微波誘變育種

1、微波誘變育種微波誘變育種v微波誘變的定義微波誘變的定義v微波誘變機(jī)制微波誘變機(jī)制v微波誘變育種的基本步驟微波誘變育種的基本步驟v影響誘變效果的因素影響誘變效果的因素v微波誘變技術(shù)在菌種選育中的應(yīng)用微波誘變技術(shù)在菌種選育中的應(yīng)用微波誘變的定義微波誘變的定義v微波誘變是在廣泛開(kāi)展微波對(duì)生物，尤其是對(duì)人體微波誘變是在廣泛開(kāi)展微波對(duì)生物，尤其是對(duì)人體的潛在危害評(píng)估研究過(guò)程中，發(fā)展起來(lái)的一種新興的潛在危害評(píng)估研究過(guò)程中，發(fā)展起來(lái)的一種新興非電離電磁輻射物理誘變育種技術(shù)。非電離電磁輻射物理誘變育種技術(shù)。v現(xiàn)已應(yīng)用于農(nóng)作物、植物以及微生物育種研究中。現(xiàn)已應(yīng)用于農(nóng)作物、植物以及微生物育種研究中。v與航天誘變、

2、離子束誘變、激光誘變等新的物理誘與航天誘變、離子束誘變、激光誘變等新的物理誘變技術(shù)相比，變技術(shù)相比， 微波誘變具有可利用微波誘變具有可利用設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，易于操作易于操作，安全高效安全高效等突出優(yōu)勢(shì)。等突出優(yōu)勢(shì)。微波誘變的機(jī)制微波誘變的機(jī)制v微波微波是指頻率在是指頻率在300 MHz300 MHz300 GHz 300 GHz 范圍內(nèi)的電磁范圍內(nèi)的電磁波，對(duì)生物具有熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。目前最常用的波，對(duì)生物具有熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。目前最常用的是頻率為是頻率為2450 MHz 2450 MHz 的微波。的微波。v生物熱效應(yīng)：生物熱效應(yīng)：微波輻照引起被輻照生物迅速升溫并微波輻照引起被輻照生物

3、迅速升溫并由此導(dǎo)致各種生物功能產(chǎn)生變化的現(xiàn)象稱為生物熱由此導(dǎo)致各種生物功能產(chǎn)生變化的現(xiàn)象稱為生物熱效應(yīng)。效應(yīng)。( (滅菌滅菌) )v生物非熱效應(yīng)：生物非熱效應(yīng)：微波輻照在并沒(méi)有產(chǎn)生明顯升溫的微波輻照在并沒(méi)有產(chǎn)生明顯升溫的情況下導(dǎo)致被輻照生物發(fā)生各種生理、生化和功能情況下導(dǎo)致被輻照生物發(fā)生各種生理、生化和功能變化的現(xiàn)象稱為微波生物非熱效應(yīng)。變化的現(xiàn)象稱為微波生物非熱效應(yīng)。v微波作為微波作為交變交變高頻電磁波，可使水、蛋白質(zhì)、核苷高頻電磁波，可使水、蛋白質(zhì)、核苷酸、脂肪、碳水化合物等酸、脂肪、碳水化合物等極性極性分子隨著微波頻率產(chǎn)分子隨著微波頻率產(chǎn)生快速振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)，被固定的大分子將產(chǎn)生高速受生快速

4、振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)，被固定的大分子將產(chǎn)生高速受迫振動(dòng)，而游離的自由分子將會(huì)高速轉(zhuǎn)動(dòng)。以水為迫振動(dòng)，而游離的自由分子將會(huì)高速轉(zhuǎn)動(dòng)。以水為例，在例，在2450 MHz 2450 MHz 微波作用下，水分子能在每秒鐘微波作用下，水分子能在每秒鐘之內(nèi)發(fā)生之內(nèi)發(fā)生180180來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)24.524.510108 8 次（如圖）。次（如圖）。v這種高速振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)造成分子間強(qiáng)烈摩這種高速振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)造成分子間強(qiáng)烈摩擦，這種強(qiáng)烈的摩擦使被輻照微生物擦，這種強(qiáng)烈的摩擦使被輻照微生物DNA DNA 分子的氫鍵和堿基堆集化學(xué)力受損，分子的氫鍵和堿基堆集化學(xué)力受損，造成造成DNA DNA 立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致立體結(jié)

5、構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致變異的發(fā)生。同時(shí)這種摩擦作用又是微變異的發(fā)生。同時(shí)這種摩擦作用又是微波輻照波輻照產(chǎn)熱產(chǎn)熱的根本原因。（的根本原因。（也就是說(shuō)這也就是說(shuō)這種誘變是由微波的熱效應(yīng)引起的種誘變是由微波的熱效應(yīng)引起的）v此外，在后來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)格控制升此外，在后來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)格控制升溫的實(shí)驗(yàn)條件下（溫的實(shí)驗(yàn)條件下（生物體不產(chǎn)生明顯的溫升生物體不產(chǎn)生明顯的溫升, 或產(chǎn)生的溫升是在生物體自身溫度自然起伏或產(chǎn)生的溫升是在生物體自身溫度自然起伏的范圍內(nèi)的范圍內(nèi), 可以忽略其變化可以忽略其變化），也會(huì)使被輻照），也會(huì)使被輻照微生物微生物DNA DNA 分子的氫鍵和堿基堆集化學(xué)力受分子的氫鍵和堿基

6、堆集化學(xué)力受損或減弱，造成損或減弱，造成DNA DNA 立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致抗誘變能力減弱，甚而影響致抗誘變能力減弱，甚而影響DNA DNA 的正確復(fù)的正確復(fù)制或損傷修復(fù)過(guò)程。制或損傷修復(fù)過(guò)程。v其非熱效應(yīng)作用機(jī)制尚不明了，但微波作為其非熱效應(yīng)作用機(jī)制尚不明了，但微波作為外加交變電磁場(chǎng)，其與被輻照微生物細(xì)胞組外加交變電磁場(chǎng)，其與被輻照微生物細(xì)胞組織及其所含各類極性物質(zhì)間的分子水平作用，織及其所含各類極性物質(zhì)間的分子水平作用，可以說(shuō)是微波輻照產(chǎn)生誘變作用的根本機(jī)制可以說(shuō)是微波輻照產(chǎn)生誘變作用的根本機(jī)制所在。所在。v因此，微波輻照的作用機(jī)理是因此，微波輻照的作用機(jī)理是場(chǎng)力場(chǎng)力

7、和和轉(zhuǎn)化能轉(zhuǎn)化能的協(xié)同作用的協(xié)同作用, , 場(chǎng)力即非熱效應(yīng)場(chǎng)力即非熱效應(yīng), , 轉(zhuǎn)化能即熱轉(zhuǎn)化能即熱效應(yīng)。效應(yīng)。微波誘變育種的基本步驟微波誘變育種的基本步驟v單孢子懸液或菌懸液的制備單孢子懸液或菌懸液的制備v微波輻照微波輻照v突變株分離突變株分離v目標(biāo)突變株的篩選目標(biāo)突變株的篩選微波輻照過(guò)程微波輻照過(guò)程v微波輻照是微波誘變中最重要的一個(gè)實(shí)微波輻照是微波誘變中最重要的一個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，具體操作雖然因所采用的設(shè)備驗(yàn)環(huán)節(jié)，具體操作雖然因所采用的設(shè)備不同而不同，但不同而不同，但共同點(diǎn)共同點(diǎn)在于將受試單孢在于將受試單孢子懸液或菌懸液置于專用設(shè)備內(nèi)置容器子懸液或菌懸液置于專用設(shè)備內(nèi)置容器中或裝在平皿、試管等適

8、宜容器中置于中或裝在平皿、試管等適宜容器中置于微波爐中進(jìn)行輻照。微波爐中進(jìn)行輻照。v微波輻照會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)，致使孢子懸液微波輻照會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)，致使孢子懸液溫度迅速升高，使得微生物在未接受到溫度迅速升高，使得微生物在未接受到足夠損傷造成突變的照射量之前，由于足夠損傷造成突變的照射量之前，由于蛋白質(zhì)變性，酶失活，導(dǎo)致孢子死亡，蛋白質(zhì)變性，酶失活，導(dǎo)致孢子死亡，致死率增大。致死率增大。v因此，在實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制輻因此，在實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制輻照時(shí)間和輻照溫度。照時(shí)間和輻照溫度。v專業(yè)設(shè)備專業(yè)設(shè)備v常用設(shè)備常用設(shè)備家用微波爐家用微波爐專業(yè)設(shè)備專業(yè)設(shè)備v可精確選定微波的輸出可精確選定微波的輸出

9、功率功率和和頻率頻率，也，也可以設(shè)定輻照實(shí)驗(yàn)所需可以設(shè)定輻照實(shí)驗(yàn)所需溫度溫度并通過(guò)自動(dòng)并通過(guò)自動(dòng)化溫控系統(tǒng)進(jìn)行嚴(yán)密調(diào)控，或嚴(yán)密監(jiān)控化溫控系統(tǒng)進(jìn)行嚴(yán)密調(diào)控，或嚴(yán)密監(jiān)控溫度并在所需溫度以下完成輻照實(shí)驗(yàn)，溫度并在所需溫度以下完成輻照實(shí)驗(yàn)，適于在嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)條件下獲得微波生物非適于在嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)條件下獲得微波生物非熱效應(yīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。熱效應(yīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。常用設(shè)備常用設(shè)備v在微生物育種研究中，微波輻照大多直接用在微生物育種研究中，微波輻照大多直接用家用微波爐家用微波爐進(jìn)行，也有將家用微波爐改造成進(jìn)行，也有將家用微波爐改造成微波反應(yīng)器進(jìn)行的。家用微波爐比較便捷，微波反應(yīng)器進(jìn)行的。家用微波爐比較便捷，可用于在普通實(shí)

10、驗(yàn)室進(jìn)行輻照實(shí)驗(yàn)，可用于在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行輻照實(shí)驗(yàn)， 但通常但通常只有一種固定頻率（只有一種固定頻率（一般為一般為2450 MHz2450 MHz） 和為和為數(shù)有限的幾個(gè)固定功率檔位，因此不能按需數(shù)有限的幾個(gè)固定功率檔位，因此不能按需選擇微波頻率和功率，輸出功率和頻率也不選擇微波頻率和功率，輸出功率和頻率也不如專業(yè)設(shè)備穩(wěn)定和精確。如專業(yè)設(shè)備穩(wěn)定和精確。v同時(shí)，因?yàn)榧矣梦⒉t同時(shí)，因?yàn)榧矣梦⒉t不具備溫控系統(tǒng)不具備溫控系統(tǒng)，所，所以不能直接消除輻照產(chǎn)生的熱效應(yīng)。因此在以不能直接消除輻照產(chǎn)生的熱效應(yīng)。因此在眾多研究中采取了冷卻措施并發(fā)展了一系列眾多研究中采取了冷卻措施并發(fā)展了一系列消除熱效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方

11、法。消除熱效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法。v例如，輻照一定時(shí)間后間隔一段?；鹄鋮s時(shí)例如，輻照一定時(shí)間后間隔一段?；鹄鋮s時(shí)間再行輻照的間再行輻照的自然冷卻法自然冷卻法；輻照一定時(shí)間后；輻照一定時(shí)間后用冰或冰水冷卻一段時(shí)間再行輻照的用冰或冰水冷卻一段時(shí)間再行輻照的低溫冷低溫冷卻法卻法等。等。v這些方法均屬于微波間歇輻照實(shí)驗(yàn)方法，可這些方法均屬于微波間歇輻照實(shí)驗(yàn)方法，可通過(guò)多次間歇輻照通過(guò)多次間歇輻照累積累積微波輻照的微波輻照的非熱效應(yīng)非熱效應(yīng)。v在間歇輻照實(shí)驗(yàn)中，通?？赏ㄟ^(guò)多次間歇輻在間歇輻照實(shí)驗(yàn)中，通?？赏ㄟ^(guò)多次間歇輻照使照使累積輻照時(shí)間累積輻照時(shí)間達(dá)到所需微波輻照時(shí)間的達(dá)到所需微波輻照時(shí)間的總量要求?？偭恳?/p>

12、。v例如例如，戴劍漉等采用每輻照，戴劍漉等采用每輻照5 s 5 s 后冰上快速后冰上快速冷卻冷卻20 s 20 s 再輻照的低溫冷卻法，使最長(zhǎng)累積再輻照的低溫冷卻法，使最長(zhǎng)累積輻照時(shí)間達(dá)輻照時(shí)間達(dá)120 s120 s。影響誘變效果的因素影響誘變效果的因素v孢子種類孢子種類（休眠孢子對(duì)微波的耐受性比發(fā)芽（休眠孢子對(duì)微波的耐受性比發(fā)芽孢子強(qiáng)，致死率小，突變率高）孢子強(qiáng)，致死率小，突變率高）v輻照功率輻照功率（輻照功率的大小與所產(chǎn)生熱效應(yīng)（輻照功率的大小與所產(chǎn)生熱效應(yīng)的大小和快慢直接相關(guān)）的大小和快慢直接相關(guān)）v輻照時(shí)間輻照時(shí)間（最主要因素，可控）（最主要因素，可控）v熱效應(yīng)的消除熱效應(yīng)的消除（熱效

13、應(yīng)是使菌株致死的主要（熱效應(yīng)是使菌株致死的主要原因）原因）微波誘變技術(shù)在菌種選育中的應(yīng)微波誘變技術(shù)在菌種選育中的應(yīng)用用v單一微波誘變單一微波誘變v復(fù)合微波誘變復(fù)合微波誘變微波誘變法篩選木聚糖酶高產(chǎn)球毛殼霉菌微波誘變法篩選木聚糖酶高產(chǎn)球毛殼霉菌株株 v姚笛等姚笛等用微波誘變法篩選遺傳穩(wěn)定的木聚糖酶高產(chǎn)球毛殼霉用微波誘變法篩選遺傳穩(wěn)定的木聚糖酶高產(chǎn)球毛殼霉菌株。將制備的孢子懸液，在不同功率條件下輻照處理菌株。將制備的孢子懸液，在不同功率條件下輻照處理60 s60 s，選擇致死率在選擇致死率在8080左右的輻照功率，在此功率條件下對(duì)其進(jìn)左右的輻照功率，在此功率條件下對(duì)其進(jìn)行不同時(shí)間的微波誘變，經(jīng)初篩

14、和復(fù)篩后，采用行不同時(shí)間的微波誘變，經(jīng)初篩和復(fù)篩后，采用DNS DNS 法測(cè)定法測(cè)定木聚糖酶活性，篩選木聚糖酶高產(chǎn)菌株，并分析其傳代穩(wěn)定木聚糖酶活性，篩選木聚糖酶高產(chǎn)菌株，并分析其傳代穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在微波輻射時(shí)間性。結(jié)果顯示，在微波輻射時(shí)間80 s80 s，功率，功率240 W 240 W 條件下處條件下處理的球毛殼霉孢子，致死率為理的球毛殼霉孢子，致死率為89. 589. 5；經(jīng)誘變及菌種篩選，；經(jīng)誘變及菌種篩選，獲得獲得1 1 株木聚糖酶高產(chǎn)菌株株木聚糖酶高產(chǎn)菌株W80-8W80-8，其酶活力為，其酶活力為7 520 U 7 520 U mlml，比出發(fā)菌株提高了，比出發(fā)菌株提高了12

15、4124；經(jīng)；經(jīng)6 6 次傳代培養(yǎng)，次傳代培養(yǎng)，W80-8 W80-8 株株木聚糖酶活力未見(jiàn)明顯降低，未發(fā)生原位回復(fù)突變。木聚糖酶活力未見(jiàn)明顯降低，未發(fā)生原位回復(fù)突變。 微波結(jié)合紫外微波結(jié)合紫外 v由于紫外誘變研究工作開(kāi)展較早，方法原理研究較為透徹，由于紫外誘變研究工作開(kāi)展較早，方法原理研究較為透徹，因此紫外與微波相結(jié)合的微生物菌株誘變育種研究開(kāi)展得最因此紫外與微波相結(jié)合的微生物菌株誘變育種研究開(kāi)展得最多，其涉及的活性代謝產(chǎn)物也最豐富，如抗生素、減肥藥物多，其涉及的活性代謝產(chǎn)物也最豐富，如抗生素、減肥藥物前體、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑等，各種活性物質(zhì)的產(chǎn)能提高研究均前體、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑等，各種活性物質(zhì)的產(chǎn)能提高研究均有報(bào)道。在脂抑素（有報(bào)道。在脂抑素（lipstatinlipstatin）高產(chǎn)菌株篩選研究中，）高產(chǎn)菌株篩選研究中，韓韓俊茹等俊茹等經(jīng)紫外和微波依次復(fù)合誘變處理，并基于脂抑素的生經(jīng)紫外和微波依次復(fù)合誘變處理，并基于脂抑素的生物合成，結(jié)合使用含豆油平