分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)指南

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上生命科學(xué)系2011-2012學(xué)年度分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（0801班）2011-2012學(xué)年度分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆沾竽c桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備技術(shù)二、 實(shí)驗(yàn)原理：感受態(tài)細(xì)菌處在容易吸收外源DNA的狀態(tài)。我們選用經(jīng)過基因改造的生物工程菌株大腸桿菌top10菌株為材料，在0、CaCl2低滲溶液處理，細(xì)胞壁破壞，細(xì)胞成為球型原生質(zhì)體。因而具備了吸收外源DNA的能力。三、 儀器：1.超凈工作臺(tái) 2.低溫離心機(jī) 3.恒溫?fù)u床 4.紫外分光光度儀四、 材料與試劑：1.大腸桿菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、

2、0.2mol/L CaCl2溶液50mL3.LB液體及固體培養(yǎng)基4.50%甘油500mL（滅菌）五、 實(shí)驗(yàn)操作步驟：1. 從大腸桿菌top10菌株平板上挑取一個(gè)單菌落，接種于3mL LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩（200r/min）培養(yǎng)過夜。2. 次日早上取0.4mL菌液轉(zhuǎn)接到40mL LB液體培養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)23h.(A600應(yīng)在0.40.5之間)3. 將菌液置冰浴中10min。（同時(shí)將0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油預(yù)冷）4. 取菌液1.5mL，4離心2min（3500r/min）.棄上清，再加菌液1.5mL，4再離心一次，棄上清，倒置以便使培養(yǎng)液流盡。5. 用冰冷的0.1m

3、ol/L CaCl2溶液1mL懸浮細(xì)胞（輕輕渦旋使懸浮），立即置冰浴保溫30min。6. 4離心2min（3500r/min），棄上清，加入100µL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、100µL50%甘油輕輕手搖懸浮，置冰浴上，接著進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化，或-70保存。實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆召|(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化技術(shù)二、 實(shí)驗(yàn)原理: DNA能夠黏附于感受態(tài)細(xì)胞的表面，經(jīng)過42短時(shí)間的熱激處理可以促進(jìn)DNA的吸收。轉(zhuǎn)化菌在非選擇培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間后，質(zhì)粒DNA所攜帶的抗性基因（Ampr）得到表達(dá)，然后再在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)化的菌株得以正常生長。三、 儀

4、器：1.超凈工作臺(tái) 2. 恒溫?fù)u床 3.恒溫水浴 四、 1.材料與試劑：LB培養(yǎng)基（液體、固體平板）2.感受態(tài)3.無菌水五、實(shí)驗(yàn)操作步驟：1.200µL新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒DNA2µL（約550ng）混勻，冰上放置30min。 同時(shí)做一對(duì)照試驗(yàn)：200µL感受態(tài)+2µL無菌水，其他操作同上述實(shí)驗(yàn)完全一樣。2.將上述管放到42水浴中，精確計(jì)時(shí)90秒。3.冰浴2min。4.復(fù)蘇：管中加入LB液體培養(yǎng)基800µL，37培養(yǎng)1h（50r/min）5.涂平板：取200µL復(fù)蘇細(xì)胞，涂布于含AMP的LB培養(yǎng)基上。待大約30min，讓菌液

5、被培養(yǎng)基吸收。6.菌落培養(yǎng)：倒置平皿，37培養(yǎng)1216h，轉(zhuǎn)化子即可長成菌落。照相。實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的技術(shù)和方法二、實(shí)驗(yàn)原理   堿裂解法提取質(zhì)粒利用的是環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線狀的染色體DNA片段在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線狀的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開變性，在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此依然相互盤繞而緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的醋酸鉀高鹽緩沖液使pH降低至中性后，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈迅速而準(zhǔn)確地復(fù)性，而線狀的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈

6、彼此已完全分開，不能迅速而準(zhǔn)確地復(fù)性，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來，而質(zhì)粒DNA卻留在上清液中。三、儀器、材料與試劑  (一)儀器  1恒溫培養(yǎng)箱  2恒溫?fù)u床  3小型高速離心機(jī)  4漩渦混合器  (二)材料與試劑 材料：帶有pGEM-T質(zhì)粒的大腸桿菌 試劑：1. Solution I 50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl（PH8.0）,10mmol

7、/L EDTA(PH8.0)2.  Solution II（0.4mol/L NaOH+2%SDS用前等體積匯合）3.  Solution III (5mol/L乙酸鉀60mL,冰乙酸11.5 mL,DH2O28.5mL)4.  TE緩沖液 (PH8.0)10mmol/L Tris.HCl(PH8.0),1 mmol/L EDTA(PH8.0)5. 0.5mo1L (EDTA)6. 氯仿：異戊醇（24：1）7. Tris飽和酚：氯仿：異戊醇（25：24:1體積比）8.  RTE (含20µg/mLRNA酶A的TE緩

8、沖液)  四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 將3mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入含pGEM-T質(zhì)粒的大腸桿菌，37振蕩培養(yǎng)過夜； 2.將菌液加入1.5mL離心管中，4000r/min,5min,棄上清；重復(fù)一次，增加菌的收集量；3.在離心管中加入100µL溶液I,渦旋混勻，室溫放置10min；4.加入200µL溶液II，輕輕混勻（顛倒510次），待逐漸變清亮后，冰浴2min（操作要輕柔，裂解時(shí)間不要超過5min）；5.加入150µL溶液III（冰上預(yù)冷的）加蓋，輕輕顛倒混勻數(shù)次。在冰上靜置15min讓質(zhì)粒DNA復(fù)性；6.12000r/m

9、in離心10min，將上清移入另一個(gè)1.5mL的離心管中；7.向上清中加入等體積（約450µL）的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）（去蛋白質(zhì)和脂肪），手搖混勻，12000r/min離心5min，將上清移到另一個(gè)新的1.5mL離心管中（操作要平穩(wěn)，不要將下邊的有機(jī)相帶上來）；8.向上清中加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）（去微量酚和脂肪），輕輕顛倒混勻，12000r/min離心5min，將上清移入另一個(gè)1.5mL的離心管中（不要將下邊的有機(jī)相帶上來）；9.向上清中加入2倍體積的無水乙醇（冰冷的），混勻后，室溫放置10min。12000r/min離心10min，棄上清；10.加入1m

10、L冰冷的70%乙醇，吸打懸浮，12000r/min離心2min，再重復(fù)一次。將離心管中的乙醇倒凈，倒扣在濾紙上吸干，再置超凈臺(tái)上15min，讓酒精揮發(fā)干凈；11.加20µLRTE(含有RnaseA20µg/mL的TE緩沖液)，使質(zhì)粒溶解，-20保存。實(shí)驗(yàn)四 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆窄傊悄z電泳檢測(cè)DNA的技術(shù)與方法二、實(shí)驗(yàn)原理：DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA 分子在高于等電點(diǎn)的pH 溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙漣DNA 幾乎具有等量凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極

11、方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA 分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA 片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子（以質(zhì)粒為例，一般情況下遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)）。三、儀器、材料與試劑  (一)儀器  1.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 2. 凝膠成像系統(tǒng)  (二)材料與試劑材料：1. pGEM-T質(zhì)粒DNA（含PODa基因3片段）（是實(shí)驗(yàn)三的回收產(chǎn)物

12、）2. 瓊脂糖3. （溴化乙錠）試劑：1. 5×TBE2. 6×loading-buffer(加樣緩沖液)四、 實(shí)驗(yàn)步驟1. 制備1%瓊脂糖凝膠：稱取0.2g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入20mL0.5×TBE緩沖液，置微波爐中加熱至完全融化，取出搖勻，室溫下降溫至60左右，開始制膠板；2.膠版制備：將有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗凈晾干，放置一水平制膠器中，并放好樣品梳子，待凝膠放涼至60左右時(shí)，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽（注意，不要形成氣泡）即成膠板，室溫下凝固約30min，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放入電泳槽內(nèi)（注意方向：加樣孔遠(yuǎn)離電泳槽的正極端）。3.加電泳液：將0.5×TBE緩沖液

13、加入電泳槽內(nèi)，剛好淹沒凝膠平面，輕輕拔出梳子。4.加樣：取DNA 2µL+DDH2O3µL+6×loading-buffer1µL，混勻后用移液槍加入加樣孔。記錄加樣的順序。通常第一泳道加樣為DNA Mark。5.電泳：電壓一般不超過5V/cm，注意電極的方向不能錯(cuò)了，DNA向正極移動(dòng)。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳，切斷電源。6. 染色、照相：戴上手套，將凝膠移入盛有0.5µg/mL EB的染色盤中，染色5min，在移入蒸餾水中漂洗510min，洗掉多余的燃料，然后轉(zhuǎn)入凝膠成像系統(tǒng)照相。操作中謹(jǐn)防EB污染。五、 試驗(yàn)結(jié)果注意觀察D

14、NA的分子量大小，估計(jì)DNA的含量，推測(cè)出樣品DNA的濃度，觀察質(zhì)粒的3種構(gòu)型，分析質(zhì)粒DNA的質(zhì)量，判斷可否作為下一步基因重組的材料？實(shí)驗(yàn)五 PCR基因擴(kuò)增一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握PCR反應(yīng)的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA?？捎糜诨蚍蛛x，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控等許多方面。三、儀器、材料與試劑：1.PCR儀；

15、凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)；Taq酶及其Buffer；PCR管2. PCR反應(yīng)成分：.模板DNA：實(shí)驗(yàn)三提取的質(zhì)粒DNA（含Poda3） 2ul (濃度高的稀釋5倍后).引物: poda3P1 (10umol) 1ul.引物： poda3P2 (10umol) 1ul.dNTP： （each 2.5mmol） 4ul .反應(yīng)緩沖液： 10×plus Buffer 5ul.DNA聚合酶： Taq plus Polymerase 2ul.DD H2O 35ul 四、PCR反應(yīng)基本步驟： .94預(yù)變性 5min；.94變性 40S；.61退火40S；.72延伸 60S; .重復(fù)步35次；72延

16、伸5min；4保存4min；end。五、電泳檢測(cè)PCR結(jié)果取PCR產(chǎn)物5ul + 6×loading buffer 1ul于1瓊脂糖凝膠中電泳（恒壓120V），產(chǎn)物預(yù)計(jì)為421bp大小。其余產(chǎn)物純化回收，-20保存，準(zhǔn)備下一個(gè)實(shí)驗(yàn)DNA重組。實(shí)驗(yàn)六 DNA重組一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握DNA重組的實(shí)驗(yàn)技術(shù)二、原理：DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。常用的DNA連接酶是T

17、4噬菌體DNA連接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子連在一起，而且能使平末端的雙鏈DNA分子連接起來，但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。 本實(shí)驗(yàn)利用了Taq酶的PCR產(chǎn)物DNA末端自動(dòng)加A的特點(diǎn)，與pGMT載體末端的T正好互補(bǔ)，再在T4 DNA連接酶作用下相連接，從而實(shí)現(xiàn)了快速鏈接重組。連接反應(yīng)的溫度在37時(shí)有利于連接酶的活性，但是在這樣的溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。一般的連接條件是在12-16，反應(yīng)12-16小時(shí)(過夜)，這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到粘性末端短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。本實(shí)

18、驗(yàn)采用4條件下鏈接過夜。載體用的是pGM-T vector和T4鏈接酶，外援DNA為PODa3的PCR產(chǎn)物。三、實(shí)驗(yàn)操作：1.純化目的DNA 取PODa3 PCR的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，加入1/10體積的3mol/L NaAc，混勻后加入2.5倍體積的冰冷無水乙醇,混勻,-20放置20分鐘左右,DNA形成沉淀。15000rpm離心10分鐘, 去上清，沉淀用預(yù)冷的70%乙醇500µL漂洗，12000rpm離心5分鐘收回，徹底傾倒乙醇后，45烘箱干燥約15min或超凈臺(tái)無菌風(fēng)吹干15min后，加入20µL DD H2O使其溶解。準(zhǔn)備連接用。2.鏈接重組反應(yīng)液：目的PCR片

19、段 （PODa3的） 1ul pGM-T vector 1ul 10×T4 Ligation Buffer 1ul T4 DNA Ligase 1ul DD H2O 6ul至冰箱中4條件下鏈接過夜。準(zhǔn)備下一步轉(zhuǎn)化與藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)七 藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握重組子（陽性克隆）的篩選技術(shù)二、原理：藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，

20、但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為-互補(bǔ)。由-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的大腸

21、桿菌工程菌平板37溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。三、實(shí)驗(yàn)操作：1.實(shí)驗(yàn)材料：top10感受態(tài)；目的DNA與pGM-T 載體的鏈接產(chǎn)物；LB固體平板培養(yǎng)基（含AMP100ug/ml）；IPTG(0.1M); Xgal（50mg/Ml）2.操作步驟轉(zhuǎn)化平板的制備：向含有AMP的固體培養(yǎng)基平板表面加入40µL IPTG(0.1M)+16µL X-gal（50mg/Ml）,使用無菌的玻璃棒均勻涂開。避光37放置13小時(shí)，使溶解X-gal的二甲基甲酰胺盡量揮發(fā)干凈。轉(zhuǎn)化：a.取50100µL感受態(tài)細(xì)胞，加入5µL鏈接產(chǎn)物（加入量不要超

22、過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10） ,輕輕混勻，冰浴30min；b.將上述離心管置42水浴中，精確90秒，取出后立即冰浴3min，期間不要搖動(dòng)離心管；c.向離心管中加入500µLLB培養(yǎng)基，150rpm、37振蕩培養(yǎng)60min，使質(zhì)粒上相關(guān)抗性基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇；3）選擇價(jià)值。選擇價(jià)值（OV）又稱期權(quán)價(jià)值。我們?cè)诶铆h(huán)境資源的時(shí)候，并不希望它的功能很快消耗殆盡，也許會(huì)設(shè)想未來該資源的使用價(jià)值會(huì)更大。d.在超凈工作臺(tái)上，將離心管中的菌液混勻，取出200µL菌液加到LB瓊脂培養(yǎng)基（含Amp）上，用無菌玻璃棒將其均勻推開，待平板表面干燥后，倒置平板，37培養(yǎng)1216小時(shí)。一、環(huán)境影響

23、評(píng)價(jià)的發(fā)展與管理體系、相關(guān)法律法規(guī)體系和技術(shù)導(dǎo)則的應(yīng)用3.檢測(cè)：常規(guī)檢測(cè)：未轉(zhuǎn)化的菌將不能在培養(yǎng)基（含Amp）上生長；空載體的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌斑；重組子的轉(zhuǎn)化子為白色菌斑?？蛇M(jìn)一步挑取白色菌斑，LB液體培養(yǎng)基（含Amp）37振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切鑒定插入的片段是否正確（由下一個(gè)實(shí)驗(yàn)- DNA酶切技術(shù)來完成?；蛞再|(zhì)粒為模板PCR檢測(cè)亦可。實(shí)驗(yàn)八 DNA酶切技術(shù)為了有別于傳統(tǒng)的忽視環(huán)境價(jià)值的理論和方法，環(huán)境經(jīng)濟(jì)學(xué)家把環(huán)境的價(jià)值稱為總經(jīng)濟(jì)價(jià)值（TEV），包括環(huán)境的使用價(jià)值和非使用價(jià)值兩個(gè)部分。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誅NA的酶切技術(shù)，了解它在DNA重組中的應(yīng)用。二、 DNA酶切實(shí)驗(yàn)原理：限制性內(nèi)切酶能

24、特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:類和類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)類限制酶識(shí)別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列(如EcoR識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5'- GAATTC-3'),有少數(shù)酶識(shí)別更長的序列或簡并序列。類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序