題目食品致病微生物最新檢測方法介紹

1、題目：食品致病微生物最新檢測方法介紹組員：洪碩蓮、黃建元、楊至平、閻瑩潔 食品及其相關加工品容易受到食品病原細菌的污染，而造成食物中毒，而快速鑑別有害細菌的方法，可用以加強檢驗的工作及避免食品中毒事件發(fā)生。食品中主要之污染細菌種類，包括有 Citrobacter spp. ,Clostridium spp., Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, E. coli（含E. coli O157:H7及其他病原性大腸桿菌），Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholera,Staphylococcus aureus, Salm

2、onella spp.包括Salm. Typhimurium, Salm. Enteritidis, Salm. Typhi, Salm. Choleraesuis, Pseudomonas spp., Campylobacter spp., Clostridium spp., Shigella spp.等；傳統(tǒng)檢測方法包括有預培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)、生化型鑑定及血清型鑑定等，常需時數天，因此快速檢測方法相當重要。 由食品污染所引起的疾病已在許多發(fā)展中國家受到注意，以臺灣地區(qū)為例，根據行政院衛(wèi)生署民國70年至93年，對臺灣地區(qū)食品中毒事件案例之統(tǒng)計結果顯示，排行前六名依序為 腸炎弧菌(Vibr

3、io parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、仙人掌桿菌 (Bacillus cereus)、沙門氏菌(Salmomella spp)、病原性大腸桿菌(pathogenic E. coli)以及肉毒桿菌(Clostridium botulinum)。於歐美國家，由沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌所引起之食物中毒案件急速增加，而在日本，由沙門氏菌、腸炎弧菌及仙人掌桿菌所引起之食物中毒案件亦受到相當的重視。因此，為了有效的快速檢測可能存在的食品病原菌，開發(fā)食品病原菌快速檢驗法對目前從事食品檢驗研究者十分重要。更由於食品中毒樣品或檢體中，其中可能包

4、含至少一種以上之病原菌，因此如何找到一種可以同時、快速、方便的方法來進行多種不同病原菌之鑑定或檢測相當的重要。 近年來，利用DNA 探針及其相關技術所發(fā)展的微生物快速檢測方法，如P C R方法；P C R fingerprinting、multiplex-PCR、DNA定序法、PCR-RFLP (Polymerase chain reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism)、RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA)、gene-specific probe hybridization、ribot

5、yping 等方法已陸續(xù)用於病原菌的檢測之用。然而，這些方法所面臨的重要問題是如何克服面臨大量樣品時的操作方便性，以及同時能否鑑別不同種屬的菌株等問題。以PCR方法為例，目前所發(fā)展的PCR技術的缺點是對於不同的目標基因或目標菌必須要用不同的引子組來進行檢測。在目標菌種不明確時，進行較為因難，例如，如何選擇適當的引子組；即是一個問題。因此必須發(fā)展更新更靈敏的檢測方法，供作快速篩檢多種目標菌之用。利用高密度的基因晶片技術為解決此一問題最好的方法，微生物檢測用的生物晶片，即利用晶片上每一菌種具有專一性的DNA片段，作為探針，亦作為不同菌種鑑定及檢測之用。而DNA序列的差異可分為不同等級，利用不同等級

6、的差異可鑑定出分屬不同科、屬、種的菌株。每一種細菌在晶片上具有不同的DNA雜交圖譜，藉由不同的雜交圖譜，來鑑定不同的病原菌，因此只要利用同一張晶片便可以鑑定不同細菌的屬、種。生物晶片相較於傳統(tǒng)分子生化分析方法的主要特點是能夠同時快速、大量的處理樣品，縮短在傳統(tǒng)實驗室的檢驗或試驗時間，而且它的可信度及精確性高、分析速度快，同時又可獲得大量整體性的實驗數據。生物晶片能在短時間內完成多個不同病原菌或不同基因的測試，且對食品病原菌及疾病的診斷相當有效。生物晶片有幾種型式，例如寡核N酸晶片、基因微陣列、蛋白質晶片、抗體晶片與微流體晶片等，這些不同的晶片各有其應用的相關研究，而其原理也大致相同。食品病原性

7、微生物檢測用晶片上探針的設計常利用23S、16S與ITS的DNA片段上序列之差異，這些片段的末端與23S 的前端具有保留區(qū)域，利用此二個保留區(qū)可來增殖ITS片段，不同的食品病原菌其ITS序列有差異，因而可利用此一片段作為設計不同屬(genus)或種(species)的細菌檢測用DNA晶片的探針。將這些探針以寡核N酸探針的形式放置在所設計的微陣列上，並依據親源關係的遠近做為晶片安排上的設計方式。而不同的種類的病原菌株，除了專一性的探針之外，也可根據其部分專一，但非絕對專一性之探針，在不同的參考點之雜交訊號，來提供作為特定菌株之確認。另一方面，亦可採用以隨機引子放大(random primeram

8、plification)之方式來擴增目標菌株之DNA，再與晶片上不同目標基因設計之不同菌株之特異性探針雜交，取得雜交訊號，同時供多種不同病原菌之檢測。而在晶片設計上所會遇到的困難，包括如何設計為數眾多的專一性探針，如何使晶片上各不同探針的反應黏合溫度保持一定，也要有標準的方法；此外，所採用的雜交呈色方法包括雜訊、雜交敏感度等，也必需要考量。 生物晶片乃是將大量的各種探針排列在一小片固相基質(solid phase)上，使研究者能利用生物晶片雜交後的圖譜以及訊號的強弱，使研究者能以巨觀的方式提出對策。因此這種利用Microarray技術將成千上萬的生物訊息密碼，在一片固相基質的，就如同可儲存大量

9、資料的電腦晶片，就被稱作生物晶片(Microarray or Biochip)。 生物晶片技術是將探針（通常是DNA或complementary DNA(cDNA)），以高密度點陣技術將DNA或cDNA固定排列在經除孔處理過的玻璃(non-porous glass slide)、帶正電的尼龍紙片(nylon membrane)、或表面經過特殊處理之塑膠片 (plastic membrane)及其他固態(tài)基質的表面上，而受測的樣本則是標的物與其互補的探針做雜交。樣本中標的核酸，會與cDNA 微點陣上含有互補的核酸序列的探針的點進行雜交；再經過一連串的清洗將沒有雜交的樣本核酸去掉，然後進行數據的判讀

10、，如此就可以記錄下有雜交反應點的位置，也只需要一次的實驗cDNA微點陣技術就能夠將成千上萬的基因表現的樣式(gene expression patterns)記錄下來。一、微生物基因體與生物晶片 微生物與人類的生活關係密切，生活的食物、水、土壤及環(huán)境中，微生物無所不在。甚至在極端環(huán)境中，亦有微生物的蹤跡。目前在微生物的基因體研究中，已完成定序工作的微生物共有235 株（bacteria complete chromosome, 226 株及fungi complete genome, 9 株）（至2005 年6 月14 日止）。其中不乏環(huán)境微生物，食品用微生物及人類病原菌。在病原菌的研究中，例

11、如會引起胃炎之致病菌(Helicobater pyroli) (Accession No. NC_000915 及NC_000921)的基因體已完成定序，並進行基因的註解。而在原生保健性菌種中，亦有已完成的基因體定序工作的乳酸菌，包括Lactobacillus acidophilus (Accession No.NC_006814)、Lactobacillus plantarum(Accession No. NC_004567)、Streptococcus thermophilus (Accession No. NC_006449 及NC_006448)。酵母菌 (Saccharomyces

12、cerevisiae)的基因體研究極早，其完整的序列已收錄在公開的資料庫中，目前已有以酵母菌作為DNA生物晶片，其目的不在疾病偵測，而是在醫(yī)藥生技領域之應用。 重組蛋白藥物許多是利用基因工程技術，藉由酵母菌的發(fā)酵生產。該酵母菌的DNA晶片用於研究基因表現的差異，以有效的控制發(fā)酵製程，縮短發(fā)酵時間，尋找適當的培養(yǎng)條件，減少發(fā)酵成本。在酒類發(fā)酵的製程中，酵母菌代謝的研究可決定風味的變化，監(jiān)測及控制酒精發(fā)酵的能力。二、生物晶片主要核心技術 生物晶片研究在國際上已有相當成果，如基因晶片 (Gene chip, DNA chip or Microarray)、蛋白質晶片 (protein chip)、微

13、流體晶片 (Microfluidics) 及晶片實驗室(Lab-on-a-chip)等之設計與應用?；蚓繢NA樣品製備的方式不同主要可分為二種。第一種是Affymetrix 公司研發(fā)出的光學蝕刻法 (photolithography) 與化學合成法相結合的光引導原位合成法 (light-directed synthesis)。第二種是美國Stanford 大學所使用的接觸式點樣法，係利用生物晶片點陣儀將預先合成好的DNA或PCR products，快速及高密度的固定到載體上，這種高密度整齊排列的晶片，稱為生物晶片技術(Microarray technology)。基因微矩陣技術是將探針，

14、通常是將數千或數萬個DNA或cDNA，以高密度點陣固定在經表面化學塗布處理過的玻璃等固態(tài)載體表面上，而受測的樣品則是cDNA 標的核酸，再將玻璃片與樣品進行雜交試驗。 由於DNA為雙股螺旋結構具有互補的專一特性，樣本中的標的核酸，會雜交固定在cDNA 微點陣玻璃上含有互補的核酸序列的探針的點；再經過清洗將沒有雜交的樣本核酸去掉，就可以記錄下有雜交反應的點的位置，將成千上萬的基因表現的樣式記錄下來。由於生物晶片上含有上千至萬的基因樣點，並可偵測到極微細的細胞內變化，甚至一個細胞內少數幾個mRNA的改變，使得研究者能透過晶片上的數據得整體性訊息。對於極少量或不易取得的樣品的研究，生物晶片是唯一可提

15、供大量資料的途徑。三、蛋白質晶片 (Protein Chip) 由於基因晶片技術漸趨成熟，基因功能研究將可迅速展開，而我們知道生物體內的基因表現與蛋白質表現並不是完全相同。因此，蛋白質組 (Proteomics)的研究將成為生物晶片的下一步重要課題。但如同基因晶片一樣，蛋白質晶片一樣能提供快速且整體性的分析，應用於protein-protein interactions, protein-small molecular interactions及 protein-substrate reactions 。若蛋白質晶片能開發(fā)成功，進而取代傳統(tǒng)的臨床檢驗方法，將會為生物技術產業(yè)帶來的數百億商機。理

16、論上，蛋白質晶片的製備方法與基因晶片方法相似，差異處只是將作用對象改為蛋白質，即生物晶片上的樣品和實驗樣品皆為蛋白質。但在實際的應用上卻遇到相當困難的問題：1.蛋白質取得不易、2.蛋白質容易失活、3.載體製作不易、4.不容易維持晶片上蛋白質的生物活性、5.晶片與受測檢體間的最佳反應條件不一定相同。蛋白質若不謹慎處理，容易產生斷裂或變性，而由於每種蛋白質有其不同的物理、化學性質，有些蛋白質易黏附於載體，某些則不容易，因此在載體的選擇與載體表面處理上將有相當多的問題，另外蛋白質的一級、二級、三級結構(protein's conformation)會影響蛋白質的功能，且蛋白質對所處環(huán)境要求敏

17、感，它們有可能在不同相(phase)之間發(fā)生變化。因此蛋白質晶片仍然有許多問題需要解決。四、晶片實驗室(Lab-on-a-chip) 生物晶片發(fā)展的最終目標是要將樣品製備，化學反應到結果檢測的整個分析過程集成化在一個晶片上，以獲得所謂的微型全分析系統(tǒng) (Micro total analytical system) 或新縮微晶片實驗室(Lab-on-a-Chip)。Lab-on-a-Chip係利用晶片處理微量液體，由l甚至是nl體積於微流體晶片中，透過微機電的技術，以機械式或非機械式之幫浦，使生物分子在微管道內混合、分離、培養(yǎng)、加熱、PCR等實驗室所用的反應。其目的在於將實驗儀器微小化，製作晶片

18、實驗室(Lab-on-a-chip)。譬如：DNA定序儀、基因擴大反應儀、自動免疫測定儀、毛細管電泳儀、高壓液相層析儀、手提環(huán)境監(jiān)測儀器、生物武器檢測儀等，均是體積龐大的機器設備。未來利用微流體晶片來加以微型化，整合若干微管道及微反應器於一塊晶片上，把這些大機器的功能縮小到像郵票一樣的大小，以完成各種樣品的處理、反應或分析檢測，功能類似一個實驗室之縮影。 微流體晶片不僅可以使設備縮小攜帶方便，更能節(jié)省實驗試劑和樣本，增加實驗的效率。目前，已有幾種Lab-on-a-Chip 的產品成功上市，如Agilent Technology 公司研發(fā)出的2100 Bioanalyzer、 5100 Auto

19、mated Lab-on-a-Chip (ALP)、HPLC-Chip 等可用於分析DNA、RNA、蛋白質或已標誌化的DNA 。然而，上述之生物晶片主要係對少數病原菌的genus 加以區(qū)分鑑定，若目標基因不以16S rRNA 基因為主，則可擴大可檢測的微生物的種類，檢測層次可到達不同species之區(qū)分，基本上需以不同病原菌特有之基因，包括特定蛋白質酵素、毒素、纖毛等基因探針之晶片，分別設計晶片上的探針，或能解決多種bacteria species區(qū)分鑑定之問題。於此，目前亦已發(fā)展出針對不同食品病原菌之特異性的DNA探針，佈放於玻璃、塑膠、nitrocellulose paper、微流體生物晶

20、片等晶片材質上，並應用於螢光標誌DNA之雜交，依此原理將可設計出的生物晶片可用於食品、農畜水產品微生物檢測工作。以random primer、whole genome amplification、PCR等方法擴增並標幟目標菌之DNA，進行雜交工作，此法除需依賴高感度的Cy3或Cy5螢光源外，另需昂貴的螢光掃瞄判讀儀器設備，成為目前食品生物晶片商業(yè)化之技術的瓶頸。另一方面，如可改以成本較為低廉的呈色檢測方法，將可將生物晶片普遍化，但因目前其檢測靈敏度仍不足，實驗部分尚待進一步研發(fā)。另一方面，有關微生物抗生素耐性基因檢測用的生物晶片，目前亦頗受重視，此類晶片所得之檢測結果與抗生素耐性測試之結果，相

21、符性頗高，例如生物晶片技術目前已成功應用在抗藥性及毒性基因之檢測方面，研究利用PCR產物作為探針，發(fā)展檢測23種抗藥性基因與25種毒性基因檢測用之晶片，並有效且快速檢測Salmonella及E. coli菌株。造成國內發(fā)生食物中毒之前五大病原菌分別為腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、仙人掌桿菌(Bacillus cereus)及病原性大腸桿菌(Pathogenic Escherichia coli)。其中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及病原性大腸桿菌等，亦為禽畜重要的病

22、原菌。此外，彎曲桿菌(Campylobacter spp.)、E. coli O157:H7 及 Listeria monocytogenes，也是國際間相當重視的病原微生物。而快速鑑別這些有害細菌技術的研發(fā)，將是杜絕食品中毒與禽畜疫病防治之重要課題。目前國內已有生物晶片公司上市，其中對於食品及家畜病原菌方面，竹南科學園區(qū)的晶宇生物科技公司已發(fā)展出相關檢測型生物晶片套組商品，目前的產品，包括有食品晶片(Dr. Food Kit)、牛乳晶片(Dr. Milk Kit)、腸病毒生物晶片(Dr. EV Kit)等，目前正積極的開發(fā)國內外市場中。在國外相關生物晶片發(fā)展方面，全美有數家生物晶片生產公司，

23、如Affymetrix 公司、Illumina 公司、Nanogen 公司等。其中Affymetrix 公司為全美第一家發(fā)展生物晶片技術的公司，該公司擁有相當多生物晶片製造技術的專利權。許多其他的生物晶片的生技公司，若需採用類似的製作技術時，都必須獲得Affymetrix 公司之授權。Nanogen公司則一直致力於發(fā)展電子式的生物晶片的技術，其乃是利用電子吸引力的原理，使得該生物晶片在做雜交時只需要15秒就可以完成。而Illumina公司的技術是將DNA片段放在一個個非常細微的小珠上，而晶片上則設計一個個只能放一個小珠的凹槽。由於這項設計，所以使Illumina公司的DNA晶片成為目前面積最小

24、，密度最高的生物晶片。就Affymetrix公司所發(fā)展之微生物檢測生物晶片而言，其所發(fā)展之生物晶片則可利用於多重病原性微生物、生物恐怖微生物之檢測，如葡萄球菌屬、鏈球菌屬（如Streptococcus pyogenes）、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)等之檢測工作。 至於在相關微生物生物晶片之論文發(fā)表，則不勝枚舉，國內方面，相關於食品病原菌檢測，則有2006年成功大學醫(yī)技系張長泉教授利用微生物之ITS序列設計出共通引子組與DNA探針，完成可同時檢測多種食品病原菌之寡核N酸生物晶片，以及弘光科技大學於2006年發(fā)表的以16 rRNA所設計之寡核N酸生物晶片等。在工研院方面，近年來亦有所謂發(fā)燒晶片的研發(fā)，惟尚未商業(yè)化，另在中國大陸，利用生物晶片檢測致病菌的研究亦早已開始，專業(yè)的書籍亦已出版。生物晶片技術目前已應用於基因表現的檢測、微生物之鑑定、微生物毒性基因之檢測及Salmonella 血清型分型等，亦有相關文獻應用於多種病原菌抗藥性基因之檢測，如erythromycin、quinolone類、tetracycline、rifampin及 -lactams 等抗微生物製劑相關之抗藥性基因進行檢測等。本研究室亦已開發(fā)出快速的方法檢測Salmonella Enteritidis 、Salmonella Typhimurium 及Salmonella Chole