學(xué)會(huì)各種PCR介紹

1、學(xué)會(huì)各種PCR介紹聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction) 根據(jù)細(xì)胞分裂中根據(jù)細(xì)胞分裂中 DNA 半保留復(fù)制機(jī)半保留復(fù)制機(jī)理，在體外快速擴(kuò)增某一特定理，在體外快速擴(kuò)增某一特定 DNA 片段片段的方法。的方法。PCRPCR工作原理工作原理 以要擴(kuò)增的要擴(kuò)增的DNADNA分子為模板分子為模板， 以一對(duì)與模板一對(duì)與模板55末端和末端和33末端互補(bǔ)的寡核甘末端互補(bǔ)的寡核甘酸片段為引物酸片段為引物 4 4種脫氧核糖核甘酸存在的條件下種脫氧核糖核甘酸存在的條件下 依賴依賴DNADNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)聚合酶的酶促合成反應(yīng)。 PCR PCR特異性取決于引物和模板特

2、異性取決于引物和模板DNADNA結(jié)合特異性結(jié)合特異性。 體外體外( (試管中試管中) )擴(kuò)增特異擴(kuò)增特異DNADNA片段片段短時(shí)間內(nèi)即可將所需目的短時(shí)間內(nèi)即可將所需目的DNADNA片段擴(kuò)增至片段擴(kuò)增至100100萬倍以上萬倍以上PCRPCR技術(shù)技術(shù) 特點(diǎn)特點(diǎn) 敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、 重復(fù)性好、操作簡便、快速重復(fù)性好、操作簡便、快速 PCRPCR體系基本組成體系基本組成 模板模板DNADNA： （10102-52-5）拷貝拷貝 dNTPdNTP底物：底物：2020020200umol/Lumol/L 特異性引物：特異性引物： 0.10.5 0.10.5 umol

3、/Lumol/L DNADNA聚合酶：聚合酶：Klenow T4 Klenow T4 、 T7 T7聚合酶聚合酶 TaqDNA TaqDNA聚合酶聚合酶: :耐熱穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性、5-35-3聚合酶活性及聚合酶活性及3-53-5外切酶外切酶活性，可校正活性，可校正PCRPCR反應(yīng)中某些單核甘酸的錯(cuò)配。反應(yīng)中某些單核甘酸的錯(cuò)配。 含含MgMg2+2+的緩沖液：的緩沖液： Mg Mg2+ 2+ mmol/Lmmol/L，過量將增加非特異性條帶的產(chǎn)生。過量將增加非特異性條帶的產(chǎn)生。循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度30次擴(kuò)增100萬倍反應(yīng)分三步反應(yīng)分三步：1 變性變性 denaturationdena

4、turation： 加熱加熱90-9590-95，模板，模板DNADNA雙鏈解離形成單鏈雙鏈解離形成單鏈DNADNA；2 2 退火退火 anneallingannealling： 溫度突然降低溫度突然降低, ,引物與模板引物與模板DNADNA結(jié)合結(jié)合, , 40-60, 40-60,TmTm值值 4 4（G+CG+C）+2+2（A+TA+T） -5. -5. 3 3 延伸延伸 extensionextension： TaqDNA TaqDNA聚合酶以聚合酶以4 4dNTPdNTP為底物，在為底物，在MgMg2+ 2+ 存在存在 的條件的條件下，催化下，催化DNADNA合成。合成。 70-75

5、70-75時(shí)間時(shí)間-要擴(kuò)增片段長度決定要擴(kuò)增片段長度決定待擴(kuò)增片段：待擴(kuò)增片段：1000 bp引物引物 Tm 55DNA 模板變性模板變性: 94, 5分鐘分鐘;PCR 循環(huán)循環(huán) (30 次次):94, 30秒秒; 50, 45秒秒; 72, 1分鐘分鐘;最終延伸最終延伸: 72, 10分鐘分鐘PCR 反應(yīng)條件的設(shè)定反應(yīng)條件的設(shè)定 PCRPCR產(chǎn)物的檢測產(chǎn)物的檢測 瓊脂糖凝膠電泳；瓊脂糖凝膠電泳； 分子雜交；分子雜交； 限制性內(nèi)切酶酶切分析；限制性內(nèi)切酶酶切分析； 微孔板夾心雜交法；微孔板夾心雜交法； 直接測序直接測序PCR 產(chǎn)物的檢測產(chǎn)物的檢測- 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳PCR 產(chǎn)物產(chǎn)物

6、PCR 產(chǎn)物產(chǎn)物PCR 技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用1. 基礎(chǔ)研究基礎(chǔ)研究(1) 基因或基因或 cDNA 克?。簭幕驍?shù)據(jù)庫中獲得某一基因或克隆：從基因數(shù)據(jù)庫中獲得某一基因或 cDNA 的核的核 苷酸序列，用苷酸序列，用 PCR 方法擴(kuò)增并克隆該基因或方法擴(kuò)增并克隆該基因或 cDNA。(2) 基因表達(dá)：用基因表達(dá)：用 RT-PCR檢測某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。檢測某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。2. 醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)(1) 感染性疾病病原體的診斷：感染性疾病病原體的診斷：HIV、結(jié)核分枝桿菌、乙肝病毒等。結(jié)核分枝桿菌、乙肝病毒等。(2) 遺傳病相關(guān)基因的檢測：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病。遺傳病相關(guān)基因的檢測：鐮

7、刀型細(xì)胞貧血、血友病。(3) 惡性腫瘤的診斷惡性腫瘤的診斷3. 基因動(dòng)、植物的檢測基因動(dòng)、植物的檢測(1) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測：檢測某一基因的遺傳穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測：檢測某一基因的遺傳穩(wěn)定性。(2) 轉(zhuǎn)基因植物的檢測：玉米、大豆等。轉(zhuǎn)基因植物的檢測：玉米、大豆等。PCR新技術(shù) RT-PCRRT-PCR：用于用于RNARNA分析分析 梯度梯度PCRPCR：可用于找出最適合的退火溫度：可用于找出最適合的退火溫度 反向反向PCRPCR：可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析 不對(duì)稱不對(duì)稱PCRPCR：用于制備單鏈用于制備單鏈DNADNA 多重多重PCRPCR：加上二對(duì)以上引物，同時(shí)

8、擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段 降落降落PCRPCR：用于：用于PCRPCR條件的優(yōu)化，條件的優(yōu)化，避免非特異性序列的擴(kuò)增避免非特異性序列的擴(kuò)增 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量 PCR (Real Time Quantitative PCR, qRT-PCR) 巢式巢式PCR：使用兩對(duì)（而非一對(duì)）使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的引物擴(kuò)增完整的片段片段反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR) RT-PCR 將以將以 RNA 為模板的為模板的 cDNA 合成同合成同 PCR 結(jié)合在一起，提供了一種結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。

9、53AAAAA535335533553RT-PCR 原理原理mRNA1st cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、下游引物、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶、聚合酶、上游及下游引物、上游及下游引物、dNTPs5533特異特異 PCR 產(chǎn)物產(chǎn)物5533經(jīng)經(jīng) 30 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生 230 個(gè)分子拷貝個(gè)分子拷貝5533一步法一步法 RT-PCR RT 反應(yīng)與反應(yīng)與 PCR 反應(yīng)在同反應(yīng)在同一個(gè)試管中進(jìn)行。一個(gè)試管中進(jìn)行。兩步法兩步法 RT-PCR RT 反應(yīng)與反應(yīng)與 PCR 反應(yīng)在不反應(yīng)在不同的試管中進(jìn)行。同的試管中進(jìn)行。下游引物下游引物 特異性引物特異性引物 Oligo(dT) 降落PCR

10、（ Touchdown PCRTouchdown PCR ）用來避免非特異性序列的擴(kuò)增用來避免非特異性序列的擴(kuò)增PCR中引物的黏合溫度中引物的黏合溫度(annealing temperature)決定了黏合的決定了黏合的特異性，溫度越高特異性越強(qiáng)，但過高則不能實(shí)現(xiàn)引物和模板特異性，溫度越高特異性越強(qiáng)，但過高則不能實(shí)現(xiàn)引物和模板的結(jié)合，而過低會(huì)產(chǎn)生大量非特異性產(chǎn)物。因此進(jìn)行的結(jié)合，而過低會(huì)產(chǎn)生大量非特異性產(chǎn)物。因此進(jìn)行PCR時(shí)時(shí)需要尋找合適的黏合溫度。需要尋找合適的黏合溫度。 降落降落PCR開始先設(shè)定一個(gè)比較高的黏合溫度，每個(gè)循環(huán)黏開始先設(shè)定一個(gè)比較高的黏合溫度，每個(gè)循環(huán)黏合溫度下降合溫度下降1

11、，到一個(gè)較低溫度以后每個(gè)循環(huán)的黏合溫度保，到一個(gè)較低溫度以后每個(gè)循環(huán)的黏合溫度保持不變直到結(jié)束。在剛下降到特異性結(jié)合可以進(jìn)行的最高溫度持不變直到結(jié)束。在剛下降到特異性結(jié)合可以進(jìn)行的最高溫度時(shí)，可以達(dá)到最高的特異性。這樣在起初的幾個(gè)循環(huán)中，特異時(shí)，可以達(dá)到最高的特異性。這樣在起初的幾個(gè)循環(huán)中，特異性擴(kuò)增序列可以相對(duì)非特異性序列多擴(kuò)增若干倍，從而減輕非性擴(kuò)增序列可以相對(duì)非特異性序列多擴(kuò)增若干倍，從而減輕非特異性擴(kuò)增對(duì)結(jié)果的干擾。這種方法可用于省去多次試驗(yàn)最佳特異性擴(kuò)增對(duì)結(jié)果的干擾。這種方法可用于省去多次試驗(yàn)最佳黏合溫度的工作。黏合溫度的工作。反向PCR (Inverse PCR, IPCR)擴(kuò)增引

12、物相反方向擴(kuò)增引物相反方向DNADNA 序列的技術(shù)序列的技術(shù)。用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)。用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCRPCR擴(kuò)增的是已知序擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間列的兩引物之間DNADNA片段片段. .實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)該段的限制性內(nèi)切酶對(duì)該段DNADNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向的引物進(jìn)行性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCRPCR，其，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對(duì)未知序進(jìn)

13、行分析研擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對(duì)未知序進(jìn)行分析研究究. . 利用反向利用反向PCRPCR可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接已可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接已知知DNADNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNAcDNA進(jìn)行分子進(jìn)行分子克隆，建立全長的克隆，建立全長的DNADNA探針。探針。1. 1. 用一種在靶序列上沒有切用一種在靶序列上沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶 消化大分消化大分子量的子量的DNADNA2. 2. 產(chǎn)生的大小不同的線性產(chǎn)生的大小不同的線性DNADNA片段群體，其中具靶片段群體，其中具靶DNADNA區(qū)段

14、的區(qū)段的DNADNA分子長度不超過分子長度不超過2-3Kb,2-3Kb,經(jīng)連經(jīng)連接后環(huán)化成環(huán)狀分子接后環(huán)化成環(huán)狀分子3. 3. 按靶序列設(shè)計(jì)的一對(duì)向外引物按靶序列設(shè)計(jì)的一對(duì)向外引物同靶序列同靶序列5 5，-端互補(bǔ)序列退火結(jié)端互補(bǔ)序列退火結(jié)合，其延伸方向如圖中箭頭所指合，其延伸方向如圖中箭頭所指4. 4. 經(jīng)經(jīng)PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)生的主要是線性擴(kuò)增產(chǎn)生的主要是線性雙鏈雙鏈DNADNA分子，它是由左側(cè)的序分子，它是由左側(cè)的序列和右側(cè)序列首位連接而成，其列和右側(cè)序列首位連接而成，其接點(diǎn)就是限制酶的識(shí)別位點(diǎn)接點(diǎn)就是限制酶的識(shí)別位點(diǎn)不對(duì)稱不對(duì)稱PCRPCR（ asymmetric PCRasymmetri

15、c PCR ）：）：用于制備用于制備單鏈單鏈DNADNAl PCRPCR擴(kuò)增所用的兩條引物中，濃度受限制的只及高擴(kuò)增所用的兩條引物中，濃度受限制的只及高濃度的濃度的1%1%（或（或2%2%）。）。 經(jīng)過經(jīng)過PCRPCR循環(huán)直到限制引物耗循環(huán)直到限制引物耗盡之前，擴(kuò)增的引物是雙鏈的盡之前，擴(kuò)增的引物是雙鏈的DNADNA序列。而后，反應(yīng)序列。而后，反應(yīng)混合物中的另一種高濃度的引物，則利用限制引物合混合物中的另一種高濃度的引物，則利用限制引物合成的成的DNADNA鏈做模板，繼續(xù)引導(dǎo)鏈做模板，繼續(xù)引導(dǎo)DNADNA合成。合成。l這樣模板鏈繼續(xù)再循環(huán)，由高濃度的引這樣模板鏈繼續(xù)再循環(huán)，由高濃度的引物合成的

16、物合成的DNADNA要比限制引物多得多，而且要比限制引物多得多，而且仍保持單鏈狀態(tài)。仍保持單鏈狀態(tài)。 多重多重PCRl 一般一般PCR僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定.多重多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物，又稱多重引物PCR或復(fù)合或復(fù)合PCR，它是在同一，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一

17、般PCR相同。相同。l 多重多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒的主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。梯度PCR（Gradient PCR） 是指我們?cè)诿CR條件的時(shí)候采取的一種手段，因?yàn)椴荒艽_認(rèn)引物的最佳退火溫度，會(huì)采用梯度PCR，同時(shí)在不改變其他PCR條件的情況下，對(duì)目的基因使用不同的退火溫度，最終找到一個(gè)適合目的基因的退火溫度。在這里，每個(gè)PCR反應(yīng)管只有一個(gè)退火溫度。 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR技術(shù)技術(shù) 實(shí)現(xiàn)了實(shí)現(xiàn)了PCRPCR從定性到定量的飛躍從定性到定量的飛躍實(shí)時(shí)熒光

18、定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理 指在指在PCRPCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCRPCR進(jìn)程，進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。分析的方法。 特異性更強(qiáng)、特異性更強(qiáng)、 有效解決有效解決PCRPCR污染、污染、 自動(dòng)化程度高、自動(dòng)化程度高、 實(shí)時(shí)監(jiān)測實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)過程反應(yīng)過程Ct Ct 值的定義值的定義 在熒光定量在熒光定量PCRPCR技術(shù)中重要概念技術(shù)中重要概念 CtCt值值 C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold，CtCt值：每個(gè)反應(yīng)值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷循環(huán)數(shù)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷循環(huán)數(shù)CtCt值與起始模板的關(guān)系值與起始模板的關(guān)系 每個(gè)模板每個(gè)模板CtCt值與該模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷值與該模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，貝數(shù)越多，CtCt值越小。利用已知起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲值越