動物固體組織蛋白提取-Protocol

1、動物固體組織蛋白提取 Protocol1、前夜將磁珠及勻漿管洗凈置入 75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和勻漿管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度較快。2、裂解液配制：RIPA:PMSF=100:1,現(xiàn)配現(xiàn)用。（1000U1RIPA+10U1PMSF）。置入 4c 冰上。3、抽蛋白（應冰上進行）：a、適量組織（最好放入液氮中反復研磨成粉狀）加入裂解液中。一般 10ml 管體系中加入：7-8 粒磁珠、100mg 組織、1mlRIPA+10ulPMSF、1tabletCocktail。b、勻漿。手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的 1/3 勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起

2、倒入勻漿管中進行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次（68 分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。機器勻漿：用組織搗碎機 1000015000r/min 上下研磨制成 10%組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備（勻漿時間 10 秒/次，間隙 30 秒，連續(xù) 35 次，在冰水中進行），皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。超聲粉碎：用超聲粉碎機進行粉碎，可用 Soniprep150 型超聲波發(fā)生器以振幅 14 微米超聲處理 30 秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用 40 安培，5 秒/次，間隙 10 秒反復 35 次。反復凍融：培養(yǎng)或者分離的

3、細胞可以用以上的方法勻漿，也可以反復凍溶 3 次左右（即讓細胞加適量的低滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結(jié)冰，溶解，再結(jié)冰，再溶解，反復 3 次左右），但有部分酶活力會受影響。c、將組織勻漿轉(zhuǎn)入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf 管、離心管）。12000r/min4C5 心 15min。d、離心后 EP 管中液體分三層，提取中間無色液相，移入新的 EP 管中。可-80C 保存。4、蛋白濃度測定。a、配工作液：溶液 A:溶液 B=50:1（200ul:4ul）。需測試復孔。標本 X,則需 A 量=2*（X+1+1）*200;B=2*（X+1+1）*4。WTLOSTc、復孔，取蛋白 6ul

4、 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH2O,混勻。即 10 倍稀釋。d、取 20-25ul10 倍稀釋蛋白樣本加入 96 孔板平底板內(nèi)，再加入 200ulAB 工作液，混勻振蕩后，37Cincubate30min。注：應現(xiàn)加蛋白樣本，再加工作液。因為每次加蛋白后需換 tip,tip,再加入工作液即起反應，應縮短時間。e、酶標儀檢測 562nm 吸光度。Programf、計算蛋白濃度。根據(jù)標準曲線，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y:蛋白濃度；X:吸光度。最終蛋白濃度為：10*Y（ug/ul、mg/ml）g、蛋白樣本放-80C 凍存。大多數(shù)蛋白樣品可通過比色測定法定量。在典型

5、的蛋白測定中，化學試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計或酶標儀檢測，并與已知濃度的蛋白標準曲線作比較。博士德為大家提供兩種蛋白測定手段，每種都有其獨特的優(yōu)點。如果樣品數(shù)量較多，可以同時使用兩種測定用酶標儀自動檢測。當你選擇一種蛋白測定方法時需要考慮兩個因素：緩沖液的化學組成和檢測的蛋白量。Commassie 法（Bradford 法）：原理：在酸性條件，蛋白質(zhì)與考馬斯染料 G-250 結(jié)合，顏色從棕色變?yōu)樗{色，在 595nm 處檢測吸光值然后與標準曲線對比，即可計算出待測蛋白的濃度。BCA 法：原理：在堿性條件下，蛋白將 Cu+還原為 Cu+,Cu+與 BCA 試劑形成

6、紫色絡合物，測定其在 562nm 處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度?，F(xiàn)對這兩種方法進行比較：一、實驗材料：細胞總蛋白提取試劑盒（AR0103）M231BCA 蛋白定量試劑盒（AR0146）Commassie 改良增強型蛋白質(zhì)定量試劑盒（AR0145）二、操作步驟：Commassie 法：1 .將 BSA 凍干標準品（10mg/支）用生理鹽水或 PBS 稀釋成2000ug/ml,1000ug/ml,500ug/ml,250ug/ml,125ug/ml,62.5ug/ml,31.25ug/ml,15.625ug/ml 八個濃度的蛋白標準溶液。2.M231 用細胞總蛋白提取試劑提

7、取總蛋白。3.各取 20ul 蛋白標準品和待測 M231 樣品至相應標記的微孔板中。4.滴加 200ul 考馬斯增強型試劑（溶液 A）至每孔混勻并充分震蕩 30S5.停止震蕩，在室溫孵育樣品 10min6.在酶標儀中測量 595nm 時的吸光值。7.繪制標準曲線，再用標準曲線判斷出樣品的蛋白濃度。BCA 法：1 .按 50 體積 BCA 試劑 A 加入 1 倍體積 BCA 試劑 B 配置適量 BCA 工作液，充分混勻。2 .將 BSA 凍干標準品（10mg/支）用生理鹽水或 PBS 稀釋成2000ug/ml,1000ug/ml,500ug/ml,250ug/ml,125ug/ml,62.5ug

8、/ml,31.25ug/ml,15.625ug/ml 八個濃度的蛋白標準溶液。3 .M231 用細胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。4 .各取 20ul 蛋白標準品和待測 M231 樣品至相應標記的微孔板中。5 .滴加 200ulBCA 工作液至每孔混勻并充分震蕩 30S6 .停止震蕩，在 37 度孵育樣品 30min7 .在酶標儀中測量 562nm 時的吸光值。8 .繪制標準曲線，再用標準曲線判斷出樣品的蛋白濃度。三、實驗結(jié)果1234567Commsie去吸光值0.530.5220.4310.2620.1180.0410.001BCA 法吸光直0.8120.4440.2570.140.060.03

9、70.017其中 1 到 8 為 2000ug/ml,1000,500,250,125,62.5,31.25,15.6251 為 8 倍稀釋 M231 總蛋白，樣品 2 為 32 倍稀釋 M231 總蛋白Commassie 法:的標準濃度的 BSA 蛋白，9 為空白孔，樣品為了測試準確，應在試劑加入后的 520min 內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。由標準曲線可以算出樣品原始濃度為 14.4mg/mlCommassie 法優(yōu)點是：1 .靈敏度高，據(jù)估計比 Lowry 法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達 1ug。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)一染料復合物有更高

10、的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry 法要大的多。2.測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大名只要 2 分鐘即可完成，其顏色可以在 1 小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。3.干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry 法白 K+、Na+、Mg2+離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、疏基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺點是：1 .由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用 g 一球蛋白

11、為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。2 .仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和 0.1M 的 NaOH。（如同 0.1M 的酸干擾 Lowary 法一樣）。3 .標準曲線也有輕微的非線性，在 0-1000ug/ml 濃度范圍內(nèi)有較好線性。因而不能用 Beer 定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。BCA 法：去的 S 曲或2500由標準曲線可以算出樣品原始濃度為 14.28mg/mlBCA 法特點：1.靈敏度高，檢測濃度下限達到 25g/ml,最小檢測蛋白量達到 0.5g,待測樣品體積為 1-206。2.測定蛋白

12、濃度不(W濟3colossi整標潼線630n 間洗值一題 1雌（顆 1）受絕大部分樣品中的去污劑等化學物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達 5%的 SDS,5%的 TritonX-100,5%的 Tween20,60,80。3.在 20-2000 科 g/ml 濃度范圍內(nèi)有良好的線性關系。4.檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠小于考馬斯亮藍法蛋白定量。5.受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA 小于10mM。DTT 小于 1mM 疏基乙酉!低于 1mMBCA 法和 Commassie 法各有優(yōu)勢，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。（RadioImmunopre

13、cipitationAssay）RIPA 裂解液（RIPALysisBuffer）是一種傳統(tǒng)的細胞組織快速裂解液。RIPA 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的 Western、IP 等。RIPARIPA 使用方法對于培養(yǎng)細胞樣品：1 1 . .融解 RIPARIPA 裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSFPMSF, ,使 PMSFPMSF 的最終濃度為 1mM1mM。2 2 . .對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用 PBSPBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗）。按口 6 6 孔板每孔加入 150-250150-250 微升裂解液的比例加

14、入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞 1-1-2 2秒后，細胞就會被裂解。對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照 6 孔板每孔細胞加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成 50-100萬細胞/管，然后再裂解。裂解液用量說明：通常 6 孔板每孔細胞加入 150 微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到 200 微升或 250 微升。對于組織樣品：1.1.把組織剪切成細小的碎片。2 . .融解 RIPARIPA 裂解液，混勻。取適當

15、量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSFPMSF, ,使 PMSFPMSF 的最終濃度為 1mM1mM。3 . .按照每 2020 毫克組織加入 150-250150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。）4 .用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。5,充分裂解后，10000-14000g 離心 3-5 分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的 PAGE、Western 和免疫沉淀等操作。6.如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈 vortex 使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后

16、續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。注：RIPA 裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的復合物。在不檢測和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如 NFKB、p53 等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。各種 RIPA 的差別及用途產(chǎn)品名稱Western 及IP 細胞裂解液RIPA 裂解液（強）

17、RIPA 裂解液（中）RIPA 裂解液（弱）NP-40裂解液SDS裂解液有效裂解成分1%TritonX-1001%TritonX-100,1%deoxycholate,0.1%SDS1%NP-40,0.5%deoxycholate,0.1%SDS1%NP-40,0.25%deoxycholate1%NP-401%SDS裂解強度溫和強中溫和溫和強對膜蛋白的提取一般很好較好一般一般很好對胞漿蛋白的提取很好很好很好很好很好很好對核蛋白的提取較好很好較好較好較好很好胞漿磷酸化蛋白提取很好很好很好很好很好很好細胞核轉(zhuǎn)錄因子提取很好很好很好很好很好很好含蛋白酶抑制劑是是是是是是含磷酸酯酶抑制劑是是是是是是

18、主要用途W(wǎng)B,IP,co-IPWB,IPWB,IPWB,IP,co-IPWB,IP,co-IPWB,ChIP蛋白酶及蛋白酶抑制劑大全摘要：破碎細胞提取蛋白質(zhì)的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。以下列舉了 5 種常用的蛋白酶抑制劑和他們各自的作用特點，因為各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。蛋白酶抑制劑破碎細胞提取蛋白質(zhì)的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。以下列舉了 5 種常用的蛋白酶

19、抑制劑和他們各自的作用特點，因為各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應注意在緩沖液中加人蛋白酶抑制劑時應充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。在寶靈曼公司的目錄上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制劑表。常用抑制劑PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride(劇毒)1)抑制絲氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和疏基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);2)10mg/ml 溶于異丙醇中；3)在室溫下可保存一年；2-8C 可以存放數(shù)月之久。欲長期保存，可凍存在-20C4)工作濃度：17174ug/ml(0.11

20、.0mmol/L);儲存液濃度為 100 或 200mM5)在水液體溶液中不穩(wěn)定，必須在每一分離和純化步驟中加入新鮮的 PMSF。EDTA1)抑制金屬蛋白水解酶；2)0.5mol/L 水溶液，pH89;3)溶液在 4c 穩(wěn)定六個月以上；4)工作濃度:0.51.5mmol/L.(0.20.5mg/ml);5)加入 NaOH 調(diào)節(jié)溶液的 pH 值，否則 EDTA 不溶解。胃蛋白酶抑制劑(pepstantin)l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管緊張肽原酶，組織蛋白酶 D 和凝乳酶；2)1mg/ml 溶于甲醇中；3儲存在 4c 一周內(nèi)穩(wěn)定，-20C 穩(wěn)定 6 個月；4)1 作濃度:0.7ug/ml(1

21、umol/L)5)在水中不溶解。亮抑蛋白酶肽(leupeptin)1)抑制絲氨酸和疏基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血漿酶和組織蛋白酶 B;2)lOmg/ml 溶于水；3)儲存液 4c 穩(wěn)定一周，-20C 穩(wěn)定 6 個月；4)工作濃度 0.5mg/ml。胰蛋白酶抑制劑(aprotinin)1)抑制絲氨酸蛋白酶，如血漿酶，血管舒緩素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；2)lOmg/ml 溶于水，pH783儲存液 4c 穩(wěn)定一周，-20C 穩(wěn)定 6 個月；4)工作濃度:0.062.0ug/ml(0.010.3umol/L);5)避免反復凍融：6)在 pH12.8 時失活。蛋白酶抑制劑混合使用35ug/mlPMSF

22、絲氨酸蛋白酶抑制劑0.3mg/mlEDTA 金屬蛋白酶抑制劑0.7ug/ml 胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin)酸性蛋白酶抑制劑0.5ug/ml 亮抑蛋白肽酶(Leupeptin)廣譜蛋白酶抑制劑常用蛋白酶抑制劑表抑制劑靶蛋白酶有效濃度儲藏溶液注解Antipain木瓜酶和胰酶50心g/ml1mg/ml水溶液對胰凝蛋白酶，胃液素，纖溶酶無影響APMSF胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶10-40心g/ml或10-20aM100mmol/L水溶液毒性比PMSF低， 不能抑制胰凝蛋白酶或乙酰膽堿酯酶抑肽酶絲氨酸蛋白酶0.06-2心g/ml10mg/mlPBS溶液避免反復動凍融抑氨肽酶B氨基肽酶40心g/ml溶

23、于甲醇不能抑制短肽酶Calpain抑制劑I、nCalpain(鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶)I:17ag/mln:7ag/ml溶于乙醇可滲透薄膜抑糜骯酶素胰凝乳蛋白酶6-60心g/ml溶于DMSOB.M.綜合酶片絲氨酸， 半胱氨酸和金屬蛋白酶每10-50ml細胞提取液內(nèi)加一片不含EDTAEDTA金屬蛋白酶0.2-0.5mg/ml或0.5-1.3mmol/L500mmol/L水溶液pH=8.0抑蛋白酶醛肽絲氨酸蛋白酶， 疏基蛋白酶0.5-2gg/ml10mg/ml水溶液a2-巨球蛋白廣譜1U/ml100U/mlPBS溶液避免接觸還原劑PefablocSC(boe-hringerMannheim)絲氨酸蛋白酶0.1-1.0mg/ml或0.4-4mmol/L100mM水溶液無毒，在中性pH下較PMSF穩(wěn)定胃蛋白酶抑制劑酸性蛋白酶0.7心g/ml1mg/ml甲醇溶液PMSF絲氨酸蛋白酶17-170ag/ml10mg/ml