) surugatoxin 軟紫草 止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌 前列腺素合成抑制活性 arnebinol arnibinone arnebifuranone 5、注意正確比較并判斷各個(gè)組分的活性 分離過(guò)程中總是按“等劑量不等強(qiáng)度原則”對(duì)每一階段得到的組分（子體）進(jìn)行活性定量評(píng)估，并與母體作比較，追蹤活性最強(qiáng)組分。 如果與母體比較，所

20、得幾個(gè)子體活性強(qiáng)弱參差不齊，則示活性分離與物質(zhì)分離平行，預(yù)示可能得到良好的分離效果； 如果某個(gè)子體活性顯著增強(qiáng)，則示分離過(guò)程中可能除去了某種拮抗作用物質(zhì)。具有良好的物質(zhì)分離與活性分離。 如果所得各個(gè)子體活性均見(jiàn)明顯減弱，則提示活性成分可能分解、流散、或因吸附劑發(fā)生不可逆吸附所致，或因該藥物的活性原本為多組分的綜合作用，故分離后反而導(dǎo)致活性的減弱或喪失。 具體問(wèn)題宜具體分析，在查明原因后立即采取相應(yīng)對(duì)策處理。分離過(guò)程中應(yīng)配合活性測(cè)試，采用多種分離手段以求獲得良好的分離效果，并應(yīng)盡量避免采用可能導(dǎo)致活性成分分解或不可逆吸附的方法或試劑。五、我國(guó)中藥、天然藥物化學(xué)研究存在的六個(gè)主要問(wèn)題。一些研究者只是單純進(jìn)行化學(xué)研究，滿足于發(fā)現(xiàn)一些新化合物發(fā)表文章，對(duì)活性則極不重視，很少有人進(jìn)行活性成分研究?；钚猿煞盅芯康乃悸泛头椒ú划?dāng)。化學(xué)家與生物學(xué)家相互脫節(jié)。未能重視中醫(yī)藥的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)。多采用西醫(yī)哲學(xué)思想研究中藥。從中藥或天然藥物中