生物化學(xué)考試輔導(dǎo)資料2

1、【精品文檔】如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除，僅供學(xué)習(xí)與交流生物化學(xué)考試輔導(dǎo)資料2.精品文檔.RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄生成hnRNA和mRNA，是真核生物中最活躍的RNA聚合酶。RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物都是小分子量的RNA，tRNA的，5SrRNA的和snRNA。RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是45SrRNA，生成除5SrRNA外的各種rRNA。下面小結(jié)真核生物的RNA聚合酶，見(jiàn)表。（三）啟動(dòng)子及終止信號(hào)1啟動(dòng)子啟動(dòng)子或啟動(dòng)部位是指在轉(zhuǎn)錄開(kāi)始進(jìn)行時(shí)，RNA聚合酶與模板DNA分子結(jié)合的特定部位。這特定部位在轉(zhuǎn)錄作用的調(diào)節(jié)中是有作用的。每一個(gè)基因均有自己特有的啟動(dòng)子。（1）原核生物的啟動(dòng)子。 原核生物的啟動(dòng)子大約有55個(gè)堿基

2、對(duì)長(zhǎng)，其中包含有轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)和兩個(gè)區(qū)結(jié)合部位及識(shí)別部位。起始點(diǎn)是DNA模板鏈上開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)錄作用的位點(diǎn)，標(biāo)以+1，轉(zhuǎn)錄是從起始點(diǎn)開(kāi)始向模板鍵的5末端方向即編碼鏈3末端方向進(jìn)行。在DNA模板上，從起始點(diǎn)開(kāi)始順轉(zhuǎn)錄方向的區(qū)域稱為下游；從起始點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄方向的區(qū)域稱為上游。結(jié)合部位是指在DNA分子上與RNA聚合酶核心酶緊密結(jié)合的序列。結(jié)合部位的長(zhǎng)度大約是7個(gè)堿基對(duì)，其中心位于起始點(diǎn)上游的-10bp處。因此將此部位稱為-10區(qū)。多種啟動(dòng)子的-10區(qū)具有高度的保守性和一致性；它們有一個(gè)共有序列或共同序列，為5TATAAT3。又稱為Pribnow盒。由于在Pribnow盒中堿基組成全是AT配對(duì)，缺少GC配對(duì)；而

3、前者的親和力只相當(dāng)于后者的十分之一，所以Tm值較低。因此此區(qū)域的DNA雙鏈容易解開(kāi)，利于RNA聚合酶的進(jìn)入而促使轉(zhuǎn)錄作用的起始。在DNA分子上還有一段識(shí)別部位，是RNA聚合酶的因子識(shí)別DNA分子的部位。識(shí)別部位約有6個(gè)堿基對(duì)，其中心位于上游-35bp處。所以稱為-35區(qū)，其共有序列5-TTGACA-3。其示意圖見(jiàn)圖。（2）真核生物的啟動(dòng)子。一個(gè)真核基因按功能可分為兩部分，即調(diào)節(jié)區(qū)和結(jié)構(gòu)基因。結(jié)構(gòu)基因的DNA序列指導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄；如果該DNA序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為mRNA，則最終翻譯為蛋白質(zhì)。調(diào)節(jié)區(qū)由兩類元件組成，一類元件決定基因的基礎(chǔ)表達(dá)，又稱為啟動(dòng)子；另一類元件決定組織特異性表達(dá)或?qū)ν猸h(huán)境及刺激應(yīng)答；

4、兩者共同調(diào)節(jié)表達(dá)。RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子與原核生物的啟動(dòng)子相似，也具有兩個(gè)高度保守的共有序列。其一是在25附近的一段AT富集序列，其共有序列是TATAA，稱為TATA盒。TATA盒與原核的Pribonow盒相似，是轉(zhuǎn)錄因子與DNA分子結(jié)合的部位。其二是在多數(shù)啟動(dòng)子中，-70附近共有序列CAAT區(qū)，稱為CAAT盒。除以上兩個(gè)區(qū)域外，有些啟動(dòng)子上游中含有GC盒，此GC盒與CAAT盒多位于-40110之間，它們可影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率。另外，有少量基因缺乏TATA盒，而由起始序列（Inr）與RNA聚合酶直接作用啟動(dòng)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始。啟動(dòng)子決定了被轉(zhuǎn)錄基因的啟動(dòng)頻率與精確性，同時(shí)啟動(dòng)子在DNA序列中的位置

5、和方向是嚴(yán)格固定的，是由5到3方向。其示意圖見(jiàn)圖。增強(qiáng)子：增強(qiáng)子是長(zhǎng)約100200bp的序列，它們與啟動(dòng)子不同，可以位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，也可位于其下游。有些增強(qiáng)子和靜息子在DNA序列中的方向是嚴(yán)格由5到3方向排列，而另外一些則是自3向5方向排列。增強(qiáng)子和靜息于與其他調(diào)節(jié)元件的DNA序列是互相重疊的。增強(qiáng)子具有增加啟動(dòng)子的作用，與啟動(dòng)子都可視為基因表達(dá)調(diào)控中的順式作用元件，可與轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶結(jié)合，啟動(dòng)并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄作用生成的18S、58S及 28SrRNA前體，它所識(shí)別的啟動(dòng)子與RNA聚合酶所識(shí)的啟動(dòng)子相比，有較大的差異。RNA聚合酶催化高度保守的 tRNA、5

6、S rRNA及一些小核RNA。它識(shí)別的啟動(dòng)子比較特殊，啟動(dòng)子不位于編碼基因的上游，而在編碼基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。2終止信號(hào)DNA分子中停止轉(zhuǎn)錄作用的部位，稱為終止信號(hào)。終止部位在結(jié)構(gòu)上有些特點(diǎn)，終止部位中有一段GC富集區(qū)，隨之又有一段AT富集區(qū)。在GC區(qū)內(nèi)有一段是反向重復(fù)序列，以致轉(zhuǎn)錄作用生成的mRNA在其相應(yīng)序列中有互補(bǔ)形成的發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。對(duì)于DNA分子的AT富集區(qū)，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA的3末端中相應(yīng)的有一連串U序列。還有一種蛋白質(zhì)因子，它對(duì)于RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)有輔助作用，又稱為終止蛋白。（四）轉(zhuǎn)錄過(guò)程轉(zhuǎn)錄作用過(guò)程可以分為三個(gè)階段：起始、延長(zhǎng)及終止。1起始RNA聚合酶的因子識(shí)別DNA啟動(dòng)子的識(shí)別

7、部位，RNA聚合酶核心酶則結(jié)合在啟動(dòng)子的結(jié)合部位。在與RNA聚合核心酶結(jié)合的Pribonow盒附近，雙鏈暫時(shí)打開(kāi)約17個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度，展示出DNA模板鏈，有利于RNA聚合酶進(jìn)入轉(zhuǎn)錄泡，催化RNA聚合作用。轉(zhuǎn)錄作用開(kāi)始時(shí)，根據(jù)DNA模板鏈上的核苷酸的序列，NTP根據(jù)堿基互補(bǔ)原則依次進(jìn)入反應(yīng)體系。在RNA聚合酶的催化下，起始點(diǎn)處相鄰的前兩個(gè)NTP以3、5一磷酸二酯鍵相連接。隨后，因子從模板及RNA聚合酶上脫落下來(lái)，于是RNA聚合酶的核心酶沿著模板向下游移動(dòng)，轉(zhuǎn)錄作用進(jìn)入延長(zhǎng)階段。脫落下的因子可以再次與核心酶結(jié)合而循環(huán)使用。2延長(zhǎng)在RNA聚合酶的催化下，核苷酸之間以3、5一磷酸二酯鍵相連接進(jìn)行著RNA

8、的合成反應(yīng)，合成方向?yàn)?3。在延長(zhǎng)過(guò)程中，局部打開(kāi)的DNA雙鏈、RNA聚合酶及新生成轉(zhuǎn)錄本RNA局部形成轉(zhuǎn)錄泡。隨RNA聚合酶的移動(dòng)，轉(zhuǎn)錄泡也行進(jìn)，貫穿于延長(zhǎng)始終。3終止在RNA延長(zhǎng)進(jìn)程中，當(dāng)RNA聚合酶行進(jìn)到DNA模板的終止信號(hào)時(shí)，RNA聚合酶就不再繼續(xù)前進(jìn)，聚合作用也因此停止。由于終止信號(hào)中有由GC富集區(qū)組成的反向重復(fù)序列，在轉(zhuǎn)錄生成的mRNA中有相應(yīng)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。此發(fā)卡結(jié)構(gòu)可阻礙RNA聚合酶的行進(jìn)，由此而停止了RNA聚合作用。在終止信號(hào)中還有AT富集區(qū)，其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA3末端有多個(gè)U殘基。二、轉(zhuǎn)錄后的加工過(guò)程轉(zhuǎn)錄作用產(chǎn)生出的mRNA、tRNA及rRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本全是前體RNA，而不是

9、成熟的RNA，它們沒(méi)有生物學(xué)活性，還要在酶的作用下，進(jìn)行加工才能變?yōu)槌墒斓?，有活性的RNA。RNA的加工過(guò)程主要是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，也有少數(shù)反應(yīng)是在胞質(zhì)中進(jìn)行。RNA加工的類型有：剪切及剪接：剪切就是剪去部分序列；剪接是指剪切后又將某些片段連接起來(lái)。末端添加核苷酸：例如tRNA的3-末端添加-CCA。修飾：在堿基及核糖分子進(jìn)行化學(xué)修飾。RNA編輯：某些RNA，特別是mRNA自DNA模板上所獲得的遺傳信息，在轉(zhuǎn)錄作用后又發(fā)生了變化。（一）mRNA前體的加工1mRNA生成的特點(diǎn)(1)原核生物mRNA的生成。原核生物轉(zhuǎn)錄作用生成的mRNA屬于多順?lè)醋?。即幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因，利用共同的啟動(dòng)子及共同的終止信號(hào)，

10、經(jīng)轉(zhuǎn)錄作用生成mRNA分子，所以此mRNA分子可編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。原核生物中，細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有核膜，染色質(zhì)存在于胞質(zhì)中，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯進(jìn)行的場(chǎng)所沒(méi)有明顯的屏障。在轉(zhuǎn)錄尚未完成時(shí)，翻譯就已開(kāi)始了。而且，mRNA的壽命十分短暫。（2）真核生物mRNA生成。真核生物轉(zhuǎn)錄作用生成的mRNA為單順?lè)醋?，即一個(gè)mRNA分子只編碼一種蛋白質(zhì)。真核生物的結(jié)構(gòu)基因中包含有具有表達(dá)活性的編碼蛋白質(zhì)序列，稱為外顯子；還含有無(wú)表達(dá)活性的序列，稱為內(nèi)含子。由于內(nèi)含于是插在外顯子之間，所以又稱為插入序列。轉(zhuǎn)錄生成的mRNA前體中有來(lái)自外顯子部分的，也有來(lái)自內(nèi)含子部分的。在加工時(shí)，前體要進(jìn)行剪接作用。2mRNA前體的加工原核

11、生物轉(zhuǎn)錄生成的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本mRNA不需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的加工就表現(xiàn)有活性。唯一的加工作用是多順?lè)醋觤RNA在RNase的催化下，裂解為單獨(dú)的順?lè)醋印Ｕ婧松镛D(zhuǎn)錄生成的mRNA要經(jīng)過(guò)較復(fù)雜的加工過(guò)程。包括5末端加帽3端加尾剪接去除內(nèi)含子并連接外顯子核苷酸編輯甲基化修飾。(1)5末端帽子的生成。步驟mRNA5末端pppNp在磷酸酶作用下脫P(yáng)i，形成ppNp-。在鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下，與Gppp反應(yīng)形成GpppNp-。在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，由腺苷蛋氨酸(SAM)提供甲基，在鳥(niǎo)嘌呤的N-7上甲基化，然后在連接于鳥(niǎo)苷酸的第一個(gè)（或第二個(gè)）核苷酸2OH上又進(jìn)行甲基化，最后成為m7GpppNmp，這就是帽子生成。（2）3

12、末端多聚A尾的生成。多聚A尾的生成是多聚A聚合酶的催化下，由ATP聚合而成。但多聚A尾形成并不是簡(jiǎn)單地加入A，而是先要在mRNA前體的3末端1130核苷酸處有一段AAUAA保守序列，在U7snRNP的協(xié)助下識(shí)別，由一種特異的核酸內(nèi)切酶催化切除多余的核苷酸。隨后，在多聚A聚合酶催化下，發(fā)生聚合反應(yīng)形成了3末端多聚A尾。（3）剪接作用。在轉(zhuǎn)錄時(shí)，外顯子及內(nèi)含子均轉(zhuǎn)錄到hnRNA中。在細(xì)胞核中，hnRNA進(jìn)行剪接作用，首先在核酸內(nèi)切酶作用下剪切掉內(nèi)含子；然后在連接酶作用下，將外顯子各部分連接起來(lái)，成為成熟的mRNA，這就是剪接作用。一個(gè)相同的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，在不同的組織中由于剪接作用的差異可以產(chǎn)生具有不

13、同編碼的mRNA，導(dǎo)致翻譯生成不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在剪接作用過(guò)程中有如下一些共同的特點(diǎn)：1）mRNA前體的剪切部位是在內(nèi)含子末端的特定序列。內(nèi)含子的序列中起始為GU；而終止于AG。在內(nèi)含子3末端剪接點(diǎn)的上游2050核苷酸范圍內(nèi)，還有一個(gè)在剪接中有重要作用的位點(diǎn)，其序列中含有A，稱為分支部位。內(nèi)含子如果其中發(fā)生部分丟失，不一定會(huì)對(duì)剪接產(chǎn)生影響。3末端或分支部位發(fā)生變異，則會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的剪接。2）套索的形成及剪除。mRNA前體剪接過(guò)程中，先剪切下內(nèi)含子，然后連接外顯子。剪接的過(guò)程分兩步反應(yīng)進(jìn)行：內(nèi)含子序列中分支部位中腺苷酸殘基（A）的2OH攻擊內(nèi)含子5末端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，剪下了外顯子1，而

14、腺苷酸原來(lái)已有以3、5-磷酸二酯鍵相連的兩個(gè)相鄰的核苷酸殘基，加上此2、5-磷酸二酯鍵的連接后，形成了“套索”中間產(chǎn)物。已被剪切下的外顯子1的3末端-OH攻擊內(nèi)含子3，末端與外顯子2之間的3、5磷酸二酯鍵，鏈斷裂，內(nèi)含子以套索形式被剪切下來(lái)，同時(shí)外顯子1與外顯子2連接起來(lái)。 剪接體的生成。 在mRNA前體剪接過(guò)程去除內(nèi)含子時(shí)，還有多種成分的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的參與，其大小為60S，是由幾種非特異的小核核糖核蛋白(UsnRNP)與mRNA前體結(jié)合而成，稱為剪接體。（UsnRNA)是一族snRNA，參與剪接作用的有多種UsnRNPs。U1snRNP識(shí)別外顯子的5末端剪接序列，并與其互補(bǔ)而結(jié)合。

15、U5snRNP，識(shí)別并結(jié)合于內(nèi)含于3末端剪接點(diǎn)。U2snRNP識(shí)別并結(jié)合于A序列的分支點(diǎn)。還有U4及U6snRNP也參加到剪接體中，起配合作用。(4)RNA編輯在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中插入、刪除或取代一些核苷酸殘基，生成具有正確翻譯功能的模板，此即所謂RNA的編輯作用。 編輯過(guò)程由一個(gè)或多個(gè)小分子的“指導(dǎo)RNA”提供mRNA的編輯信息，并作為模板指導(dǎo)其進(jìn)行編輯，在編輯體的幫助下進(jìn)行編輯。(5)甲基化修飾原核生物mRNA分子中不含有稀有堿基，但真核生物的mRNA中則含有甲基化核苷酸，除了在hnRNA的5端帽子結(jié)構(gòu)中含有23個(gè)甲基化核苷外；在分子內(nèi)部還會(huì)有l(wèi)2個(gè)m6A存在于非編碼區(qū)。在序列中，m6A總是位于胞

16、苷之后，形成了NCm6AN序列。m6A的生成是在hnRNA的剪接作用之前發(fā)生的。（二）tRNA前體的加工在核酸內(nèi)切酶RNaseP作用下，從5末端切除多余的核苷酸。在核酸外切酶RNaseD作用下，從3末端切除多余的核苷酸。核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，3末端加CCA-OH，為tRNA加I特有反應(yīng)。核酸內(nèi)切酶催化進(jìn)行剪切反應(yīng)，剪掉內(nèi)含子，由連接酶連接外顯子部分。 化學(xué)修飾作用，如甲基化、脫氨基、還原反應(yīng)。（三）rRNA前體的加工原核生物有 16S、23S及 5S三種 rRNA，這三種rRNA均存在于30S的rRNA前體中。轉(zhuǎn)錄作用完成后，在RNase催化下，將rRNA前體切開(kāi)產(chǎn)生16S、25S及 5S rRN

17、A的中間前體。進(jìn)一步在核酸酶的作用下，切去部分間隔序列，產(chǎn)生成熟的 16S、23S及5S rRNA，還有成熟的 tRNA。并對(duì)16S rRNA進(jìn)行甲基化修飾，生成稀有堿基。與4S rRNA加I變化不大。真核生物的核蛋白體中有18S、58S及5S rRNA。 5SrRNA自己獨(dú)立成體系，在成熟過(guò)程中加工甚少，不進(jìn)行修飾和剪切。 45S rRNA前體中包含有 18S、58S及 28SrRNA。在加工過(guò)程中，分子廣泛地進(jìn)行甲基化修飾，主要是在28S及18S中。甲基化作用多發(fā)生于核糖上，較少在堿基上。隨后45 S rRNA前體經(jīng)核酸酶順序剪切下生成18S、5.8S、28S rRNA。三、核酶對(duì)于具有催

18、化活性的RNA現(xiàn)稱為“核酶”。核酶作用方式較簡(jiǎn)單，歸納起來(lái)主要有以下幾種類型：剪切型，這類核酸能催化自身RNA或異體RNA分子剪掉一段核苷酸片段，其催化功能相當(dāng)于內(nèi)切核酸酶的作用。剪接型，這類核酶催化自身RNA進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，首先切去自身RNA內(nèi)一個(gè)核苷酸片段，再將剩余的兩個(gè)片斷連接起來(lái)；相當(dāng)于內(nèi)切核酸酶及連接酶的聯(lián)合作用。其他類型，如核苷酸轉(zhuǎn)移，脫磷酸作用。核酶的酶活性種類：核苷酸轉(zhuǎn)移作用。磷酸二酯鍵水解作用。磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)催化作用。脫磷酸作用。限制性內(nèi)切酶作用。核酶的意義：RNA可作為生物催化劑。打破了只有蛋白質(zhì)才能有酶催化作用。為進(jìn)化先有核酸、先有RNA提供證據(jù)?？捎糜谥扑幒团R床治療。四、R

19、NA的復(fù)制病毒RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，還可進(jìn)行復(fù)制，即在RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶催化進(jìn)行RNA合成反應(yīng)。RNA復(fù)制酶催化的合成反應(yīng)是以RNA為模板，由5向3方向進(jìn)行RNA鏈的合成。RNA復(fù)制酶缺乏校對(duì)功能的內(nèi)切酶活性，因此RNA復(fù)制的錯(cuò)誤率較高，RNA復(fù)制酶只是特異地對(duì)病毒的RNA起作用，而宿主細(xì)胞的RNA一般并不進(jìn)行復(fù)制。病毒RNA復(fù)制的幾種方式（1）含正鏈RNA(+)的病毒(例如，噬菌體Q)：(+)RNA充當(dāng)mRNA，合成蛋白(+)RNA為模板，復(fù)制，合成(-)RNA，再以(-)RNA為模板合成(+)RNA組裝成病毒顆粒。（2）含負(fù)鏈RNA(-)的病毒(例如狂犬病)：由(-)RNA合成(+)

20、RNA，再由(+)RNA合成蛋白質(zhì)、(-)RNA，組裝成病毒。（3）含雙鏈RNA的病毒(例如呼腸孤病毒)：以(-)RNA為模板合成(+)RNA，以(+)RNA為模板合成(-)RNA和蛋白，組裝病毒顆粒。（4）逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如白血病毒)：由RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，以DNA為模板合成RNA，翻譯蛋白質(zhì)。mRNA生成后，遺傳信息由mRNA傳遞給新合成的蛋白質(zhì)，此時(shí)mRNA分子中的遺傳信息被翻譯成為蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序，因此蛋白質(zhì)的合成過(guò)程也被稱為翻譯。一、蛋白質(zhì)合成體系參與蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)，除作為原料的氨基酸外，還有mRNA、tRNA、核蛋白體、有關(guān)的酶(氨基酰tRNA合成酶)，以及ATP、CTP等

21、供能物質(zhì)與必要的無(wú)機(jī)離子等。（1）mRNA的作用原理mRNA中每3個(gè)核苷酸組成1個(gè)密碼子，體現(xiàn)一個(gè)氨基酸的信息。在mRNA中，每3個(gè)相互鄰接的核苷酸，其特定排列順序，在蛋白質(zhì)生物合成中可被體現(xiàn)為某種氨基酸或合成的終止信號(hào)者稱為密碼子，統(tǒng)稱遺傳密碼。遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性、通用性、方向性、不間斷性和不重疊性。UAA、UAG、UGA為肽鏈的終止信號(hào)，不代表任何氨基酸。密碼子AUG不僅代表一定氨基酸，而且位于mRNA啟始部分，AUG又是肽鏈合成的啟始信號(hào)。mRNA上的啟動(dòng)信號(hào)到終止信號(hào)的排列是有一定方向性的。啟動(dòng)信號(hào)總是位于mRNA的5末端的一邊，而終止信號(hào)總是在mRNA的3末端一邊。（2）tRNA的作

22、用原理不同的氨基酸有其特定的tRNA，同一種氨基酸常有數(shù)種tRNA。在ATP和酶存在的條件下，tRNA與對(duì)應(yīng)氨基酸結(jié)合成為氨基酰tRNA。tRNA上有由3個(gè)核苷酸組成的反密碼子，與mRNA上的密碼子按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合，氨基酰tRNA才能準(zhǔn)確的在mRNA上對(duì)號(hào)入座。但tRNA的反密碼子中的核苷酸與mRNA的第三個(gè)核苷酸配對(duì)時(shí)，并不嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，此種配對(duì)稱不穩(wěn)定配對(duì)。（3）核蛋白體的作用原理核蛋白體相當(dāng)于裝配體，由大亞基(原核為50S，真核為60S)和小亞基(原核為30S，真核為40S)組成。大亞基具有轉(zhuǎn)肽酶的活性，可使核蛋白體上的肽鏈轉(zhuǎn)移到新進(jìn)入核蛋白體的tRNA所攜帶的氨基酸上

23、，使其縮合成肽。所以，當(dāng)核蛋白體在mRNA上每向前移動(dòng)一個(gè)密碼子的位置，肽鏈上即增加一個(gè)新的氨基酸，直至終止信號(hào)。二、蛋白質(zhì)合成的過(guò)程蛋白質(zhì)生物合成的具體步驟包括：氨基酸的活化；活化氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)；活化氨基酸在核蛋白體上的縮合。(一）氨基酸的活化轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的活化過(guò)程及其活化后與相應(yīng)tRNA的結(jié)合過(guò)程，都是由氨基酰tRNA合成酶來(lái)催化的，反應(yīng)方程(見(jiàn)原書(shū)),以氨基酰tRNA形式存在的活化氨基酸，即可投入氨基酸縮合成肽的過(guò)程。氨基酰tRNA合成酶存在于胞液中，具有高度特異性。它們既能識(shí)別特異的氨基酸，又能辨認(rèn)攜帶該種氨基酸的特異tRNA分子。在體內(nèi)，每種氨基酰tRNA合成酶都能從多種氨基酸中選出與其

24、對(duì)應(yīng)的一種，并選出與此氨基酸相應(yīng)的特異tRNA。這是保證遺傳信息準(zhǔn)確翻譯的要點(diǎn)之一。（二）核蛋白體循環(huán)tRNA所攜帶的氨基酸，是通過(guò)“核蛋白體循環(huán)”在核蛋白體上縮合成肽，完成翻譯過(guò)程的。以原核生物中蛋白質(zhì)合成為例，將核蛋白體循環(huán)人為地分為啟動(dòng)、肽鏈延長(zhǎng)和終止三個(gè)階段進(jìn)行介紹。1啟動(dòng)階段在蛋白質(zhì)生物合成的啟動(dòng)階段，核蛋白體的大、小亞基，mRNA與一種具有啟動(dòng)作用的氨基酸t(yī)RNA共同構(gòu)成啟動(dòng)復(fù)合體。這一過(guò)程需要一些稱為啟動(dòng)因子的蛋白質(zhì)以及GTP與鎂離子的參與。原核生物中的啟動(dòng)因子有3種，IF1輔助另外兩種啟動(dòng)因子IF2、IF3起作用。啟動(dòng)階段的具體步驟如下：(1)30S亞基在IF3與IF1的促進(jìn)下

25、與mRNA的啟動(dòng)部位結(jié)合，在IF2的促進(jìn)與IF1輔助下與甲酰蛋氨酰tRNA以及GTP結(jié)合，形成30S啟動(dòng)復(fù)合體。30S啟動(dòng)復(fù)合體由30S亞基、mRNA、fMet-tRNAfMet及IF1、IF2、IF3與GTP共同構(gòu)成。（2）30S啟動(dòng)復(fù)合體一經(jīng)形成，IF3即行脫落，50S亞基隨之與其結(jié)合，形成了大、小亞基，mRNA，fMettRNAfMet及IF1、IF2與GTP共同構(gòu)成的70S啟動(dòng)前復(fù)合體。（3）70S啟動(dòng)前復(fù)合體的GTP水解釋出GDP與無(wú)機(jī)磷酸的同時(shí)，IF2和IF1隨之脫落，形成了啟動(dòng)復(fù)合體。至此，已為肽鏈延長(zhǎng)作好了準(zhǔn)備。啟動(dòng)復(fù)合體由大、小亞基，mRNA與fMettRNAfMet共同構(gòu)成

26、。已知核蛋白體上有兩個(gè)位置，分別稱為“給位”與“受位”，啟動(dòng)復(fù)合體中mRNA的啟動(dòng)信號(hào)相對(duì)應(yīng)的fMettRNAfMet亦即處于核蛋白體的給位。2肽鏈延長(zhǎng)階段這一階段，根據(jù)mRNA上密碼子的要求，新的氨基酸不斷相應(yīng)的被特異的tRNA運(yùn)至核蛋白體受位，形成肽鍵。同時(shí)，核蛋白體從mRNA的5端向3端不斷移位推進(jìn)翻譯過(guò)程。肽鏈延長(zhǎng)階段需要數(shù)種稱為延長(zhǎng)因子的蛋白質(zhì)、GTP與某些無(wú)機(jī)離子的參與。(1)進(jìn)位受位上mRNA密碼子相對(duì)應(yīng)的氨基酸t(yī)RNA進(jìn)入受位，生成復(fù)合體V。此步驟需要GTP、Mg2+和稱為肽鏈延長(zhǎng)因子EFTu與EFTs的蛋白質(zhì)因子。（2）轉(zhuǎn)肽50S亞基的給位有轉(zhuǎn)肽酶的存在，可催化肽鍵形成。此時(shí)

27、在轉(zhuǎn)肽酶的催化下，將給位上tRNA所攜的甲酰蛋氨酰（或肽酰）轉(zhuǎn)移給受位上已特異性進(jìn)入的氨基酸t(yī)RNA，與其所帶的氨基酸的氨基結(jié)合形成肽鍵。此酶需要Mg2+與K2+存在。（3）脫落原在給位上的脫去甲酰蛋氨酰后的tRNAfMet，從復(fù)合物上脫落。（4）移位核蛋白體向mRNA的3端挪動(dòng)相當(dāng)于一個(gè)密碼子的距離，使下一個(gè)密碼子準(zhǔn)確定位在受位，同時(shí)帶有肽鏈的tRNA由受體移至給位，此步需有肽鏈延長(zhǎng)因子EFG、GTP與Mg2+。 以后肽鏈上每增加一個(gè)氨基酸殘基，就按進(jìn)位（新的氨基酸t(yī)RNA進(jìn)入“受位”）轉(zhuǎn)肽（形成新的肽鍵）脫落（轉(zhuǎn)肽后“給位”上的tRNA脫落）移位（核蛋白體挪動(dòng)的同時(shí)，原處于“受位”帶有肽鏈

28、的tRNA隨之轉(zhuǎn)到“給位”）。3終止階段當(dāng)多肽鏈合成已完成，并且“受位”上已出現(xiàn)終止信號(hào)（UAA），此后即轉(zhuǎn)入終止階段。終止階段包括已合成完畢的肽鏈被水解釋放，以及核蛋白體與tRNA從mRNA上脫落的過(guò)程。這一階段需要一種起終止作用的蛋白質(zhì)因子終止因子的參與。終止因子使大亞基“給位”的轉(zhuǎn)肽酶不起轉(zhuǎn)肽作用，而起水解作用。在轉(zhuǎn)肽酶的作用下，“給位”上tRNA所攜帶的多肽鏈與tRNA之間的酯鍵被水解，并從核蛋白體及tRNA上釋出。從mRNA上脫落的核蛋白體，分解為大小兩個(gè)亞基，重新進(jìn)入核蛋白體循環(huán)。核蛋白體的解體需要IF3的參與。下面小結(jié)參與原核生物蛋白質(zhì)合成的一些因子，見(jiàn)表。作用階段因子作用起動(dòng)I

29、F使帶氨基酰的tRNA與小亞基結(jié)合IF2同上，并具有GTP酶活性IF3 促進(jìn)小亞基與mRNA特異結(jié)合，在終止階段促使已脫落的核蛋白體解離為亞基延伸EFTu、EFTs促進(jìn)氨基酰tRNA進(jìn)入核蛋白體的“受體”具有GTP酶的活性EFG具有GTP酶的活性，使轉(zhuǎn)肽后，失去肽鏈(或蛋氨酰)的tRNA，從“給位”上脫落，并促進(jìn)移位終止RF識(shí)別終止信號(hào)，使大亞基團(tuán)轉(zhuǎn)肽酶將“給位”上已合成的多肽鏈水解釋放（ 三）真核生物與原核生物蛋白質(zhì)合成的異同1mRNA真核生物的mRNA前體在細(xì)胞核內(nèi)合成，合成后需經(jīng)加工，才成熟為mRNA，從細(xì)胞核輸入胞漿，投入蛋白質(zhì)合成；而原核生物的mRNA常在合成尚未結(jié)束時(shí)，已開(kāi)始翻譯。

30、真核生物mRNA含有7甲基三磷酸鳥(niǎo)苷形式的“帽”，有由多聚腺苷酸形成的“尾”，為單順?lè)醋?，只含一條多肽鏈的遺傳信息，合成蛋白質(zhì)時(shí)只有一個(gè)合成的啟動(dòng)點(diǎn)，一個(gè)合成的終點(diǎn)；而原核生物的mRNA為多順?lè)醋?，含有蛋白質(zhì)合成多個(gè)啟動(dòng)點(diǎn)和終止點(diǎn)，且不帶有類似“帽”與“尾”的結(jié)構(gòu)。在5端方向啟動(dòng)信號(hào)的上游存在富含嘌呤的SD區(qū)段。真核生物的mRNA則無(wú)此區(qū)段。真核生物的mRNA代謝較慢，哺乳類動(dòng)物mRNA的半衰期為46h，而細(xì)菌的mRNA半衰期僅在13min。此外真核生物的mRNA前體常含有插入順序，即內(nèi)含子，需要在加工時(shí)切除。2核蛋白體真核生物的核蛋白體（80S）大于原核生物。小亞基為 40S含有一種 rRN

31、A(18S rRNA)；大亞基為60S，含有 3種rRNA（28S rRNA、55S rRNA和 5S rRNA），所含的核蛋白體蛋白質(zhì)亦多于原核生物。原核生物小亞基16SrRNA的3末端有一富含嘧啶的區(qū)段，可與其mRNA啟動(dòng)部位富含嘌呤的SD區(qū)互補(bǔ)結(jié)合。在真核生物相應(yīng)的rRNA（18S rRNA）中，無(wú)此互補(bǔ)區(qū)。3tRNA真核生物起著啟動(dòng)作用的氨基酸t(yī)RNA為不需要甲?；腗ettRNAfMet而原核生物中為fMet-tRNAfMet，系MettRNAfMet經(jīng)蛋氨酰tRNA轉(zhuǎn)甲酰基酸催化后的產(chǎn)物。4合成過(guò)程（1）啟動(dòng)。真核生物的啟動(dòng)因子（eIF）有9-10種，真核生物核蛋白小亞基先與Met

32、tRNAfMet結(jié)合，再與mRNA結(jié)合，此時(shí)需要一分子ATP。（2）肽鏈延長(zhǎng)。真核生物中催化氨基酸t(yī)RNA進(jìn)入受體的延長(zhǎng)因子只有一種（EFT1）。催化肽酰tRNA移位的因子稱為EFT2，可為白喉毒素所抑制。（3）終止。真核生物只需一種終止因子（RF），此終止因子可識(shí)別3種終止密碼子，并需要三磷酸鳥(niǎo)苷。原核生物的終止因子有3種。此外，哺乳動(dòng)物類等真核生物線粒體中，存在著自DNA到RNA及各種有關(guān)因子的蛋白合成體系，以合成線粒體的某些多肽。該體系類似原核生物蛋白合成體系。（四）翻譯后加工從核蛋白體釋放的多肽鏈，不一定具備生物活性。肽鏈從核蛋白體釋放后，經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)各種修飾處理過(guò)程，成為有活性的成熟蛋

33、白質(zhì)，稱為翻譯后加工。1.高級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾肽鏈釋放后可自行根據(jù)其一級(jí)結(jié)構(gòu)的特征折疊、盤曲成高級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，高級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾還包括：（1）折疊：蛋白立體構(gòu)象的生成需要折疊，有分子伴侶，二硫鍵異構(gòu)酶及肽鏈順?lè)串悩?gòu)酶等參與。（2）亞基聚合。具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)由兩條以上的肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵聚合，形成寡聚體，各亞基雖自有獨(dú)立功能，但又必須相依存，才得以發(fā)揮作用。（3）輔基連接。蛋白質(zhì)分為純蛋白及結(jié)合蛋白兩大類，糖蛋白、脂蛋白及各種帶有輔酶的酶，都是常見(jiàn)的重要結(jié)合蛋白質(zhì)。輔基（輔酶）與肽鏈的結(jié)合是復(fù)雜的生化過(guò)程。2一級(jí)產(chǎn)物的修飾（1）去除N-甲?；騈-蛋氨酸。在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，N-端氨基酸總是fMet（甲

34、酰蛋氨酸），其-氨基是甲酰化的。但天然蛋白質(zhì)大多數(shù)不以蛋氨酸為N端第一位氨基酸。細(xì)胞內(nèi)的脫甲酰基酶或氨基肽酶可以除去N-甲?；?，N-末端蛋氨酸或N-末端的一段肽。（2）個(gè)別氨基酸的修飾。有些蛋白質(zhì)還需經(jīng)一定的修飾才能成熟而參與正常的生理活動(dòng)。例如精蛋白的前體需要帶上糖鏈，膠原蛋白的前體在細(xì)胞內(nèi)合成后，需經(jīng)羥化并帶上糖鏈。在結(jié)締組織的蛋白質(zhì)內(nèi)常出現(xiàn)羥脯氨酸、羥賴氨酸，這兩種氨基酸并無(wú)遺傳密碼、反密碼子及tRNA引導(dǎo)入肽鏈，是脯氨酸、賴氨酸殘基經(jīng)過(guò)羥化而出現(xiàn)的。（3）水解修飾。通過(guò)水解修飾，一條肽鏈可能分為多個(gè)不同的活性肽段。無(wú)活性的酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?，常需要去掉一部分肽鏈。例如胰島素原變?yōu)橐葝u

35、素時(shí)，尚需去掉部分肽段。3蛋白質(zhì)合成的靶向輸送蛋白質(zhì)合成后，定向地到達(dá)其執(zhí)行功能的目標(biāo)地點(diǎn)，稱為靶向輸送。分泌性蛋白的合成過(guò)程實(shí)際是和其他蛋白質(zhì)基本一樣的。但其mRNA往往要有一段疏水氨基酸較多的肽編碼，這段肽稱為信號(hào)肽，其作用是把合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，剪切下信號(hào)肽，然后把合成的蛋白質(zhì)送出胞外。三、蛋白質(zhì)生物合成的干擾和抑制（一）抗菌素（抗生素）（1）四環(huán)素族，包括土霉素等，能抑制氨基酰tRNA與原核細(xì)胞的核蛋白體小亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)生物合成。（2）氯霉素，能與原核生物的核蛋白體大亞基結(jié)合，阻斷翻譯延長(zhǎng)過(guò)程。高濃度時(shí)，對(duì)真核生物線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成也有阻斷作用。（3）鏈霉素，和卡那

36、霉素能與原核生物蛋白體小亞基結(jié)合，改變其構(gòu)象，引起讀碼錯(cuò)誤，結(jié)核桿菌對(duì)這兩種抗生素特別敏感。（4）嘌呤霉素，結(jié)構(gòu)與酪氨酸t(yī)RNA相似，從而可取代一些氨基酸t(yī)RNA進(jìn)入翻譯中的核蛋白體受位，當(dāng)延長(zhǎng)的肽鏈轉(zhuǎn)入此異常受位時(shí)，容易脫落，終止肽鏈合成。嘌呤霉素對(duì)原核、真核生物的翻譯過(guò)程均有干擾作用。（5）放線菌素，抑制核蛋白體轉(zhuǎn)肽酶，只對(duì)真核生物有特異性作用。（二）干擾蛋白質(zhì)生物合成的生物活性物質(zhì)白喉毒素，可對(duì)真核生物的EFT起共價(jià)修飾作用，從而使EFT2失活。 干擾素，對(duì)病毒有兩方面的作用：其一是干擾素在雙鏈RNA存在下，可以誘導(dǎo)一種蛋白激酶，由蛋白激酶使eIF2發(fā)生磷酸化，從而抑制病毒蛋白質(zhì)的生物合

37、成；干擾素還可誘導(dǎo)生成一種罕見(jiàn)的寡核苷酸，可活化一種稱為RNase L的核酸內(nèi)切酶，由 RNase L降解病毒 RNA。蓖麻蛋白，與真核生物大亞基(60S)的蛋白結(jié)合，間接抑制EFT的作用，阻礙肽鏈延長(zhǎng)。天花粉蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性，使真核大亞基(60S)失活。一、概述（一）基因表達(dá)的概念一個(gè)細(xì)胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整套基因，稱為基因組?；虮磉_(dá)就是基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過(guò)程。在一定調(diào)節(jié)機(jī)制控制下，大多數(shù)基因經(jīng)歷基因激活、轉(zhuǎn)錄及翻譯等過(guò)程，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子，但并非所有基因表達(dá)過(guò)程都產(chǎn)生蛋白質(zhì)，tRNA、rRNA編碼基因轉(zhuǎn)錄合成RNA的過(guò)程也屬于基因表達(dá)。（二）基因

38、表達(dá)的時(shí)間性及空間性基因表達(dá)的時(shí)間、空間特異性由特異基因的啟動(dòng)子（序列）和（或）性強(qiáng)子與調(diào)節(jié)蛋白相互作用決定。1時(shí)間特異性按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按特定的時(shí)間順序發(fā)生，這是基因表達(dá)的時(shí)間特異性。 多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時(shí)間特異性又稱階段特異性。2空間特異性在個(gè)體生長(zhǎng)全過(guò)程，某種基因產(chǎn)物在個(gè)體按不同組織空間順序出現(xiàn)，這就是基因表達(dá)的空間特異性。又稱細(xì)胞特異性或組織特異性。（三）基因表達(dá)的方式1組成性表達(dá)某些基因產(chǎn)物對(duì)生命全過(guò)程是必需的或必不可少的。這類基因在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，通常被稱為管家基因。管家基因較少受環(huán)境因素影響，而是在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的大多數(shù)或幾乎全部組織中

39、持續(xù)表達(dá)，或變化很小。這類基因表達(dá)視為基本的或組成性基因表達(dá)。2誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)與管家基因不同，另有一些基因表達(dá)極易受環(huán)境變化影響。在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因是可誘導(dǎo)的，稱為誘導(dǎo)。相反，如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答時(shí)被抑制，基因表達(dá)產(chǎn)物水平降低的，稱為阻遏。 誘導(dǎo)和阻遏是同一事物的兩種表現(xiàn)形式，在生物界普遍存在，也是生物體適應(yīng)環(huán)境的基本途徑。在一定機(jī)制控制下，功能上相關(guān)的一組基因，無(wú)論其為何種表達(dá)方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達(dá)，即為協(xié)調(diào)表達(dá)。這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。（四）基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義1適應(yīng)環(huán)境、維持生長(zhǎng)和增殖。2維持個(gè)體發(fā)育與分化。二、基因表達(dá)調(diào)控的基本

40、原理（一）基因表達(dá)的多級(jí)調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)活化、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA降解、翻譯及翻譯后加工及蛋白質(zhì)降解等均為基因表達(dá)調(diào)控的控制點(diǎn)。可見(jiàn)，基因表達(dá)調(diào)控是在多級(jí)水平上進(jìn)行的復(fù)雜事件。其中轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)的基本控制點(diǎn)。四個(gè)基本的調(diào)控點(diǎn)：（1）基因結(jié)構(gòu)的活化。DNA暴露堿基后RNA聚合酶才能有效結(jié)合。活化狀態(tài)的基因表現(xiàn)為：1.對(duì)核酸酶敏感；2.結(jié)合有非組蛋白及修飾的組蛋白；3.低甲基化。（2）轉(zhuǎn)錄起始。最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，通過(guò)DNA元件與調(diào)控蛋白相互作用來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。（3）轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運(yùn)。RNA編輯、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)。（4）翻譯及翻譯后加工。翻譯水平可通過(guò)特異的蛋白因子阻斷mRNA翻譯翻譯后

41、對(duì)蛋白的加工、修飾也是基本調(diào)控環(huán)節(jié)。（二）基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素1DNA序列原核生物大多數(shù)基因表達(dá)調(diào)控是通過(guò)操縱子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。操縱子通常由2個(gè)以上的編碼序列與啟動(dòng)序列、操縱序列以及其他調(diào)節(jié)序列在基因組中成簇串聯(lián)組成。啟動(dòng)序列是RNA聚合酶結(jié)合并起動(dòng)轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列。多種原核基因啟動(dòng)序列特定區(qū)域內(nèi)，通常在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-10及-35區(qū)域存在一些相似序列，稱為共有序列。大腸桿菌及一些細(xì)菌啟動(dòng)序列的共有序列在-10區(qū)域是TATAAT，又稱Pribnow盒（PribnowBox），在-35區(qū)域?yàn)?TTGACA。這些共有序列中的任一堿基突變或變異都會(huì)影響RNA聚合酶與啟動(dòng)序列的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始。因此

42、，共有序列決定啟動(dòng)序列的轉(zhuǎn)錄活性大小。操縱序列是原核阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)操縱序列結(jié)合阻遏蛋白時(shí)會(huì)阻礙RNA聚合酶與啟動(dòng)序列的結(jié)合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移動(dòng)，阻遏轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)。原核操縱子調(diào)節(jié)序列中還有一種特異DNA序列可結(jié)合激活蛋白，使轉(zhuǎn)錄激活，介導(dǎo)正性調(diào)節(jié)。順式作用元件就是指可影響自身基因表達(dá)活性的DNA序列。在不同真核基因的順式作用元件中會(huì)時(shí)常發(fā)現(xiàn)一些共有序列，如 TATA盒、CCAAT盒等。這些共有序列就是順式作用元件的核心序列，它們是真核RNA聚合酶或特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。順式作用元件通常是非編碼序列。順式作用元件并非都位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游（5端）。根據(jù)順式作用元件在基

43、因中的位置、轉(zhuǎn)錄激活作用的性質(zhì)及發(fā)揮作用的方式，可將真核基因的這些功能元件分為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及沉默子等。2調(diào)節(jié)蛋白原核調(diào)節(jié)蛋白分為三類：特異因子、阻遏蛋白和激活蛋白。特異因子決定RNA聚合酶對(duì)一個(gè)或一套啟動(dòng)序列的特異性識(shí)別和結(jié)合能力。阻遏蛋白可結(jié)合操縱序列，阻遏基因轉(zhuǎn)錄。激活蛋白可結(jié)合啟動(dòng)序列鄰近的DNA序列，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)序列的結(jié)合，增強(qiáng)RNA聚合酶活性。真核調(diào)節(jié)蛋白又稱轉(zhuǎn)錄因子。絕大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達(dá)后，通過(guò)與特異的順式作用元件相互作用（DNA-蛋白質(zhì)相互作用）反式激活另一基因的轉(zhuǎn)錄，故稱反式作用因子。有些基因產(chǎn)物可特異識(shí)別、結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)自身基因的開(kāi)

44、啟或關(guān)閉，這就是順式作用。具有這種調(diào)節(jié)方式的調(diào)節(jié)蛋白稱為順式作用蛋白。3DNA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用DNA-蛋白質(zhì)相互作用指反式作用因子與順式作用元件之間的特異識(shí)別及結(jié)合。這種結(jié)合通常是非共價(jià)結(jié)合。絕大多數(shù)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合DNA前需通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成二聚體或多聚體。所謂二聚化就是指兩分子單體通過(guò)一定的結(jié)構(gòu)域結(jié)合成二聚體，它是調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合DNA時(shí)最常見(jiàn)的形式。由同種分子形成的二聚體稱同二聚體，異種分子間形成的二聚體稱異二聚體。除二聚化或多聚化反應(yīng)，還有一些調(diào)節(jié)蛋白不能直接結(jié)合DNA，而是通過(guò)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用間接結(jié)合DNA，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。4RNA聚合酶DNA元件與調(diào)節(jié)蛋白對(duì)

45、轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)最終是由RNA聚合酶活性體現(xiàn)的。啟動(dòng)序列啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)蛋白性質(zhì)對(duì)RNA聚合酶活性影響很大。(1)啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA聚合酶活性：原核啟動(dòng)序列或真核啟動(dòng)子是由轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)及控制轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)組件組成。會(huì)影響其與RNA聚合酶的親和力，而親和力大小則直接影響轉(zhuǎn)錄起始頻率。（2）調(diào)節(jié)蛋白與RNA聚合酶活性：一些特異調(diào)節(jié)蛋白在適當(dāng)環(huán)境信號(hào)刺激下在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，隨后這些調(diào)節(jié)蛋白通過(guò)DNA-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用影響RNA聚合酶活性，從而使基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄頻率發(fā)生改變，出現(xiàn)表達(dá)水平變化。三、原核基因表達(dá)調(diào)控（一）原核基因調(diào)節(jié)特點(diǎn)1因子決定mRNA識(shí)別特異性 原核生

46、物細(xì)胞僅含有一種RNA聚合酶，核心酶參與轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)，全酶司轉(zhuǎn)錄起始。在轉(zhuǎn)錄起始階段，亞基（又稱因子）識(shí)別特異啟動(dòng)序列；不同的因子決定特異基因的轉(zhuǎn)錄激活，決定tRNA、mRNA和rRNA基因的轉(zhuǎn)錄。2操縱子模型的普遍性3阻遏蛋白與阻遏機(jī)制的普遍性（二）乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制1乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)大腸桿菌的乳糖操縱子含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因。基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子受阻遏而處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結(jié)合位點(diǎn)，由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共

47、同構(gòu)成LAC操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。2阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)在沒(méi)有乳糖存在時(shí)，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)。此時(shí)，基因列在P啟動(dòng)序列操縱下表達(dá)的乳糖阻遏蛋白與O序列結(jié)合，故阻斷轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。阻遏蛋白的阻遏作用并非絕對(duì)，偶有阻遏蛋白與O序列解聚。因此，每個(gè)細(xì)胞中可能會(huì)有寥寥數(shù)分子半乳糖苷酶、透酶生成。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，乳糖操縱子即可被誘導(dǎo)。真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖經(jīng)透酶催化、轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，再經(jīng)原先存在于細(xì)胞中的少數(shù)-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)型變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，使-半乳糖苷酶分子增加

48、 1000倍。3CAP的正性調(diào)節(jié)分解代謝物基因激活蛋白CAP是同二聚體，在其分子內(nèi)有DNA結(jié)合區(qū)及cAMP結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)沒(méi)有葡萄糖及cAMP濃度較高時(shí)，cAMP與CAP結(jié)合，這時(shí)CAP結(jié)合在乳糖啟動(dòng)序列附近的CAP位點(diǎn)，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性，使之提高50倍；當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結(jié)合受阻，因此乳糖操縱子表達(dá)下降。由此可見(jiàn)，對(duì)乳糖操縱子來(lái)說(shuō)CAP是正性調(diào)節(jié)因素，乳糖阻遏蛋白是負(fù)性調(diào)節(jié)因素。兩種調(diào)節(jié)機(jī)制根據(jù)存在的碳源性質(zhì)及水平協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)乳糖操縱子的表達(dá)。4對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)制的解釋大腸桿菌根據(jù)碳源性質(zhì)選擇代謝方式。倘若有葡萄糖存在時(shí)，細(xì)菌優(yōu)先選擇葡萄糖供應(yīng)能量。葡萄糖通過(guò)降低cAMP

49、濃度，阻礙cAMP與CAP結(jié)合而抑制乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄，使細(xì)菌只能利用葡萄糖。在沒(méi)有葡萄糖而只有乳糖的條件下，阻遏蛋白與O序列解聚，CAP結(jié)合cAMP后與乳糖操縱子的CAP位點(diǎn)，激活轉(zhuǎn)錄，使得細(xì)菌利用乳糖作為能量來(lái)源。四、真核基因表達(dá)調(diào)控（ 一）真核基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1真核基因組結(jié)構(gòu)龐大哺乳類動(dòng)物基因組DNA長(zhǎng)達(dá)3×109個(gè)bp。2單順?lè)醋诱婧嘶蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋?，即一個(gè)編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈。3重復(fù)序列在原核、真核DNA中都有重復(fù)出現(xiàn)的核苷酸序列，但在真核更普遍。根據(jù)重復(fù)頻率可將重復(fù)序列區(qū)分為高度重復(fù)序列（106次)、中度重復(fù)序列（103104)及單拷貝序

50、列。單拷貝序列在整個(gè)基因組中只出現(xiàn)一次或很少的幾次。4基因不連續(xù)性真核結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)存在不被轉(zhuǎn)錄的非編碼序列，往往是基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)。在編碼基因內(nèi)部尚有一些不為蛋白質(zhì)所編碼的間隔序列，稱內(nèi)含子，而編碼序列稱為外顯子，因此真核基因是不連續(xù)的。（二）真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)1RNA聚合酶真核RNA聚合酶有三種，即RNA pol、，分別負(fù)責(zé)三種RNA轉(zhuǎn)錄。TATA盒結(jié)合蛋白為三種聚合酶所共有。2活性染色體結(jié)構(gòu)變化（1）對(duì)核酸酶敏感。（2）DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化。 天然狀態(tài)的雙鏈DNA以負(fù)性超螺旋的構(gòu)象存在。當(dāng)基因活化時(shí)，RNA聚合酶前方的轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為正性超螺旋，后面的DNA則為負(fù)超螺旋，正性超螺旋不

51、僅阻礙核小體結(jié)構(gòu)形成，而且促進(jìn)組蛋白 H2A·H2B二聚體的釋放，有利轉(zhuǎn)錄。（3）DNA堿基修飾變化。 在真核DNA有約5的胞嘧啶被甲基化為5甲基胞嘧啶，甲基化范圍與基因表達(dá)程度是反比關(guān)系。處于轉(zhuǎn)錄活化狀態(tài)的基因CpG序列一般是低甲基化的。（4）組蛋白變化。 H1樣組蛋白減少。H2A·H2B二聚體不穩(wěn)定性增加。組蛋白修飾：最常見(jiàn)的修飾有乙?；⒎核鼗?，修飾后使核小體結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定。H3組蛋白巰基暴露。3正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)提高了蛋白-DNA相互作用的指導(dǎo)性，經(jīng)濟(jì)有效。4轉(zhuǎn)錄與翻譯間隔進(jìn)行真核細(xì)胞有細(xì)胞核及胞漿等區(qū)間分布，轉(zhuǎn)錄與翻譯在不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中進(jìn)行。5轉(zhuǎn)錄后修飾、加工（三）真

52、核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)1順式作用元件順式作用元件是特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，按功能特性，真核基因順式作用元件分為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及沉默子。（1）啟動(dòng)子。真核基因啟動(dòng)子是RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件，每一組件含720bp的DNA序列。啟動(dòng)子包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，以及一個(gè)以上的功能組件。在這些功能組件中最具典型意義的就是TATA盒，TATA盒通常位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-25至30bp，控制轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性及頻率。典型的啟動(dòng)子由TATA盒及上游的CCAAT盒和（或）GC盒組成，這類啟動(dòng)于通常具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及較高的轉(zhuǎn)錄活性。然而，還有很多啟動(dòng)子并不含TATA盒，這類啟動(dòng)子分為兩類：一類為富含G

53、C的啟動(dòng)子，最初發(fā)現(xiàn)于一類管家基因，這類啟動(dòng)于包括一個(gè)或數(shù)個(gè)分離的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)；另一類啟動(dòng)子既不含TATA盒，也沒(méi)有GC富含區(qū)，這類啟動(dòng)子可有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，但多數(shù)轉(zhuǎn)錄活性很低或根本沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性，而是在胚胎發(fā)育、組織分化或再生過(guò)程中受調(diào)節(jié)。（2）增強(qiáng)子。所謂強(qiáng)子就是遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、決定基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá)、增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，其發(fā)揮作用的方式通常與方向、距離無(wú)關(guān)，可位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游或下游。從功能上講，沒(méi)有增強(qiáng)子存在，啟動(dòng)子通常不能表現(xiàn)活性；沒(méi)有啟動(dòng)子時(shí)，增強(qiáng)子也無(wú)法發(fā)揮作用。（3）沉默子。某些基因含有負(fù)性調(diào)節(jié)元件沉默子，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。2

54、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（1）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子分類。轉(zhuǎn)錄因子，分為兩類：基本轉(zhuǎn)錄因子是RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子所必需的一組因子，為所有mRNA轉(zhuǎn)錄起動(dòng)共有特異轉(zhuǎn)錄因子為個(gè)別基因轉(zhuǎn)錄所必需，決定該基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制因子。（2）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)。所有轉(zhuǎn)錄因子至少包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域；此外，很多轉(zhuǎn)錄因子還包含一個(gè)介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域，最常見(jiàn)的是二聚化結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)合域通常由60100個(gè)氨基酸殘基組成。最常見(jiàn)的DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)形式是鋅指結(jié)構(gòu)和堿性螺旋。類似的堿性DNA結(jié)合域多見(jiàn)于堿性亮氨酸拉鏈和堿性螺旋-環(huán)-螺旋。轉(zhuǎn)錄激活域由30-100個(gè)氨基酸殘基組

55、成。根據(jù)氨基酸組成特點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄激活域又有酸性激活域、谷氨酰胺富含區(qū)域及脯氨酸富含區(qū)域。介導(dǎo)二聚化的結(jié)構(gòu)域二聚化作用與亮氨酸拉鏈、螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。3mRMA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)真核RNA聚合酶不能單獨(dú)識(shí)別、結(jié)合啟動(dòng)子，而是先由基本轉(zhuǎn)錄因子TFD組成成分TBP識(shí)別TATA盒或啟動(dòng)元件，并有TFA參與結(jié)合，形成TFD-啟動(dòng)子復(fù)合物；繼而在TGAF等參與下，RNA聚合酶與TFD、TFB聚合，形成一個(gè)功能性的前起始復(fù)合物。在幾種基本轉(zhuǎn)錄因子中，TFD是唯一具有位點(diǎn)特異的DNA結(jié)合能力的轉(zhuǎn)錄因子，在上述有序的組裝過(guò)程起關(guān)鍵性指導(dǎo)作用。這樣形成的前起始復(fù)合物尚不穩(wěn)定，也不能有效啟動(dòng)mRMA轉(zhuǎn)錄。然后由結(jié)合

56、在增強(qiáng)子上的轉(zhuǎn)錄激活因子直接或間接與TFD結(jié)合，從而影響前起始復(fù)合物的形成、穩(wěn)定性以及RNA聚合酶的活性。重組DNA技術(shù)相關(guān)概念1克隆與克隆化所謂克隆就是指同一副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化。為某一研究目的，從眾多不同的分子群體中分離的某一感興趣分子，繼而經(jīng)無(wú)性繁殖（擴(kuò)增）產(chǎn)生的很多相同分子的集合，即為分子克隆。2DNA克隆DNA克隆就是應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆又稱重組DNA。3工具酶在重組DNA技術(shù)中，常需要一些基本工具酶進(jìn)行基因操作。小結(jié)：重組DNA技術(shù)常