《分子生物學實驗》課程教學大綱

1、 分子生物學實驗課程教學大綱課程編號： 05030適用專業(yè)： 生物工程與生物技術(shù)實驗學時數(shù)： 36學時實驗學分：1教材：主要參考書：分子生物學實驗指導 徐慶華等 成棟學院立項教材 2009 一、課程說明分子生物學實驗以介紹分子生物學中的實驗方法、實驗手段和培養(yǎng)學生實驗操作技能為其主要內(nèi)容。需要以分子生物學基本理論為基礎(chǔ)，其教學目的是為了提高學生在分子生物學技術(shù)方面的動手能力，培養(yǎng)學生分析問題和解決問題的能力。通過實驗，要求學生能在原有的相關(guān)理論知識基礎(chǔ)上較全面和深入理解分子生物學基本原理， 掌握基本的分子生物學實驗方法和技巧，初步具備一定的實驗設(shè)計能力，以求為以后的學習和科研工作打下良好和扎實

2、的基礎(chǔ)。b5E2RGbCAP本實驗課在方法上力求經(jīng)典，實驗內(nèi)容涉及了質(zhì)粒DNA的提取及限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒分析；大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌；應(yīng)用多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）體外基因擴增及產(chǎn)物鑒定；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量等分子生物學的基本理論。p1EanqFDPw二、學時分配章 次標 題實驗學時每組人數(shù)備 注實驗一堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA及瓊脂糖凝膠電泳檢測62綜合實驗實驗二質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定62驗證實驗實驗三PCR技術(shù)體外擴增DNA擴增、產(chǎn)物回收及電泳檢測82驗證實驗實驗四大腸桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌82綜

3、合實驗實驗五SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量82綜合實驗三、教學內(nèi)容及教學基本要求實驗一 堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA及瓊脂糖凝膠電泳檢測一、 實驗特點實驗類型：綜合 實驗類別：專業(yè)基礎(chǔ) 計劃學時：6 每組人數(shù)：2 二、實驗目的1、掌握堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA和試劑盒提取質(zhì)粒DNA的原理和方法。 2、掌握瓊脂糖凝膠的制備及外源DNA的檢測原理。3、了解質(zhì)粒DNA的粗略定量方法。三、實驗內(nèi)容提要1、將單菌落接種于3m1含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37搖菌過夜；2、12,000rpm離心30sec，收集菌體；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振蕩懸浮菌體；4、加

4、200ul新配制的溶液II，顛倒混勻；5、溶液澄清后立即加入預冷的200u1溶液III混勻后冰上放置510 min；6、4、12,000rpm離心15min，取上清，加0.7倍異丙醇混勻，室溫靜置5min；7、12,000rpm離心10min，70%乙醇洗滌沉淀，抽干后溶于適量水或TE，-20保存?zhèn)溆谩?、取瓊脂糖0.9g，加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中，100加熱溶解；9、平衡凝膠槽：放好兩側(cè)擋板，調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離（一般高出底板0.51mm）；10、鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至50左右倒入凝膠槽，膠厚一般為5

5、8mm；DXDiTa9E3d11、待膠徹底凝固后，去掉兩側(cè)擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負極端，DNA由負極向正極移動），使液面高出凝膠23mm，小心拔出梳子；RTCrpUDGiT12、DNA樣品與載體緩沖液5:1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）；13、打開電源，調(diào)節(jié)所需電壓，電壓與凝膠的長度有關(guān)，一般使用電壓不超過5v/cm；14、據(jù)指示染料移動的位置，確定電泳是否終止；15、電泳完畢關(guān)閉電源，將凝膠放紫外燈下觀察并拍照，觀察質(zhì)粒狀態(tài)并記錄結(jié)果。四、 實驗儀器設(shè)備搖床、臺式高速離心機、微量移液器、微量EP管、低溫冰箱、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。五、 實驗操作要點1、熟練掌

6、握質(zhì)粒DNA的提取過程和注意事項。2、熟練掌握瓊脂糖凝膠的制備過程和電泳檢測DNA的方法及注意事項。實驗二 質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定一、 實驗特點實驗類型：驗證 實驗類別：專業(yè)基礎(chǔ) 計劃學時：6 每組人數(shù)：2 二、實驗目的1、掌握限制性內(nèi)切酶的特性。2、掌握對重組質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切的原理和方法。三、實驗內(nèi)容提要1、用微量移液槍向滅菌的EP管中分別加入DNA 1ug和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2 u1， 再加入去離子水使總體積為19 u1將管內(nèi)溶液混勻后加入1 u1酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底；5PC

7、zVD7HxA2、混勻反應(yīng)體系后，將EP管置于適當?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7水浴保溫2-3小時，使酶切反應(yīng)完全，置于冰箱中保存?zhèn)溆?；jLBHrnAILg3、制備瓊脂糖凝膠并電泳（選擇合適的DNA分子量標準作為酶切產(chǎn)物的大小對比），分析酶切產(chǎn)物的正確性并記錄結(jié)果，電泳方法見實驗一質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳。xHAQX74J0X四、實驗儀器設(shè)備微量移液器、微量EP管、加熱塊、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。五、 實驗操作要點1、熟練掌握酶切體系的配置及注意事項。2、熟練掌握用DNA分子量標準標定酶切產(chǎn)物的大小。實驗三 多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）體外DNA擴增、產(chǎn)物回收及電泳分析一、 實驗特點

8、實驗類型：驗證 實驗類別：專業(yè)基礎(chǔ) 計劃學時：8 每組人數(shù)：2二、實驗目的1、了解PCR基因擴增技術(shù)在DNA操作中的重要性及應(yīng)用范圍。2、熟悉PCR基因擴增的基本原理。3、掌握PCR基因擴增技術(shù)的具體操作過程。4、掌握DNA回收的基本原理和操作過程。三、實驗內(nèi)容提要1、在一個無菌的0.5ml EP離心管內(nèi)加入PCR混合液50ul混勻（包括模板1ul、反映緩沖液5ul、F1引物1ul、R1引物1ul 、dNTP1ul、Tag聚合酶1ul、ddH2O401ul）；LDAYtRyKfE2、將Eppendorf離心管放入PCR儀反應(yīng)倉中；3、設(shè)置PCR反應(yīng)條件為：94變性5min后開始以下循環(huán)，94變

9、性反應(yīng)45sec；65退火反應(yīng)45sec；72延伸反應(yīng)1 min；進行30個循環(huán)；最后72反應(yīng)7min；4 冷卻恒定；Zzz6ZB2Ltk4、PCR產(chǎn)物分析：采用1.0瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量、引物擴增的特異性，根據(jù)標準DNA的大小粗略計算PCR產(chǎn)物的大小，記錄結(jié)果，電泳方法見實驗一質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳。dvzfvkwMI15、按照試劑盒操作對PCR產(chǎn)物進行回收鑒定。四、實驗儀器設(shè)備PCR儀、微量移液器、微量離心管、臺式高速離心機、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。五、 實驗操作要點1、 熟練掌握PCR反映體系的配置及注意事項。2、 掌握反映條件的設(shè)置依據(jù)及PCR儀的程序設(shè)置。3、 掌

10、握PCR產(chǎn)物回收的基本操作過程。實驗四 大腸桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌一、 實驗特點實驗類型：綜合 實驗類別：專業(yè)基礎(chǔ) 計劃學時：8 每組人數(shù)：2二、實驗目的1、了解感受態(tài)細胞生理特性及制備條件，掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞制備方法。 2、掌握質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的原理和方法。三、實驗內(nèi)容提要1、挑取大腸桿菌單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過夜；2、取500ul菌液加到50m1 LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)23hr，至OD600為0.30.5；rqyn14ZNXI3、冰浴2030min，8,500rpm 4離心5min收集菌體，用預冷的1m180mM CaCl2懸浮；Emx

11、vxOtOco4、冰浴2030min，8,500rpm 4離心5min收集菌體，仍用預冷的200ul80mM CaC12懸浮，置于冰浴中備用(1224hr內(nèi)轉(zhuǎn)化效率最高)；SixE2yXPq55、加入1020ng質(zhì)粒，混勻，冰浴30min；6、42熱激90sec，冰浴2min；7、加入800ul LB液體培養(yǎng)基，37恢復培養(yǎng)1hr后，菌液涂于含相應(yīng)抗生素的平板，37培養(yǎng)1016hr后觀察結(jié)果，估計并計算感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率。6ewMyirQFL四、實驗儀器設(shè)備超凈工作臺、搖床、臺式高速離心機、微量移液器、微量EP管、高壓滅菌鍋、水浴鍋等。五、 實驗操作要點1、掌握大腸桿菌感受態(tài)的制備過程及注意事項

12、。2、掌握質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的過程及注意事項。實驗五 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量一、 實驗特點實驗類型：綜合 實驗類別：專業(yè)基礎(chǔ) 計劃學時：8 每組人數(shù)：2二、實驗目的1、掌握垂直板電泳的操作方法。2、掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的基本原理及鑒定方法，了解其應(yīng)用。三、實驗內(nèi)容提要1、植物蛋白質(zhì)提取方法：取100mg新鮮煙草葉片，加入液氮和石英砂，充分研磨；將粉末轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，待液氮完全揮發(fā)后，加入200ul（可根據(jù)量調(diào)節(jié)）蛋白提取buffer，振蕩5min（可在振蕩器上進行）；12500rpm，4離心20min，取上清，可-20保存?zhèn)溆?。kavU42VRUs

13、2、安裝好電泳槽；3、制備分離膠8%（ddH2O4.7ml，30%/Acr/Bis2.7ml，1.5M Tris·HCl（PH 8.8）2.5ml，10% SDS100ul，y6v3ALoS8910%APS50ul，TEMED5ul，Total10 ml），加入TEMED并混合均勻后，立即將分離膠倒入兩塊玻璃板之間，并馬上在膠面上覆蓋一層ddH2O，保持膠面水平，靜置30min至膠完全凝固；M2ub6vSTnP4、制備濃縮膠：將上層ddH2O倒去，用濾紙吸干，制備濃縮膠4%（ddH2O3.1ml，30%/Acr/Bis0.65ml，0YujCfmUCw0.5M Tris·HCl（PH 6.8）3.1ml，10% SDS100ul，10%APS30ul，TEMED5ul，Total5ml），加入TEMED混勻，立即將濃縮膠倒入兩塊玻璃板間，插上樣品梳，靜置30min至膠凝固；eUts8ZQVRd5、安裝好電泳裝置，取適量樣品上樣（樣品需提前處理：樣品：3Xloading buffer=2：1，混勻后，95煮5min，置冰上備用），加電壓80V至溴酚藍進入分離膠，加大電壓至120V，電泳至溴酚藍剛好跑出分離膠；sQ