實時定量PCR步驟詳細

1、半定量和實時定量PCR步驟實驗原理：RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-P

2、CR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。實驗步驟：Trizol法RNA提取步驟1、提取總RNA 2、逆轉錄反應 3、PCR反應以下實驗步驟僅供參考：1 樣品RNA的抽提取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30孵育2到3分鐘。4下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無

3、色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30孵育10分鐘后，于4下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4下7000rpm離心5分鐘。RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。溶解RNA沉淀 溶解RN

4、A時，先加入無RNA酶的水40l用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80待用。2 RNA質量檢測1）紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。 濃度測定A260下讀值為1表示40 µg RNA/ml。樣品RNA濃度(µg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 µg/ml。具體計算如下：RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495µl的T

5、E中，測得A260 = 0.21RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 µl，剩余RNA總量為：35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg純度檢測RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定制膠1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37

6、% 甲醛溶液(12.3 M)。10×MOPS電泳緩沖液濃度   成分0.4M   MOPS，pH 7.00.1M   乙酸鈉0.01M  EDTA灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 µl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。準備RNA樣品取3µgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10µg/ml。加熱至70孵育15分鐘使樣品變性。電泳上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。56

7、V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少23cm。紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。3樣品cDNA合成 反應體系序號反應

8、物劑量序號反應物劑量1逆轉錄buffer2l5逆轉錄MMLV0.5l2上游引物0.2l6DEPC水5l3下游引物0.2l7RNA模版2l4dNTP0.1l8總體積10l輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心?；旌弦涸诩尤肽孓D錄酶MMLV 之前先70干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5l，37水浴60分鐘。取出后立即95干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80待用。4梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（-actin）實時定量PCR-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3l按10倍稀釋（加水27l并充分混勻）為1

9、010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。 反應體系如下：標準品反應體系序號反應物劑量序號反應物劑量1SYBR Green 1 染料10l5Taq酶1l2陽性模板上游引物F0.5l6陽性模板DNA5l3陽性模板下游引物R0.5l7ddH2O32.5l4dNTP0.5l8總體積50l輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。管家基因反應體系：序號反應物劑量序號反應物劑量1SYBR Green 1 染料10l5Taq酶1l2內參照上游引物F0.5l6 待測樣品cDNA5l3內參照下游引物R0.5l7ddH2O32.5l4dNTP0.5l8總體積50l輕彈

10、管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：932分鐘，然后93 1分鐘，55 2分鐘，共40個循環(huán)。5 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。反應體系：序號反應物劑量序號反應物劑量110× PCR緩沖液2.5 ul5dNTP混合液3l2MgCl2 溶液1.5l6Taq酶1l3上游引物F0.5l7 cDNA 1l4下游引物R0.5l8加水至總體積為25l輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。35個PCR循環(huán)（941分鐘；551分

11、鐘；721分鐘）； 72ºC延伸5分鐘。PCR產物與 DNA Ladder在2瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。6 待測樣品的待測基因實時定量PCR所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。體系配置如下：序號反應物劑量序號反應物劑量1SYBR Green 1 染料10l5Taq酶2l2上游引物F1l6 待測樣品cDNA5l3下游引物R1l7ddH2O

12、30l4dNTP1l8總體積 50l輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：932分鐘預變性，然后按93 1分鐘，551分鐘，721分鐘，共40做個循環(huán)，最后727分鐘延伸。7 實時定量PCR使用引物列表引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(即錯配)。PCR實驗步驟一、組織抽提：1.取組織塊50-100用液氮在研缽中研磨成粉末2.移入玻璃勻漿器加入1ml T

13、rizol 抽打勻漿3.移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打4.冰上孵育5分鐘5.離心12,000g 4 5分鐘 取上清液移入1.5ml新離心管6.加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘7.離心<12,000g 4 10分鐘 取上層液相移入1.5ml新離心管8. 加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘9.離心<12,000g 4 5分鐘 棄去上清液10.加入1 ml 75%乙醇，震蕩11. 離心<7,500g, 4,5分鐘 棄去上清液12.室溫下使之變透明13.加入DEPC處理水10l -35l 溶解RNA（ 可保存在液氮或低溫冰箱）14.走RNA變性電泳觀察18s

14、，28s條帶，分光光度計檢測260/280吸光度比值，計算RNA濃度二、RT反應體系RT反應體系（第一步）：約20分鐘RNA抽提物 5lRadome 引物 2lRNA sin 0.5l1.       65 15分鐘2.       立即放入冰浴RT反應體系（第二步）：約2小時RNA sin 0.5l10mM dNTP 1l5×RT 緩沖液 4l25mM MgCl2 4lAMV 逆轉錄酶 3l1. 37 1.5小時2. 94 5-10分鐘3.反應物保存于-20或進行

15、PCR三PCR反應體系1)、PCR反應體系：約4.5小時25mM MgCl2 2l10×PCR 緩沖液 5l10mM dNTP 1l上下游引物10pmol/l 2.5l×2CDNA模板 2.5lddH2O 34lTaq酶 0.5l輕質石蠟油 50l 100l1.94 2分鐘，55 1分鐘，72 2分鐘 為第一個步1個循環(huán)2.94 45秒，55 40秒，72 1分鐘 為第二步30個循環(huán)3.72 10分鐘4.取出后4 5分鐘后-20保存或走電泳2)、PCR反應體系：約5小時25mM MgCl2 3l10×PCR 緩沖液 5l10mM dNTP 1l上下游引物10pmol/l 2.5l×2CDNA模板 5lddH2O 30lTaq酶 1l輕質石蠟油 50l 100l1.94 2分鐘，55 1分鐘，72 2分鐘 為