山羊抗小鵝瘟高免血清的制備及臨床試驗(yàn)

1、山羊抗小鵝瘟高免血清的制備及臨床應(yīng)用試驗(yàn)王文強(qiáng)1，王開(kāi)功2，田新平 3（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁554300；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)花溪3.550025；銅仁市畜牧獸醫(yī)局，貴州銅仁554300）摘要小鵝瘟是雛鵝感染鵝細(xì)小病毒 (Goose plaguevirus，GPV)，所引起的一種急性敗血型傳染病。本病病程短而且死亡率高，主要侵害1月齡以?xún)?nèi)的雛鵝和雛番鴨。10日齡以下的雛鵝發(fā)病后，其死亡率可能高達(dá)100%。目前，許多養(yǎng)鵝場(chǎng)大多使用市場(chǎng)上銷(xiāo)售的抗小鵝瘟血清對(duì)鵝進(jìn)行免疫和治療，但是市場(chǎng)上銷(xiāo)售的抗小鵝瘟血清其產(chǎn)量低、成本高，且容易導(dǎo)致某些鵝源疫病的傳播。本文采用從貴州麻江縣等地的養(yǎng)

2、鵝場(chǎng)采集的病鵝分離出的小鵝瘟野生強(qiáng)毒株接種于9日齡的鵝胚尿囊液制備了小鵝瘟病毒抗原，并用小鵝瘟病毒抗原加弗氏佐劑后，分多次皮下注射結(jié)合靜脈注射小鵝瘟病毒抗原免疫貴州黑、白山羊。頸動(dòng)脈一次性放血制備抗小鵝瘟異源高免血清，用瓊脂擴(kuò)散進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定，結(jié)果顯示其抗體效價(jià)平均都在18以上。將制備的血清與市售的抗小鵝瘟進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果市售的抗小鵝瘟血清的保護(hù)率為85%，山羊抗小鵝瘟高免血清的保護(hù)率為95%。山羊抗小鵝瘟異源高免血清具有效價(jià)高、成本低、安全性好等優(yōu)點(diǎn)。關(guān)鍵詞：小鵝瘟；山羊抗小鵝瘟高免血清；抗小鵝瘟血清；對(duì)比試驗(yàn)小鵝瘟又稱(chēng)為Derzsys病、 鵝流感、 鵝肝炎、 鵝傳染性心肌炎、鵝腸炎、鵝

3、腹水性肝腎炎，它是由小鵝瘟病毒 （Goose plague virus)，即鵝細(xì)小病毒(Gooseparvovirus , GPV)引起小鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性、敗血性、高度接觸性、傳染性強(qiáng)、病程短且死亡率高的傳染病1-4。根據(jù)貴州畜疫病志和貴州大學(xué)王開(kāi)功教授9報(bào)道，2001年3月，貴州省惠水、三都、修文等縣的養(yǎng)鵝場(chǎng)雛鵝發(fā)生了一種疫病，病鵝的臨床癥狀和病理變化與國(guó)內(nèi)的殷震和國(guó)外的Gough R. E等人10-14報(bào)道的小鵝瘟很相似。貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院疫病實(shí)驗(yàn)室對(duì)從患病的鵝群中采集的病鵝心、肝和脾等組織觸片染色鏡檢未見(jiàn)細(xì)菌，同時(shí)接種血瓊脂平板作需氧和厭氧培養(yǎng)，結(jié)果為陰性。隨后將病料進(jìn)行處

4、理接種于15日齡鵝胚尿囊腔，分離到一株小鵝瘟野生強(qiáng)毒，同時(shí)證明了貴州省已經(jīng)有本病的存在。隨著貴州省養(yǎng)鵝業(yè)的迅猛發(fā)展，小鵝瘟的發(fā)生和流行，對(duì)貴州省的養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的威脅。大多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)鵝病的發(fā)生集中在每年的34月份；3周齡的小鵝易發(fā)??；發(fā)病率為80%，死亡率高達(dá)90%100%。雖然一些主要的養(yǎng)鵝場(chǎng)對(duì)一日齡的小鵝用抗小鵝瘟血清進(jìn)行了免疫，但是隨著鵝體內(nèi)抗體的消長(zhǎng)和許多養(yǎng)殖場(chǎng)種鵝的免疫程序還不完善，小鵝瘟還是存在著威脅。應(yīng)用高免鵝制備的血清可以對(duì)小鵝瘟進(jìn)行很好的預(yù)防和治療，但是由于利用成年鵝制備高免血清產(chǎn)量低而且成本很高, 難以滿(mǎn)足生產(chǎn)上的需要。所以我們從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，參考了國(guó)內(nèi)外的一些經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，

5、用從養(yǎng)殖場(chǎng)的病鵝分離出的小鵝瘟毒株，將病毒接種鵝胚進(jìn)行病原的增殖，收集到的尿囊液，制作了小鵝瘟病毒抗原，采用多次免疫和頸動(dòng)脈一次性采血的方法制造出了適合我省預(yù)防和治療小鵝瘟的山羊抗小鵝瘟異源高免血清，并與中牧實(shí)業(yè)股份有限公司成都藥械廠(chǎng)生產(chǎn)的抗小鵝瘟血清進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)。對(duì)防治鵝細(xì)小病毒感染的發(fā)生和流行，保障貴州省養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義。1 材料與方法1.1材料 毒株 用從貴州省惠水、三都等縣的養(yǎng)殖場(chǎng)的病鵝采的心、肝、脾等病料分離出了小鵝瘟野生強(qiáng)毒株，由本實(shí)驗(yàn)室凍干保存。 胚胎 9日齡的鵝胚由實(shí)驗(yàn)室購(gòu)自烏當(dāng)養(yǎng)殖場(chǎng)未經(jīng)免疫的鵝蛋在本實(shí)驗(yàn)室自行孵化。 樣本 小鵝瘟標(biāo)準(zhǔn)抗原和陽(yáng)性血清由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)

6、物醫(yī)學(xué)系王永坤教授惠贈(zèng)；免疫鵝血清系采用小鵝瘟弱毒疫苗人工免疫成年鵝制備；其它常見(jiàn)禽病血清如新城疫病毒(NDV) 、馬立克病毒(MDV) 、減蛋綜合癥病毒( EDSV) 和傳染性法氏囊病毒( IBDV) 均由本實(shí)驗(yàn)室提供；禽流感病毒（AIV）血清購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。 試驗(yàn)用山羊 購(gòu)于清鎮(zhèn)養(yǎng)羊場(chǎng)，一頭貴州黑山羊和一頭貴州白山羊，體重30kg以上,臨床檢查健康。 試驗(yàn)用雛鵝 由銅仁市川主科技助農(nóng)有限公司提供。 抗小鵝瘟血清 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司成都藥械廠(chǎng)生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為獸藥生產(chǎn)（2007）220058090。1.2 方法1.2.1小鵝瘟抗原的制備 取病毒感染鵝胚的尿囊液，經(jīng)4000rpm離心10

7、min,去除細(xì)胞碎片，收集上清液。于上清液中加入等量氯仿，強(qiáng)烈振搖，經(jīng)4000rpm離心10min，舍去有機(jī)相和中間界面的雜質(zhì)，收集上層水相。反復(fù)抽提34次，直至兩相界面清晰。在水相中緩慢加入質(zhì)量濃度400g/L的聚乙二醇（MW6000），使其終質(zhì)量濃度達(dá)60g/L，調(diào)節(jié)氯化鈉的質(zhì)量濃度達(dá)22g/L，4靜置過(guò)夜，第二天后經(jīng)過(guò)10000rpm離心30min,舍去上清液，收集病毒沉淀物。取0.01mol/L的PBS (pH7. 2)適量懸浮病毒沉淀，加入0.1%的甲醛滅活后，即為尿囊液病毒抗原。正常鵝胚尿囊液的抗原制備同上述試驗(yàn)方法。1.2.2小鵝瘟抗原的檢測(cè) 揚(yáng)州大學(xué)提供的小鵝瘟診斷抗原、本次試

8、驗(yàn)制備的尿囊液病毒抗原、正常鵝胚尿囊液抗原,分別與小鵝瘟陽(yáng)性血清、免疫鵝血清、PBS 作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。同時(shí)取小鵝瘟病毒抗原分別與GPV、NDV、MDV、AIV、EDSV、IBDV 的血清進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。1.2.4山羊抗小鵝瘟高免血清的制備與檢驗(yàn)1.2.4.1 山羊的免疫 每頭山羊第一次皮下注射4ml病毒液弗氏不完全佐劑的小鵝瘟油佐劑疫苗；7天后進(jìn)行第二次注射，每頭山羊皮下注射4ml病毒液弗氏完全佐劑的小鵝瘟油佐劑疫苗；再過(guò)7天后進(jìn)行第三次注射，每頭山羊頸部皮下注射小鵝瘟抗原4ml/只；過(guò)7天后進(jìn)行第四次免疫，每頭山羊頸靜脈注射小鵝瘟抗原4ml/只。每次注射之前都要抽血檢驗(yàn)抗小鵝瘟高免血清的效

9、價(jià)。1.2.4.2抗小鵝瘟血清的制備 按照免疫程序完成的山羊，經(jīng)過(guò)采血檢驗(yàn)血清效價(jià)達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)采血。一般血清抗體效價(jià)高峰在最后一次免疫后的711天。采血前一天不喂飼料，只喂飲水，并在上午空腹的時(shí)候采血，以防血脂過(guò)高。采血時(shí)是在無(wú)菌環(huán)境下采用頸動(dòng)脈一次性放血，以免所制備的血清受到污染。將收集到的血液靜置于室溫下等待其自然凝固析出血清。血清沒(méi)有完全析出的可以將血液置于4冰箱內(nèi)讓其完全析出。將分離的血清用離心機(jī)離心10000rpm離心10分鐘，分離的血清加生理鹽水稀釋使稀釋后血清抗體效價(jià)達(dá)到16, 然后每毫升血清加青霉素、鏈霉素各1 000 IU , 再按0. 1加入硫柳汞, 充分振蕩搖勻, 分裝

10、于滅菌瓶中密封,貼上標(biāo)簽。 保存在-15冰箱中備用。1.2.4.3抗體效價(jià)測(cè)定 瓊脂板制備：稱(chēng)取1g瓊脂粉，加至100ml 8.5%的高滲鹽水中，煮沸使之溶解。待溶解的瓊脂溫度降至55左右的時(shí)候澆玻璃平板，每個(gè)平板澆灌的瓊脂厚度約為2mm，待瓊脂平板完全凝固后，用打孔器在瓊脂凝膠上打梅花孔，打孔之前先用一張紙做好樣本后墊在瓊脂平板下面，孔徑為2mm，中間孔和周?chē)组g的距離大約為3mm。打完孔之后將瓊脂平板在酒精燈上加熱封底。在第四次免疫后的第七天，自頸靜脈按10mL/只采血。用離心機(jī)分離血清后，將小鵝瘟高免血清作2倍比稀釋?zhuān)凑?：2、1：4、1：8、1：16、1：32等進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⑾♂尩难?/p>

11、分別加至周?chē)字?，中間孔加小鵝瘟瓊擴(kuò)抗原，每組還要在周?chē)准訕?biāo)準(zhǔn)的陰性和陽(yáng)性血清對(duì)照。加完樣后將瓊脂平板置于濕盒內(nèi)，37放置2448小時(shí)后觀(guān)察，結(jié)果顯示貴州黑山羊和貴州白山羊的抗體效價(jià)平均都在18以上。1.2.5 山羊抗小鵝瘟高免血清的安全試驗(yàn) 試驗(yàn)之前先對(duì)血清進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，取1ml的抗小鵝瘟高免血清，接種于新鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)37培養(yǎng)24小時(shí)，觀(guān)察有無(wú)細(xì)菌的生長(zhǎng)，結(jié)果為陰性時(shí)才可以用。選擇1日齡小鵝16只分為四組，腹腔注射組，腹腔注射對(duì)照組，皮下注射組，皮下注射對(duì)照組，每組4只，腹腔注射組注射高免血清0.4mL/只 ，腹腔注射對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.4mL/只。皮下注射組皮下注射高免血

12、清0.6mL/只， 皮下注射對(duì)照組皮下注射生理鹽水0.6ml/只，注射后觀(guān)察小鵝有無(wú)異常反應(yīng)，并連續(xù)觀(guān)察20天。1.2.6小鵝瘟病毒半數(shù)致死量的測(cè)定 將病毒懸液加PBS進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)瞥?0-1的小鵝瘟病毒稀釋液。隨后將10-1的稀釋液稀釋成10-2、10-3、10-4不同稀釋度的病毒。具體操作如下：取3支滅菌試管排列于試管架上，并放于冰槽中，每一支試管內(nèi)加4.5毫升滅菌的PBS，用無(wú)菌的注射器吸取10-1的小鵝瘟病毒稀釋液0.5毫升，加入第1支試管內(nèi)，棄去此注射器，將第1管內(nèi)的液體混勻，成為10-2病毒稀釋液；又取一注射器吸取10-2的病毒稀釋液0.5毫升，加入第2支試管內(nèi)，使成10-3病

13、毒稀釋液；根據(jù)這種做法稀釋10-4的小鵝瘟病毒稀釋液。然后將所得的各種稀釋度的小鵝瘟病毒感染3日齡的雛鵝，由用原病毒感染開(kāi)始，每個(gè)稀釋度感染雛鵝10只。每只雛鵝接種小鵝瘟病毒0.2ml/只。觀(guān)察15天，記錄雛鵝死亡的數(shù)量。1.2.7 對(duì)比試驗(yàn) 1.2.7.1試驗(yàn)用的材料取體重相等的一日齡雛鵝60只、用小鵝瘟病毒在鵝胚上傳四代收集的尿囊液、生理鹽水（六枝工礦集團(tuán)大華藥業(yè)有限公司）、本實(shí)驗(yàn)室研制的山羊抗小鵝瘟高免異源血清、市售抗小鵝瘟血清（中牧實(shí)業(yè)股份有限公司成都藥械廠(chǎng)生產(chǎn)；預(yù)防量：0.5ml/只；治療量：11.5ml/只）、注射用青霉素鈉80萬(wàn)單位（中諾藥業(yè)石家莊有限公司）、注射用硫酸鏈霉素10

14、0萬(wàn)單位（濟(jì)寧市洸府獸藥廠(chǎng)）、一次性注射器10ml 、2.5ml、1ml 的若干個(gè)。試驗(yàn)之前先將購(gòu)買(mǎi)的生理鹽水加熱煮沸6分鐘，冷卻后備用。1.2.7.2小鵝瘟病毒尿囊液的稀釋用10ml的一次性注射器抽取10ml尿囊液加90ml生理鹽水稀釋10倍；在稀釋10倍的尿囊液中加青霉素、鏈霉素各1000單位每毫升。用1ml的一次性注射器抽取1ml尿囊液加生理鹽水100ml稀釋100倍；在稀釋100倍的尿囊液中加青霉素、鏈霉素各1000單位每毫升。1.2.7.3操作過(guò)程選體重相等的1日齡雛鵝60只，隨機(jī)分為（A、B、C）3組每組20個(gè)。分組后將雛鵝隔離飼養(yǎng)，每組再分兩小組，每組10只，并用紅油漆做好標(biāo)志。

15、用紅外燈炮給小鵝保溫。A組全部腿部皮下注射抗小鵝瘟血清0.6ml/只；B組全部腿部皮下注射山羊抗小鵝瘟高免血清0.6ml/只；C組全部腿部皮下注射生理鹽水0.6ml/只。第二天對(duì)每組的第1小組的小鵝皮下注射稀釋10倍的尿囊液0.2ml每只；每組的第2小組皮下注射稀釋100倍的尿囊液0.5ml每只。觀(guān)察每組小鵝的發(fā)病情況和死亡數(shù)量，觀(guān)察20天。2 結(jié)果與討論2.1結(jié)果 小鵝瘟病毒的傳代增殖的結(jié)果用小鵝瘟野生強(qiáng)毒XW株通過(guò)在鵝胚上傳四代，收集了4896小時(shí)死亡的鵝胚尿囊液后，將胚體取出和正常的同日齡的鵝胚進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表2.1。對(duì)收集的尿囊液做的細(xì)菌檢驗(yàn)，結(jié)果都為陰性。表明接種的胚體不是因?yàn)榧?xì)菌

16、感染死亡，而且收集的尿囊液沒(méi)有細(xì)菌的生長(zhǎng)。多數(shù)感染鵝胚死于7296小時(shí)之間,未接種病毒的對(duì)照組鵝胚健康存活。與對(duì)照鵝胚相比較,感染胚的肝由紅褐色變?yōu)橥咙S色,嚴(yán)重病例可見(jiàn)壞死灶;心肌色澤變淡,甚至顯現(xiàn)瓷白色。胚胎發(fā)育阻滯,胚體充血出血,這是禽類(lèi)病毒感染胚胎的普遍現(xiàn)象;“肝土黃色,心肌蒼白”是小鵝瘟病毒感染胚胎的特征性病變。全部收集的尿囊液用雞紅細(xì)胞做了血凝實(shí)驗(yàn)均未顯示出血凝特性,表明分離的毒株,沒(méi)有污染禽副黏病毒。3只鵝胚在1824小時(shí)內(nèi)死亡是因?yàn)樵诮臃N尿囊液的時(shí)候針頭不小心刺破血管和胚體，導(dǎo)致鵝胚的死亡。表2.1 小鵝瘟野生強(qiáng)毒經(jīng)鵝胚增殖的結(jié)果代次接種數(shù)死亡數(shù)死亡率（%）死亡時(shí)間（d）胚胎病變

17、血凝細(xì)菌檢驗(yàn)F1221985.0（17/20）24發(fā)育阻滯F2201579.0（15/19）24胚體出血F32525100（25/25）24心肌蒼白F42828100（28/28）24肝土黃色注：“”表示無(wú)血凝現(xiàn)象；無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。有3只鵝胚在1824小時(shí)內(nèi)死亡。 尿囊液中病毒抗原的檢測(cè)結(jié)果采用小鵝瘟陽(yáng)性血清、免疫鵝血清、PBS 分別檢測(cè)本次試驗(yàn)制備的小鵝瘟病毒抗原、正常鵝胚尿囊液抗原，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.2。采用小鵝瘟陽(yáng)性血清、免疫鵝血清、PBS 分別檢測(cè)本次試驗(yàn)制備的小鵝瘟病毒抗原、正常鵝胚尿囊液抗原,結(jié)果本次試驗(yàn)制備的小鵝瘟病毒抗原與揚(yáng)州大學(xué)提供的小鵝瘟陽(yáng)性血清、免疫鵝血清出現(xiàn)沉淀線(xiàn),與PBS呈

18、陰性反應(yīng)，而且形成沉淀線(xiàn)與小鵝瘟診斷抗原相吻合,正常鵝胚尿囊液抗原與各血清均呈陰性反應(yīng)。將小鵝瘟病毒抗原與GPV血清、其他禽類(lèi)病毒的血清做交叉試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.3。交叉試驗(yàn)顯示制備的小鵝瘟病毒沉淀抗原只與小鵝瘟陽(yáng)性血清形成沉淀線(xiàn)，而與其它常見(jiàn)禽類(lèi)病毒GPV、NDV、MDV、AIV、EDSV、IBDV 的血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。表2.2 小鵝瘟病毒抗原的檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)樣本小鵝瘟標(biāo)準(zhǔn)抗原分離毒XW抗原正常鵝胚抗原小鵝瘟陽(yáng)性血清+-免疫鵝血清+-PBS-注：“+”表示出現(xiàn)沉淀線(xiàn)；“-”表示未出現(xiàn)沉淀線(xiàn)。表2.3 小鵝瘟病毒抗原與常見(jiàn)禽病血清的交叉反應(yīng)檢測(cè)樣本 GPV血清 NDV血清 MDV血清 AIV

19、血清 EDSV血清 IBDV血清小鵝瘟病 + - - - - -毒抗原注：“+”表示出現(xiàn)沉淀線(xiàn)；“-”表示未出現(xiàn)沉淀線(xiàn)。 安全試驗(yàn)的結(jié)果用山羊抗小鵝瘟高免血清接種1日齡雛鵝，觀(guān)察雛鵝有無(wú)異常反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表2.5。經(jīng)過(guò)20天的觀(guān)察試驗(yàn)的雛鵝沒(méi)有出現(xiàn)不良反應(yīng)。表2.5 山羊抗小鵝瘟高免血清的安全試驗(yàn)結(jié)果組別只數(shù)日齡注射方式用量反應(yīng) 情況實(shí)驗(yàn)組41腹腔注射0.4ml無(wú)不良反應(yīng)對(duì)照組41腹腔注射0.4ml無(wú)不良反應(yīng)實(shí)驗(yàn)組41皮下注射0.6ml無(wú)不良反應(yīng)對(duì)照組41皮下注射0.6ml無(wú)不良反應(yīng) 小鵝瘟病毒半數(shù)致死量的試驗(yàn)結(jié)果用PBS對(duì)小鵝瘟病毒尿囊液進(jìn)行稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4后感染3

20、日齡的雛鵝15天后得到的結(jié)果見(jiàn)表2.4。由于一雛鵝接種10-3稀釋度的小鵝瘟病毒液仍然能夠生存，則這一雛鵝在接種10-4的小鵝瘟病毒稀釋液時(shí)也應(yīng)當(dāng)能生存，所以在積累總計(jì)欄內(nèi)，各組應(yīng)當(dāng)存活的雛鵝的總數(shù)，是由接種較高濃度的病毒稀釋液而生存的雛鵝數(shù)，向接種較低濃度的病毒稀釋液而生存的雛鵝數(shù)累加而得的，如表2.4中箭頭所指的方向。相反的，如果一雛鵝死于10-3稀釋液的，則這一雛鵝也應(yīng)死于接種10-2、10-1等比較濃的小鵝瘟病毒稀釋液，所以統(tǒng)計(jì)死亡的雛鵝的數(shù)量時(shí)，是由接種較低濃度的病毒稀釋液致死的數(shù)目，向接種較高濃度的病毒稀釋液致死的數(shù)目累加而得的，如表2.4中箭頭所指的方向。LD50值的計(jì)算：由表2

21、.4可以知道此小鵝瘟病毒能夠致死半數(shù)雛鵝死亡的稀釋度介于10-210-3之間，而且比較接近于10-2這個(gè)稀釋度。其計(jì)算方法如下：距離比例=（高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)50）/（高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)低于50%的死亡百分?jǐn)?shù)）距離比例=（6250）/（6213）=12/49=0.245高于50%死亡的稀釋度的對(duì)數(shù)（即Log102）=2距離比例（0.245）×稀釋系數(shù)（10）的對(duì)數(shù)（即Log10）=0.2452+0.245=2.245，約為2.5，即為此小鵝瘟病毒的半數(shù)致死量，意思是指此小鵝瘟病毒的10-2.5的稀釋液可以使一批雛鵝在皮下接種0.2毫升后有50%死亡。表2.4 以不同稀釋度的小

22、鵝瘟病毒接種雛鵝的死亡情況病毒稀釋度接種鵝數(shù)健鵝數(shù)死鵝數(shù)積累總計(jì)死亡比例死亡率活 死原液10 01002727/27100%10-1101911717/1894%10-21046588/1362%10-310821322/1513%10-41010 02300/230% 山羊抗小鵝瘟高免血清與市售抗小鵝瘟血清的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果取本實(shí)驗(yàn)室制備的山羊抗小鵝瘟高免血清與中牧實(shí)業(yè)股份有限公司成都藥械廠(chǎng)生產(chǎn)的抗小鵝瘟血清進(jìn)行的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.6。試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組C組的20只雛鵝在攻毒后的第710天內(nèi)共死亡18只，有1只耐過(guò)，有1只由于雛鵝的相互擠壓被壓死，死亡率為95%（18/19），而且死亡的雛鵝

23、從外觀(guān)的臨床癥狀和剖解的病例變化都與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的小鵝瘟的臨床癥狀和剖解的病例變化很相似（見(jiàn)附圖），功毒成功。A組的20只雛鵝在注射了市售的抗小鵝瘟血清在攻毒后的1011天內(nèi)共死亡3只，保護(hù)率為85%（17/20）。B組的20只雛鵝注射山羊抗小鵝瘟高免血清的保護(hù)組在攻毒后的15天死亡1只，保護(hù)率為95%（19/20）。表2.6 山羊抗小鵝瘟高免血清與市售抗小鵝瘟血清的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果組別只數(shù)日齡抗小鵝瘟血清異源高免血清生理鹽水攻毒保護(hù)死亡稀釋倍數(shù)用量只數(shù)百分率只數(shù)百分率A1010.6-100.2880%220%1010.6-1000.5990%110%B101-0.6-100.2990%110%10

24、1-0.6-1000.510100%00%C101-0.6100.200%9100%101-0.61000.511%990%注：“-”表示沒(méi)有注射；第三組的第1小組有一只雛鵝在育雛舍內(nèi)被壓死。2.2 討論 在貴州省惠水、三都等縣的養(yǎng)鵝場(chǎng)的雛鵝發(fā)生的疫病與國(guó)內(nèi)外報(bào)道小鵝瘟的臨床癥狀和病理變化都很相似。開(kāi)始時(shí)是零星發(fā)病，兩天后大面積爆發(fā)；患病小鵝的日齡最早為3日齡，最晚到30日齡；發(fā)病率為80%，死亡率高達(dá)100%。病鵝臨床癥狀主要表現(xiàn)為：精神沉郁，無(wú)力，常臥地不起；少食或拒食，飲欲下降；甩頭，口鼻流出無(wú)色粘液，咳嗽；拉白色或黃白色稀糞，肛門(mén)四周被白色稀糞污染；發(fā)病后12天死亡，瀕死期病鵝飲欲、食

25、欲廢絕；呼吸困難，倒地抽搐死亡。對(duì)病死的小鵝進(jìn)行剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)：口腔、鼻腔中蓄積大量無(wú)色粘液；膽囊充盈，膽汁外溢；肝臟腫大且色深，質(zhì)脆，部分病鵝肝有大小不等灰白色的壞死灶；心肌及冠狀脂肪有針尖狀出血點(diǎn)；十二指腸粘膜呈彌漫性出血；特征性的病變是小腸發(fā)生急性卡他性纖維素性腸炎，特別是回腸部的腸段，整段腸粘膜壞死脫落，與纖維素性滲出物凝固形成栓子或假膜包裹腸內(nèi)容物，呈香腸樣栓塞；盲腸扁桃體腫大出血；泄殖腔粘膜輕度出血且腔內(nèi)潴留少量黃白色液體；腎臟腫大，表面有針尖大小出血點(diǎn)；腦膜充血，有少量出血點(diǎn)。鵝群發(fā)病后曾以禽霍亂疫苗緊急免疫，并用青霉素、鏈霉素、土霉素等抗菌素及磺胺類(lèi)藥物進(jìn)行治療，均未見(jiàn)療效。本實(shí)驗(yàn)

26、室對(duì)從患病的鵝群中采集的病料做細(xì)菌檢驗(yàn)，并接種鵝胚，將待檢抗原與標(biāo)準(zhǔn)提純抗小鵝瘟IgG、標(biāo)準(zhǔn)抗小鵝瘟陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)抗新城疫陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)抗傳染性法氏囊陽(yáng)性血清、健康鵝對(duì)照血清及生理鹽水作瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)。隨后將收集的尿囊液人工感染5日齡雛鵝試驗(yàn)，結(jié)果對(duì)照組的雛鵝全部存活，而實(shí)驗(yàn)組的雛鵝全部死亡，而且臨床癥狀與自然感染的小鵝瘟病例基本一致。確診此次疫病是由小鵝瘟病毒感染引起的。 采用小鵝瘟分離毒XW株通過(guò)非免疫鵝胚傳代增殖,取感染鵝胚尿囊液制備小鵝瘟病毒抗原。關(guān)于小鵝瘟病毒抗原的制備國(guó)內(nèi)資料報(bào)道了4 種方法。王永坤14等將感染的尿囊液裝入透析帶經(jīng)硅膠濃縮；郝虹15等采用質(zhì)量濃度400g/ L 飽

27、和度的硫酸銨鹽析處理；王新海16通過(guò)差速離心法提取抗原；程由銓17等使用聚乙二醇( PEG) 沉淀病毒。硅膠反透析是一種簡(jiǎn)單的濃縮處理，不能有效地除去雜蛋白質(zhì)。按照病毒學(xué)的理論，病毒一般在質(zhì)量濃度450g/ L 以上飽和度的硫酸銨鹽析中發(fā)生沉淀，400g/ L 的飽和度似不可取18。差速離心法需要使用40000r/ min 的轉(zhuǎn)速，這不是普通實(shí)驗(yàn)室的離心設(shè)備所能達(dá)到的水平。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)采用PEG(MW6000) （水溶性的非離子型聚合物）法成功制備出了小鵝瘟病毒抗原。該抗原在瓊脂擴(kuò)散的試驗(yàn)中能夠與小鵝瘟陽(yáng)性血清出現(xiàn)沉淀線(xiàn)，而且與小鵝瘟標(biāo)準(zhǔn)抗原的沉淀線(xiàn)相吻合，而且與其它常見(jiàn)禽病血清不發(fā)生交叉反應(yīng)

28、。試驗(yàn)結(jié)果表明，本次制備的小鵝瘟病毒抗原可以用于臨床免疫效果監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)貴州省小鵝瘟的研究、診斷和防制具有實(shí)用價(jià)值。2.2 .3 用于預(yù)防小鵝瘟病毒感染雛鵝常用疫苗主要分為種鵝用和雛鵝用兩種疫苗。疫苗又分為鵝胚強(qiáng)毒疫苗和鴨胚化弱毒疫苗兩種。前者用強(qiáng)毒鵝胚培養(yǎng)物作疫苗，由于是強(qiáng)毒疫苗，因此僅限于小鵝瘟流行地區(qū)使用；后者是由強(qiáng)毒株經(jīng)鴨胚傳代后毒力致弱育成的，弱毒疫苗免疫原性好，保護(hù)率高，在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)揮很大的作用。預(yù)防小鵝瘟最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法還是產(chǎn)蛋前免疫母鵝，使母鵝獲得被動(dòng)免疫。Kisary19氏研究指出，產(chǎn)蛋母鵝免疫初期產(chǎn)生IgM，進(jìn)而產(chǎn)生IgG，半衰期為6天，但是雛鵝1周齡時(shí)抗體

29、完全消失，以后就可能感染小鵝瘟。母源抗體使用強(qiáng)毒株疫苗對(duì)鵝進(jìn)行免疫，可產(chǎn)生較高水平的母源抗體，但有造成強(qiáng)毒株擴(kuò)散的危險(xiǎn)；弱毒株疫苗又存在可能因不穩(wěn)定而發(fā)生毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，造成嚴(yán)重的潛伏感染和排毒的危險(xiǎn)。所以小鵝瘟的預(yù)防和治療目前主要依靠抗血清和卵黃抗體。小鵝瘟抗血清分為同源(鵝血清)20和異源(羊、馬、牛等血清)21-23抗血清。同源血清特異性高、可用作預(yù)防和治療，但其產(chǎn)量低、成本高，且容易導(dǎo)致某些鵝源疫病的傳播。近幾年來(lái), 不斷有人研制了山羊、奶山羊和黃?？剐※Z瘟高免血清, 應(yīng)用于小鵝瘟的預(yù)防和治療,獲得了較好的效果。但是異源血清對(duì)鵝體而言是一種抗原，易產(chǎn)生排斥反應(yīng)，影響免疫效果。還有報(bào)道有開(kāi)

30、發(fā)研制基因工程活載體疫苗、基因工程亞單位疫苗等新型疫苗，此種方法可能是解決上述問(wèn)題的有效手段，而且具有廣闊的發(fā)展前景，但是制作過(guò)程很復(fù)雜，而且需要很多先進(jìn)的設(shè)備和儀器，成本高，很多實(shí)驗(yàn)室無(wú)法完成。 目前，許多養(yǎng)鵝場(chǎng)使用市場(chǎng)上銷(xiāo)售的抗小鵝瘟血清的抗體效價(jià)都存在著差異，而且有些還存在著免疫失敗的現(xiàn)象。雖然用于預(yù)防和治療小鵝瘟的疫苗和血清都存在著缺陷，但是異源抗血清產(chǎn)量高，制作過(guò)程簡(jiǎn)單，采用多次采血制備抗小鵝瘟高免血清還可以節(jié)約成本，可以批量生產(chǎn)。而且本實(shí)驗(yàn)室用從貴州省惠水、三都等縣的養(yǎng)鵝場(chǎng)采集的病料分離出的小鵝瘟野生強(qiáng)毒XW株用鵝胚尿囊液增質(zhì)制備了小鵝瘟病毒抗原，并采用多次免疫貴州黑山羊和貴州白山

31、羊制備出了抗小鵝瘟異源高免血清，其抗體效價(jià)達(dá)1：8以上。用山羊抗小鵝瘟高免血清進(jìn)行了安全試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示雛鵝未出現(xiàn)不良反應(yīng)。而且還用市場(chǎng)上銷(xiāo)售的抗小鵝瘟血清與其進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，山羊抗小鵝瘟高免血清的保護(hù)率比市售的抗小鵝瘟血清的保護(hù)率高出10%。說(shuō)明用山羊制備的抗小鵝瘟異源高免血清可以應(yīng)用于臨床預(yù)防和治療小鵝瘟。3 小結(jié)3.1 貴州省麻江分離的小鵝瘟野生強(qiáng)毒XW 株能夠在鵝胚上傳代增殖，它能夠致死鵝胚，引起相似而且非常典型的小鵝瘟胚胎病變。3.2 本次試驗(yàn)分離的小鵝瘟野生強(qiáng)毒XW 株抗原與小鵝瘟陽(yáng)性血清、免疫鵝血清出現(xiàn)沉淀線(xiàn)，與PBS呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，而且與其它常見(jiàn)禽類(lèi)病毒血清不發(fā)生

32、交叉反應(yīng)。表明本次分離的小鵝瘟野生強(qiáng)毒XW 株抗原可以用于山羊抗小鵝瘟異源高免血清的制備。3.3 安全試驗(yàn)結(jié)果顯示本次試驗(yàn)研制的山羊抗小鵝瘟異源高免血清安全有效，可以應(yīng)用于臨床對(duì)小鵝瘟的預(yù)防和治療。3.4 測(cè)定病毒的半數(shù)致死量是測(cè)定病毒毒價(jià)的一個(gè)很重要的方法，LD50在病毒和血清的中和試驗(yàn)中也起到很重要的作用。小鵝瘟病毒半數(shù)致死量的測(cè)定為對(duì)雛鵝的攻毒劑量時(shí)提供了依據(jù)。3.5 山羊抗小鵝瘟異源高免血清與市售抗小鵝瘟血清的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果顯示，山羊抗小鵝瘟高免血清的保護(hù)率比市售的抗小鵝瘟血清的保護(hù)率提高了10%，說(shuō)明抗小鵝瘟異源高免血清的保護(hù)作用保護(hù)作用較強(qiáng)，用山羊抗小鵝瘟高免血清防治小鵝瘟有較好的防

33、治效果。Study and application of High-Immunized serum fromgoat source against gosling plaguewang wen-qiangGuizhou.tongren 554300 , China )AbstractGoose Plague(GP)，an acute infectious disease lost blood type in gooes, was caused by goose parvovirus(GPV), Short course of the disease and high mortality, mainly against the less than 1 month old and young goslings Muscovy. Following the 10-day-old goslings morbidity, mortality rate could be as high as 100 percent. At present, that anti-plague serum on Goose in market was used in many Goose farm was immunized and treated to Gosli