畢赤酵母的基因表達及其初步純化ppt課件

1、4A15基因在畢赤氏酵母中的分泌表達及初步純化Alade畢赤氏酵母作為表達載體的優(yōu)點1、表達效率高，遺傳穩(wěn)定性好2、結(jié)構(gòu)簡單，表達調(diào)控機理比較清楚3、有Pr加工系統(tǒng)4、培養(yǎng)簡單，成本低廉5、表達產(chǎn)物可分泌至培養(yǎng)基中而自身蛋白的分泌卻很少，利于下游的純化（畢赤氏酵母是近年來廣泛應用的真核表達系統(tǒng)。） 一、實驗材料 DH5、pPICZA 、GS115、TOP10、，pQE4A15 pMD18T載體、Pfu高保真酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶 . PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、羊抗鼠IgG -HRP、增強型HRP-DAB、底物顯色試劑盒. 基因在畢赤氏酵母中表達的簡單過程4A15基因的獲

2、取(PCR)目的基因的修飾與克隆表達載體的構(gòu)建畢赤氏酵母的線性化、電轉(zhuǎn)化與鑒定目的基因在畢赤酵母GS115中的表達重組蛋白的鑒定與分析重組 4A 15 的初步純化1、目的基因4A15獲取-PCR 在設(shè)計 N 端引物時引入Xho酶切位點及 Kex2 信號肽水解位點，并刪除 Kex2后面的 Ste3 位點Glu-Ala-Glu-Ala） 在下游引物5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC ATA 3引入終止密碼子和Xba酶切位點，目的基因4A15獲取-PCR 以 pQE4A15 為模板，進展 PCR 擴增， 擴增條件為 943 min，9430 s，5730 s，7250 s

3、，35個循環(huán)，72延伸 10 min，4保管. 1.5% 瓊脂糖分析 PCR 產(chǎn)物2、目的基因的修飾與克隆 PCR 擴增產(chǎn)物回收后+克隆載體 pMD18T 以 1：3 （V的比例通過 T4 連接酶接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5，菌落 PCR 。 分析陽性菌落：挑取 4 個陽性菌落 進行序列分析. 序列正確的命名為 p4A153、表達載體的構(gòu)建 雙酶切基因片段p4A15，用試劑盒回收，雙酶切質(zhì)質(zhì)粒pPICZaA ，回收大片段， 定向連接，連接產(chǎn)物在低鹽的LB 平板上培養(yǎng)。 挑取抗性菌落提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定。5、畢赤氏酵母GS115的電轉(zhuǎn)化與鑒定5.1電轉(zhuǎn)化 1、 線性化限制性內(nèi)切酶 Bs

4、tXI 單酶切表達載體和重組質(zhì)粒 2、電轉(zhuǎn)化電激轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GSll5 感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化條件：電壓 1 500 V，4 ms）.電轉(zhuǎn)化完成后培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化物涂布于Zeocin 100 mg /L 的 YPD 平板上，28恒溫培養(yǎng)36 h 左右，抗性平板上生長的菌落相應的命名GS115/pPICZaA 和 GS115/pPICZa4A15. 5、畢赤氏酵母GS115的電轉(zhuǎn)化與鑒定5.2轉(zhuǎn)化子的鑒定 提取抗性菌落的基因組DNA,(方法參見Invitrogen 酵母手冊). 以此基因組 DNA 為模板，pPICZaA 5 Aox1 primer 和 3 Aox1 primer 為引物進行PCR. 1.5

5、%的瓊脂糖凝膠電泳分析6、目的基因在畢赤酵母GS115中表達 挑陽性克隆單菌落接種于BMGY(含酵母粉、甘油、生物素）的培養(yǎng)基上搖床培養(yǎng)28 ，250 r /min 培養(yǎng)至 OD600 為 26） 離心收集菌體，用BMMY重懸，至OD6001 繼續(xù)搖床。. 每 24 h 向培養(yǎng)基中添加無水甲醇誘導表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中至終濃度為 1%；每 24 h取樣，離心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后進行 12%SDS-PAGE 分析. 對 GS115 和 GS115 /pPICZaA 作同樣的處理，以便于下游 SDS PAGE的分析6 、重組蛋白的鑒定與分析6.1 Western blotting將丙酮沉

6、淀后上清12%聚丙烯酰凝膠電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜1% BSA 封閉硝酸纖維膜依次加入一抗A42 抗體和二抗羊抗小鼠 HRP 標志 IgG），TBST 洗滌 5 次，HRP-DAB 底物顯色試劑盒顯色.Western Blot 原理 a Western Blot與Southern印跡雜交或Northern印跡雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針是抗體，“顯色用標記的二抗。Western Blot 原理 b 經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素膜NC膜上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物

7、學活性不變。Western Blot 原理 c 以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。 Western Blot操作步驟 1、蛋白樣品制備 2、蛋白含量的測定 3、SDSPAGE電泳 4、轉(zhuǎn)膜 5、免疫反應 6、化學發(fā)光，顯影，定影 7、凝膠圖象分析6、重組蛋白的鑒定與分析6.2 質(zhì)譜分析從考染考馬斯亮藍R250CBR-250,用于檢測Pr的氨基和羧基凝膠上切下重組蛋白帶， 進行基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析.7 、重組

8、4A15 的初步純化 挑取陽性克隆單菌落接種于 BMGY 培養(yǎng)基中28 ，250 r /min 培養(yǎng)至 OD600 為 26）， 離心收集菌體，用 BMMY 重懸，至OD6001繼續(xù)搖床。 每24 h 向培養(yǎng)基中添加無水甲醇至終濃度為 1%；培育 48 h。 離心收集上清液，分別加入固體硫酸銨至其飽和度 30% 40% 50% 60% 70%。 離心收集沉淀，取適量沉淀進行12% SDS-PAGE 分析。 并用Band Scan 軟件進行蛋白質(zhì)純度分析.蛋白質(zhì)的分離純化方法 Alade四種分離純化方法 1、根據(jù)分子大小不同進行分離純化 2 、根據(jù)溶解度不同進行分離純化 3 、根據(jù)電荷不同進行分

9、離純化 4 、利用對配體的特異親和力進行分離純化1、根據(jù)分子大小不同進行分離純化 主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時常用的方法，它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用，除去無機鹽。2、根據(jù)溶解度不同進行分離純化 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數(shù)和溫度等 常用的方法有等電點沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。3 、根據(jù)電荷不同進行分離純化 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類。 離子交換層析(IEC)是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結(jié)合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。 陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負電荷的蛋白質(zhì),被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來,其中結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來 另外,離子交換層析還用于抗凝血蛋白的提取4、利用對配體的特異親和力進行分離純化 親和層析是利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力