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文檔簡介
1、重點(diǎn)腸道傳染病實(shí)驗(yàn)室檢測方法 概述 襄陽市疾控中心 趙耀儒 2014/11/21o 霍亂弧菌培養(yǎng)、分型操作方法。o 傷寒、副傷寒培養(yǎng)操作方法。o 細(xì)菌性痢疾(阿米巴痢疾)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作方法。、o 手足口病實(shí)驗(yàn)操作方法。o 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)微生物標(biāo)本的采集微生物標(biāo)本的采集通常有血液、腦脊液、尿液、傷口的膿液、胸水腹水、糞便、痰液及泌尿生殖系統(tǒng)的分泌物。 1采集的一般原則:a早期采集b 無菌采集o注意對局部及周圍皮膚的消毒。o寄生部位采集的標(biāo)本應(yīng)明確目的菌,采用選擇培養(yǎng)基。C 不同菌不同采集方法D 采集適量標(biāo)本,量不應(yīng)過少,注意采集不同時間不同部位標(biāo)本,要全面。E 安全采集 o 2 標(biāo)本處理 2h送到檢
2、驗(yàn)處,部分菌應(yīng)保溫于一定環(huán)境中保存。如尸檢組織、支氣管洗液、心包液、痰、尿等標(biāo)本要保存于4環(huán)境中,腦脊液保存于25。注意安全尤其對烈性傳染病。有時可以直接用抽取標(biāo)本的注射器。o 3各部位標(biāo)本的采集及注意事項(xiàng) 霍亂檢驗(yàn)程序o標(biāo)本的采集和送檢o分離培養(yǎng)o鑒定一、標(biāo)本的采集和送檢 1.標(biāo)本的采集:標(biāo)本采集的好壞,對整個檢驗(yàn)工作的質(zhì)量影響很大。糞便標(biāo)本的采集應(yīng)爭取在發(fā)病早期,服用抗菌藥物之前并盡快送到檢驗(yàn)室。 標(biāo)本以病人糞便為主。采便方法可用棉拭采取自然排出的新鮮大便,亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內(nèi)35cm處采取。采用后者應(yīng)注意棉拭大小適宜,避免采便量過少。一般要求水樣便采取13ml,成形便采
3、取指甲大小的糞量。在某些情況下,病人的嘔吐物、沾染糞便的衣物和尸體的腸內(nèi)容物亦可作為檢材。 2.標(biāo)本的送檢:采得的標(biāo)本應(yīng)立即接種于培養(yǎng)基。劇烈腹瀉病人的水樣便含有大量病菌(106109/ml),直接分離培養(yǎng)不難檢出陽性。不能立即檢查的,要接種于保存培養(yǎng)基內(nèi),盡快送往檢驗(yàn)室。送檢標(biāo)本可放入堿性蛋白胨水、文堿性蛋白胨水、文臘二臘二氏保存液或插入氏保存液或插入CaryBlair二氏半固體保存培養(yǎng)基二氏半固體保存培養(yǎng)基中。后者不僅對霍亂弧菌,而且對其它腸道致病菌也有保存作用。標(biāo)本與保存液的比例要適當(dāng),810ml保存液可加入13ml液體便或指甲大小的成形便,過多的大便量可降低保存液的pH值。二、分離培養(yǎng)
4、方法 1.直接分離培養(yǎng):急性期病人水樣大便標(biāo)本在增菌培養(yǎng)的同時,可取其粘液絮片或用棉拭標(biāo)本直接作分離培養(yǎng)。這不僅能縮短檢出時間,還可避免標(biāo)本中其他雜菌特別是非O1群霍亂弧菌經(jīng)增菌后大量繁殖而影響O1群霍亂弧菌的分離 分離培養(yǎng)基有選擇性強(qiáng)、弱之不同。選擇性強(qiáng)的培養(yǎng)基常用的慶大霉素慶大霉素瓊脂和瓊脂和4號瓊脂號瓊脂等;選擇性弱的有堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂等。培養(yǎng)基的使用,可根據(jù)當(dāng)?shù)鼐唧w情況和各檢驗(yàn)室的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)來選擇。近年的趨勢是使用堿性蛋白胨水增菌,再用強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離。瓊脂平皿應(yīng)新鮮配置,接種前培養(yǎng)基表面適當(dāng)烘干。劃線培養(yǎng)應(yīng)掌握能分離出盡量多的單個菌落。一般每個標(biāo)本接種
5、一個平皿,必要時一個標(biāo)本接種強(qiáng)和弱選擇性培養(yǎng)基各一個。在慶大霉素瓊脂平皿上,腸內(nèi)細(xì)菌和革蘭氏陽性菌的生長受到顯著抑制?;【L快、菌落大,培養(yǎng)45小時,原劃線處有菌臺生長,810小時可長出小菌落,16小時菌落直徑可達(dá)2mm。菌落弱帶灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑濕潤,培養(yǎng)時間延長或室溫放置后,菌落略帶黃色,中心厚而周圍透明,培養(yǎng)基含亞碲酸鉀時菌落呈灰色,中心形成黑色金屬碲沉淀培養(yǎng)基含亞碲酸鉀時菌落呈灰色,中心形成黑色金屬碲沉淀。在堿性瓊脂平皿上弧菌生長也較快,菌落較透明。在這些平皿上挑取菌落做玻片凝集容易形成懸液,凝集狀態(tài)良好。 2.增菌后分離培養(yǎng):所有糞便標(biāo)本都應(yīng)經(jīng)過增菌,尤其是恢復(fù)期病人
6、、帶菌者或用過抗菌藥物的病人標(biāo)本含菌量少,單靠直接分離不易檢出,須經(jīng)增菌培養(yǎng)再作分離。堿胨水標(biāo)本管放37增菌68小時后分離,夏天可將運(yùn)送時間計算在內(nèi)。標(biāo)本如為保存液或半固體保存培養(yǎng)基,則取1.0ml或?qū)⒚奘棉D(zhuǎn)種至810ml堿胨水中,并將棉拭內(nèi)容物在胨水管壁上擠出。37培養(yǎng)68小時后,平穩(wěn)地從溫箱中取出試管架,從霍亂弧菌生長最茂盛的菌膜下表層,取一接種環(huán),劃線接種于強(qiáng)選擇性瓊脂平皿。 標(biāo)本含菌量少時,為提高檢出率,可實(shí)行2次增菌,取第一次堿胨水增菌68小時的培養(yǎng)物的表層液0.10.2ml,接種于810ml的堿胨水中,37培養(yǎng)68小時再做分離。三、鑒定 鑒定標(biāo)準(zhǔn)以血清學(xué)性狀為主,結(jié)合形態(tài)學(xué)和生化學(xué)
7、性狀作出判定。血清學(xué)性狀以玻片凝集實(shí)驗(yàn)為主,可疑菌落先用O1群或/和O139群霍亂弧菌診斷血清作檢查。 玻片凝集實(shí)驗(yàn)玻片凝集實(shí)驗(yàn):自分離培養(yǎng)基上挑取可疑菌落與O1群或/和O139群霍亂診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)。因標(biāo)本中可能存在O1群、O139群或非O1群/非O139群霍亂弧菌,為減少工作量及避免遺漏,推薦使用O1群和O139群霍亂兩價診斷血清,檢出陽性時再用單價血清進(jìn)一步鑒定。玻片凝集用血清的效價,一般應(yīng)為1:401:50(不低于1:32,不高于1:64)。即根據(jù)血清原效價作適當(dāng)稀釋,使其效價成為1:401:50,如原效價為1:1280,制成1:50效價的血清,即須稀釋1:25(12801/50
8、25.6)使用。將稀釋血清滴加在潔凈的玻片或平皿內(nèi),再以接種針或小接種環(huán)取可疑菌落放在血清液滴近旁,磨勻,然后混入血清內(nèi)制成均勻懸液。很快(一般不超過10秒鐘)出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集者為陽性。凝集的菌落應(yīng)以生理鹽水作對照,檢查有無自然凝集。將凝集的菌落接種普通瓊脂斜面上,培養(yǎng)68小時后準(zhǔn)備做進(jìn)一步的鑒定,如菌落還有足夠的 剩余,亦可用來做單價血清的玻片凝集,以確定血清型。 有的標(biāo)本可能同時存在非O1群/非O139群霍亂弧菌,因此,可疑菌落較多時,應(yīng)挑選5個以上的菌落逐個進(jìn)行玻片凝集檢查。必要時,取原劃線菌苔邊緣透明部分再做玻片凝集。這對一次流行的首批病人進(jìn)行檢查時尤應(yīng)注意。此外,平皿分離未獲分
9、散的單個菌落,而在密集部位仍有可疑菌落時,應(yīng)將該部分再做或經(jīng)增菌后再做分離。 有時從恢復(fù)期病人分離出菌落典型但不凝集的弧菌,這時應(yīng)以霍亂粗糙型血清作玻片凝集,檢查是否為本菌的粗糙型。傷寒桿菌檢測程序一、標(biāo)本采集一、標(biāo)本采集 用無菌方法采集新鮮標(biāo)本,置于滅菌容器中,或直接接種于增菌培養(yǎng)基中,登記好標(biāo)本號碼填寫送檢單及時送檢。運(yùn)送途中嚴(yán)防污染及容器破損。如不能及時送檢,可于4保存。為提高標(biāo)本的陽性率,應(yīng)根據(jù)病程的不同階段采集不同的標(biāo)本。 血:血:血標(biāo)本宜在傷寒發(fā)病早期和使用抗生素前采集。以無菌方法采血5毫升。第一周血培養(yǎng)陽性率可達(dá)90%。傷寒患者血液中有殺傷寒菌素,膽鹽可以抑制這種殺菌素的作用,故
10、可選用葡萄膽鹽肉湯增菌葡萄膽鹽肉湯增菌培養(yǎng)基。如標(biāo)本已凝固,可取出血清作肥達(dá)反應(yīng),將血塊攪碎后做血培養(yǎng)。 糞便糞便:用棉拭采取患者新鮮糞便1一2克置于增菌液內(nèi),也可用緩沖甘油鹽水甘油鹽水或CaryBlair運(yùn)送培養(yǎng)基保存送檢。最好在用抗菌藥物治療前3天后采樣。 尿:尿:病程第2、3周起,可取尿培養(yǎng)。用無菌導(dǎo)尿法或取中段尿50毫升,離心取物增菌或直接分離。 骨髓骨髓:培養(yǎng)陽性率高,特別對經(jīng)過治療的傷寒病人,可考慮作骨髓培養(yǎng)。二、分離培養(yǎng)二、分離培養(yǎng)1、 血標(biāo)本 取病人靜脈血5毫升加入約10倍量的葡萄糖膽鹽肉湯中,37培養(yǎng),逐日觀察結(jié)果。如出現(xiàn)混濁即可用血瓊脂或血瓊脂或SS、麥康凱瓊脂、麥康凱瓊脂
11、進(jìn)行分離培養(yǎng),37培養(yǎng)18一24小時,挑取疑菌落作進(jìn)一步鑒定。一般增菌1一2天陽性率高,如至第7天培養(yǎng)物仍清澈透明,經(jīng)接種培養(yǎng)仍無菌生長,則可判為陰性。2、糞便標(biāo)本 (1)直接分離培養(yǎng)將標(biāo)本接種到SS和麥康凱瓊脂和麥康凱瓊脂上,37培養(yǎng)18一24小時,挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。 (2)增菌培養(yǎng)將標(biāo)本乳化后接種在改良的亞硒酸氫鈉甘露醇亞硒酸氫鈉甘露醇(SFM)增菌培養(yǎng)基中,37培養(yǎng)15一18小時后,再接種到SS和麥康凱瓊脂和麥康凱瓊脂上,37培養(yǎng)18一24小時后,挑取可疑菌落。3、尿、膽汁、骨髓標(biāo)本 取患者尿或膽汁經(jīng)離心后的沉淀物或骨髓液,作直接分離或增菌分離培養(yǎng),方法與糞便標(biāo)本分離培養(yǎng)方法相同。三
12、、鑒定1、初步生化鑒定 挑取上述分離培養(yǎng)基上無色、透明或半透明的可疑菌落2一3個,分別接種雙糖鐵斜面(KIA)和動力靛基質(zhì)尿素半固體(MIU)各一支,37培養(yǎng)18一24小時,觀察生化反應(yīng)。若符傷寒或副傷寒桿菌生化反時,則取KIA斜面上菌苔進(jìn)行血清學(xué)鑒定。2、血清學(xué)分型(1)0血清群別判定初步生化反應(yīng)符合傷寒或甲、乙、丙型副傷寒桿菌時,先用AF群沙門氏“0”多價血清作玻片凝集,以判定其群別。(2)H抗原判定0抗原判定后,依次用相應(yīng)的H因子血清檢查第一相和第二相抗原與Hd因子血清凝集。(3)Vi抗原檢查新分離的傷寒桿菌有Vi抗原,能與Vi血清凝集。一、標(biāo)本采集、運(yùn)送、包裝、保存、接收 可采用便盒留
13、便、肛拭或采便管采便。便盒留便:留取糞便時應(yīng)采集新鮮糞便的膿血部分、粘液部分、水樣便或稀便。便量15g。 集體腹瀉或食源性暴發(fā)患者糞便采集的數(shù)額,應(yīng)根據(jù)患者人數(shù)的多少,決定采取標(biāo)本的數(shù)量。當(dāng)懷疑患者為菌血癥時,應(yīng)以無菌操作,從靜脈血管采取1015 mL血液,放入加有EDTA抗凝劑瓶中送檢。所采取的糞便標(biāo)本應(yīng)盡快送檢,不得超過 2 h送到化驗(yàn)室,否則標(biāo)本應(yīng)放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基運(yùn)送培養(yǎng)基中,運(yùn)送時間超過2h者,應(yīng)在冰浴條件下送檢。送交分型分析菌株的接收要求:1)經(jīng)過分純的沒有污染的菌株; 2)分離菌株應(yīng)該用甘油半固體保存;3)與分離菌株相對應(yīng)的患者的臨床癥狀和流行病學(xué)資料;4) 經(jīng)血
14、清和生化證實(shí)為志賀菌。痢疾檢驗(yàn)程序痢疾檢驗(yàn)程序二、糞便標(biāo)本志賀菌的分離方法1、分離方法(1) 用接種環(huán)多點(diǎn)沾取標(biāo)本病變部分,直接劃線分離于SS、EMB(或HE、麥康凱)瓊脂平板。37培養(yǎng)24 h。(2) 血液培養(yǎng) 將采取的抗凝血液標(biāo)本,放入葡萄糖肉湯,37培養(yǎng),逐日觀察結(jié)果。一般13 d內(nèi)陽性較高。為提高陽性檢出率,可以在標(biāo)本中加入0.5 mL OP乳化劑(聚乙二醇辛基苯基醚),使血球溶解,以提高陽性檢出率。(3) 挑選可疑菌落 從37培養(yǎng) 1624 h的分離培養(yǎng)基上,觀察挑選可疑菌落,其形態(tài)為無色,半透明,圓形,濕潤、光滑、突起,大小為12mm;挑選可疑菌落,接種 TSI和葡萄糖半固體或綜合
15、培養(yǎng)基,先劃線后穿刺,做好標(biāo)記,放37培養(yǎng) 16 h以上,觀察結(jié)果 2、初步生化反應(yīng) 志賀菌屬在 TSI上的生化反應(yīng)為:斜面紅色,底層產(chǎn)酸黃色,不產(chǎn)氣。在葡萄糖半固體管內(nèi)產(chǎn)酸為黃色,不產(chǎn)氣,無動力。在綜合培養(yǎng)基上為:斜面紅色中立段產(chǎn)酸黃色,底層綠色,無動力,福氏志賀菌 6型在上述三種培養(yǎng)基中,有時可產(chǎn)生少量氣體。 3、生化學(xué)鑒定(1) 凡屬志賀氏菌屬的培養(yǎng)物,應(yīng)符合表Al所列的生化特性。(2) 志賀菌屬分為四個生化群。血清學(xué)分型與生化反應(yīng)不一致者,均為非志賀菌。(3) 生化反應(yīng)或血清學(xué)反應(yīng)可疑的培養(yǎng)物,均應(yīng)做革蘭氏染色鏡儉,并加做V.P、苯丙氨酸、西蒙氏檸檬酸鹽、賴氨酸和葡萄糖n銨試驗(yàn),與有關(guān)
16、的細(xì)菌相鑒別。 腸出血性大腸桿菌O157:H7的檢驗(yàn)程序 糞便或其它標(biāo)本 增菌6小時左右 磁珠濃縮 山梨醇麥康凱 培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24小時可疑菌落革蘭氏 生化 血清學(xué) 毒力因子染色 反應(yīng) 鑒定 鑒定*根據(jù)結(jié)果判定* 有條件的單位可進(jìn)行如用PCR檢測SLT1 、SLT2、Hly、EAE的基因 【注】1、培養(yǎng)及增菌均在37進(jìn)行;2、山梨醇-麥康凱培養(yǎng)基中應(yīng)加入適當(dāng)?shù)囊志鷦?、“科瑪嘉”培養(yǎng)基加入亞碲酸鉀后選擇效果更好;4、在SMAC中加入下列抑制劑的一種均可增加培養(yǎng)基的選擇性;1)亞碲酸鉀2.5mg/l 和先鋒霉素類抗生素Cefixime 0.05mg/l;2)新生霉素10mg/l;3)萬古霉素
17、40mg/l;5、在科瑪嘉或S-MAC平板上挑選可疑菌落與O157診斷血清、H7血清或O157單克隆抗體作試探性凝集試驗(yàn),若不凝集,但臨床表現(xiàn)疑為EHEC感染,則應(yīng)做如下處理。因?yàn)閭€別腸出血性大腸桿菌O157:H7具有K抗原,應(yīng)在生化反應(yīng)確定為大腸桿菌后用生理鹽水制備菌懸液,并100水浴加熱10-15分鐘再與O157診斷血清或O157單克隆抗體做凝集試驗(yàn)。6、當(dāng)生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果均與腸出血性大腸桿菌O157:H7符合時,才能確認(rèn)為腸出血性大腸桿菌O157:H7。7、目前許多國家使用的O157和H7特異性抗體與及少數(shù)細(xì)菌具有不同程度的交叉反應(yīng),如美國、法國還有我國自己生產(chǎn)的試劑都與弗勞地枸
18、櫞酸桿菌有交叉反應(yīng),因此,用生化試驗(yàn)確定為大腸桿菌是必須的,最為重要的是硫化氫試驗(yàn)。絕大多數(shù)腸出血性大腸桿菌菌株在24小時內(nèi)不的發(fā)酵D-山梨醇。 但是, 也報道了一些能夠快速發(fā)酵D-山梨醇的菌株。8、典型大腸桿菌的主要生化反應(yīng)結(jié)果如下:1)動力試驗(yàn) 葡萄糖 麥芽糖 甘露醇 蔗糖 硫化氫 尿素試驗(yàn) +/ 2)靛基質(zhì) 甲基紅 V-P試驗(yàn) 枸櫞酸鹽 苯丙氨酸脫氨酶 3)賴氨酸脫羧酶 鳥氨酸脫羧酶 氧化酶 氰化鉀 +/ +/ PCR在感染性疾病病原體在感染性疾病病原體檢測中的應(yīng)用檢測中的應(yīng)用u 病毒的檢測病毒的檢測o 定量定量o 定性定性o 基因型及基因突變基因型及基因突變u 細(xì)菌及其它微生物的檢測細(xì)菌及其它
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