浙科版選修1第一部分實驗1大腸桿菌的分離和培養(yǎng)(共25張PPT)

1、實驗1 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗目的： 1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作。 2.進行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基本進行細菌的劃線培養(yǎng)。 3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實驗原理。 一、基礎知識 ( (一一) )微生物微生物: :1.1.特點：結構都相當簡單特點：結構都相當簡單, ,個體多數(shù)十分微小個體多數(shù)十分微小. .通常要通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構有細胞結構. .且體內(nèi)一般不含有葉綠素且體內(nèi)一般不含有葉綠素. .不能進行光不能進行光合作用合作用. .2.微生物包括五類微生物包括五類病病 毒毒

2、細細 菌菌放線菌放線菌真真 菌菌原生動物原生動物(二)培養(yǎng)基1.分類(按物理形態(tài)分按物理形態(tài)分)(1)液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基(2)固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基常用的固體培養(yǎng)基常用的固體培養(yǎng)基: 瓊脂固體培養(yǎng)基瓊脂固體培養(yǎng)基. 微生物在固體培養(yǎng)基微生物在固體培養(yǎng)基 表面生長表面生長,可以形成可以形成 肉眼可見的肉眼可見的菌落菌落.2.培養(yǎng)基內(nèi)所含的基本物質培養(yǎng)基內(nèi)所含的基本物質 (1)水 (2)碳源 (3)氮源 (4)無機鹽3.培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件 (1)pH值 如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細菌需中性或微堿性 (2)特殊營養(yǎng)物質- ? 如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素 (3)氧

3、氣的含量 如:培養(yǎng)厭氧微生物時需要提供無氧的條件生長因子生長因子(三)無菌技術1、獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵、獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵: 2、無菌技術、無菌技術 的的四個方面四個方面(參看教材參看教材20頁頁)3、消毒與滅菌、消毒與滅菌(1)消毒：消毒： 概念：使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體概念：使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物。包括芽孢表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物。包括芽孢和孢子嗎？和孢子嗎？ 方法方法:a.煮沸消毒法煮沸消毒法b.巴氏消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒如牛奶的消毒c.化學藥劑消毒化學藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等酒精、氯氣

4、、石碳酸、煤酚皂溶液等d.紫外線消毒紫外線消毒(不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子)防止外來雜菌的入侵防止外來雜菌的入侵（2）滅菌）滅菌 概念：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的概念：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。微生物，包括芽孢和孢子。 方法：方法：a 灼燒滅菌灼燒滅菌 b 干熱滅菌干熱滅菌 c 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌a.灼燒滅菌灼燒滅菌微生物的接種工具微生物的接種工具 (接接種環(huán)、接種針種環(huán)、接種針)或其或其他金屬用具直接在火他金屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒焰的充分燃燒層灼燒注意適用范圍注意適用范圍b.干熱滅菌干熱滅菌 160170 ；12h能耐高溫的需

5、要保持干能耐高溫的需要保持干燥的物品燥的物品( 玻璃器皿玻璃器皿)c.高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 100kPa 121 15-30min通常用于培養(yǎng)基的滅菌通常用于培養(yǎng)基的滅菌二、實驗操作二、實驗操作 （一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 計算稱量溶化滅菌計算稱量溶化滅菌倒平板倒平板 （二）分離純化大腸桿菌（二）分離純化大腸桿菌 接種方法有：接種方法有： 劃線分離法劃線分離法和和涂布分離法涂布分離法 （三）將接種后的培養(yǎng)基和一個未接（三）將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入種的培養(yǎng)基放入37恒溫箱中培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng)12h和和24h后，觀察并記錄后，觀察并記錄三、課

6、題延伸：菌種的保藏三、課題延伸：菌種的保藏 1、斜面保藏、斜面保藏 （臨時保存臨時保存） 2、甘油保藏、甘油保藏 （長期保存長期保存）實驗1：大腸桿菌的培養(yǎng)和分離設備及用品： 滅菌鍋或高壓鍋、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直徑90mm的培養(yǎng)皿、接種環(huán)和玻璃三角刮刀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、酒精燈和超凈臺、一次性塑料手套、裝有酒精棉球的廣口瓶、鑷子、有棉塞的試管（15mm120mm）5支實驗材料：(1)50mlLB液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl 0.5g、加水50ml。(2)大腸桿菌菌種斜面(3)空白斜面 實驗步驟 (1) 滅菌滅菌：將配制好的50mlLB液體培養(yǎng)基和

7、50mlLB液體培養(yǎng)基分別裝入兩個250ml 的三角瓶中，加上封口膜，用高壓鍋進行滅菌。 (2) 制平板制平板：在酒精燈火焰旁將固體培養(yǎng)基分別倒在4個培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基鋪平皿底部，待凝，使之形成平面。 (3)接種擴大培養(yǎng)接種擴大培養(yǎng)：靠近酒精燈火焰將大腸桿菌接種到三角燒瓶的液體培養(yǎng)基中，三角燒瓶在37搖床振蕩培養(yǎng)12h。 (4) 劃線分離劃線分離：將搖床上培養(yǎng)12h的菌液在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，然后將蓋好的培養(yǎng)皿倒置，放在37恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。 (5)單菌落接種培養(yǎng)單菌落接種培養(yǎng)：在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在空白斜面上，在37下培養(yǎng)24h, 4冰箱保存。單菌落單

8、菌落實驗討論實驗討論實驗完成后，接觸過細菌的器皿應如何處理？實驗完成后，接觸過細菌的器皿應如何處理？ 實驗完成后，所有接觸過細菌的器皿都必須先高壓滅菌后再洗滌，特別是培養(yǎng)基，有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體影響人畜健康，也污染環(huán)境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄。對于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌綸30 min ,再用清水洗凈，仍可再用。封口膜也可再用。無菌技術的四個方面 （1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒 ； （2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌 ； （3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火

9、焰附近旁進行； （4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。 ( (三三) )無菌技術無菌技術返回返回倒平板倒平板討論討論: (1).培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，才能用來倒平左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？ (2).為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ (3).平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ (4).在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生

10、物嗎？為什么？底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)

11、基，造成污染。地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。返回返回1、平板劃線法、平板劃線法討論討論: (1).為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ (2).在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線

12、？ (3).在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線的末端開始劃線？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時

13、菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。染環(huán)境和感染操作者。答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。加而逐步減少，最終能得到由

14、單個細菌繁殖而來的菌落。返回返回2.稀釋涂布法稀釋涂布法: (1)系列稀釋操作:涂布平板操作涂布平板操作 討論討論:涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步步應如何進行無菌操作？應如何進行無菌操作？提示：應從操作的各個細節(jié)保證提示：應從操作的各個細節(jié)保證“無菌無菌”。例如，酒精燈與。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。要在酒精燈火焰周圍；等等。返回返回返回返回菌落： 單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，叫形態(tài)結構的子細胞群體，叫做菌落做菌落。 不同的細菌的菌落特征不同不同的細菌的菌落特征不同 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。(2)碳源碳源 可作為碳源的物質有可作為碳源的物質有:a. 含碳無機物含碳無機物: 、 、b. 含碳有機物：含碳有機物：蛋白蛋白質質 脂肪酸脂肪酸返回返回不同微生物所利用的碳源不同不同微生物所利用的碳源不同a.異養(yǎng)型微生物的碳源為