水稻OsSsr1基因的生物信息學(xué)分析

1、水稻OsSsr1基因的生物信息學(xué)分析摘要: OsSsr1 (GeneBank登錄號(hào)為NM_001065574)是NJH12表達(dá)譜中的一個(gè)表達(dá)量上調(diào)基因,為了進(jìn)一步分析其序列特征、啟動(dòng)子序列、亞細(xì)胞定位及在水稻不同組織和各種逆境脅迫下的表達(dá)模式,通過生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行分析。序列分析表明OsSsr1的開放閱讀框?yàn)?004 bp,編碼一個(gè)由667個(gè)氨基酸組成并含有5個(gè)跨膜區(qū)的蛋白,該蛋白N端含有一個(gè)信號(hào)肽。OsSsr1基因在氷稻不同不同組織中均有表達(dá),在葉部的表達(dá)量最高,其次為根,在幼穗中的表達(dá)量最低;表達(dá)水平受干旱、高溫、高鹽、低溫、機(jī)械傷害、稻瘟病菌等的影響。前言:水稻是中國也是全世界重要的

2、糧食作物之一，鹽害是水稻生產(chǎn)中最不利的限制因素之一1-4。然而水稻在生長(zhǎng)發(fā)育過程中常常受到干旱,低溫和高鹽等非生物脅迫，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，分離鑒定水稻耐逆相關(guān)基因，培育耐逆品種，對(duì)水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義5。當(dāng)植物遭受非生物脅迫時(shí),植物會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)、生理、化學(xué)和分子上的變化。干旱、高溫和土壤鹽漬化是最常見的非生物脅迫。全球農(nóng)業(yè)用地大約22%是鹽堿地6,并且由干旱而造成的鹽堿地也在逐年增加7。植物在逆境條件下對(duì)不同環(huán)境因子響應(yīng)的方式通常會(huì)重疊。盡管對(duì)麥類植物進(jìn)行千旱和髙鹽處理的基因表達(dá)譜顯示,在不同的脅迫下響應(yīng)的基因有所差異,但是它們可能誘導(dǎo)相似的防御反應(yīng)8。一些研究結(jié)果表明

3、，來自水稻黃單胞菌的Harpin 蛋白質(zhì)的編碼基因hrf1 轉(zhuǎn)化水稻，能夠提高其對(duì)稻瘟病、水稻白葉枯病和干旱的抗性9-11。封偉等12利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsSsr1 基因轉(zhuǎn)入煙草，提高了煙草在鹽脅迫下脯氨酸的積累水平和活性氧清除能力，從而增強(qiáng)了其對(duì)NaCl 的耐受能力。雖然過量表達(dá)OsSsr1可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆能力，但其序列結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)模式仍不清楚。常閃閃等5人為探明OsSsr1基因的亞細(xì)胞定位及在水稻不同組織和各種逆境脅迫下的表達(dá)模式，通過生物信息學(xué)手段、洋蔥表皮亞細(xì)胞定位、RiceXPro 數(shù)據(jù)庫和 Real-time PCR 對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的研究，得出其啟動(dòng)子序列包含 TGACG

4、-motif、ABRE、TCA-element 和 W box 等多個(gè)與逆境相關(guān)的順式作用元件。GFP 融合表達(dá)顯示，OsSSR1 蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞膜。RiceXPro 數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)分析表明，OsSsr1 基因在水稻不同發(fā)育期的不同組織中均有表達(dá)，在葉中的表達(dá)量最高，胚中的表達(dá)量最低。Real-time PCR 結(jié)果表明，OsSsr1 表達(dá)水平受干旱、高溫、高鹽、低溫、機(jī)械傷害、稻瘟病菌、MeJA 和 ABA 的誘導(dǎo)上調(diào)。方法:查找相關(guān)文獻(xiàn),找到OsSsr1的登錄號(hào)為: NM_001065574, 登錄NCBI,輸入OsSsr1(Oryza sativa L. salt-sensitive r

5、elated gene 1,)基因的登錄號(hào),搜索OsSsr1的序列。1. 用NCBI網(wǎng)站上的BLAST-blastn(/Blast.cgi )進(jìn)行序列比對(duì)分析。 2. 用ORF Finder（/gorf/gorf.html）進(jìn)行分析，并找到序列的ORF區(qū)(開放讀碼框架)，3. 用ExPASy網(wǎng)站上的ProtParam（/protparam/）進(jìn)行預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分質(zhì)量和等電點(diǎn)。4. 用SingalP4.0（http:/www.cbs.dtu.dk/se

6、rvices/SignalP-4.0/）對(duì)OsSsr1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。5. 使用TargetP（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對(duì)OsSsr1進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。6. 使用 PredictProtein（/）來進(jìn)行螺旋和折疊的含量分析。7. 使用NNPP（/seq_tools/promoter.html）程序預(yù)測(cè)分析OsSsr1啟動(dòng)子元件。8. 使用Swiss-model（/interac

7、tive）進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。9. 使用MEGA4.0軟件中的Neibor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。10. 使用TMHMM Server v2.0（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）檢測(cè)蛋白質(zhì)的潛在跨膜區(qū)。11. 使用plantCARE（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析OsSsr1的啟動(dòng)子序列結(jié)果與分析1. 在NCBI上輸入登錄號(hào)為NM_001065574時(shí)，得到OsSsr1基因的FASTA序列為下：如圖1圖12. 使用BLAST-bl

8、astn進(jìn)行序列比對(duì)的結(jié)果如圖2圖2如上圖，根據(jù)顏色比例尺，hit的得分區(qū)間，與之比對(duì)結(jié)果相對(duì)較好的也就只有這4條，由于blast是區(qū)段比對(duì)，對(duì)于給定的序列，blast會(huì)把具有相識(shí)性的片段(hit)找出來，顯示的是hit的信息，所以要判斷兩個(gè)序列的相似性，單看hit值是不夠的。在Descriptions圖中看出E value 都是為0，而Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:J013001G11, full insert sequence的score值相對(duì)來說是最大的，而Score值表示兩序列的同源性，分值越高表明它們之間相似的程度越大，所以他們兩個(gè)的相

9、似程度是最大的。3. 序列的ORF區(qū)分析，得到的結(jié)果如下。序列分析表明， OsSsr1 完整的開放閱讀框?yàn)? 004 bp， 編碼一個(gè)由 667 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。4. 蛋白質(zhì)的分質(zhì)量和等電點(diǎn)分析如圖3、圖4.由分析結(jié)果可知：預(yù)測(cè)此蛋白質(zhì)的分子量（Molecular weight）是199973.6，理論上的等電點(diǎn)（Theoretical pI）為4.85，氨基酸的組合大概有Ala24.8%、Cys21.6%、Gly26%、Thr27.6%。不穩(wěn)定指數(shù)（）計(jì)算為42.68，所以這種蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的。脂肪指數(shù)為24.80，GRAVY的總平均為0.69。此外該蛋白質(zhì)不包含任何Trp殘基，這可能

10、導(dǎo)致在所計(jì)算的消光系數(shù)超過10的誤差?？紤]的序列的N末端為T（蘇氨酸）估計(jì)半衰期是7.2小時(shí)（哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞，在體外），大于20小時(shí)（酵母，體內(nèi)）， 大于10小時(shí)（大腸桿菌，體內(nèi)）。5. 對(duì)OsSsr1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析。如下圖5、圖6所示，輸入基因的FASTA序列，得到如下的結(jié)果. 如上圖，S值表示每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)1個(gè)S值，在結(jié)果顯示的圖表中有一個(gè)曲線顯示S值的變化趨勢(shì)，（在full模式中可以看見具體數(shù)值），信號(hào)肽區(qū)域的S值較高。C值表示剪切位點(diǎn)值。每個(gè)氨基酸會(huì)有一個(gè)C值，在剪切位點(diǎn)處C值是最高的。Y值表示Y-max綜合考慮S值和C值的一個(gè)參數(shù)，其比單獨(dú)考慮C值要更精確。因?yàn)樵谝粭l

11、系列中C值可能有不止一個(gè)較高的位點(diǎn)，但是剪切位點(diǎn)只有一個(gè)；此時(shí)的剪切位點(diǎn)就由Y-max值來推測(cè)的，為S值是陡峭的位置和具有高C值的位點(diǎn)。在上圖中position為23和24時(shí)，C值是最大的，Y值也達(dá)到了最高峰，所以此點(diǎn)為信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)。表1：信號(hào)肽分析結(jié)果文本Table 1: Signal peptide analysis textMeasurePositionValueCutoffsignal peptide?max. C240.291max. Y240.502max. S80.972mean S1-230.870S1-230.7010.450YES由表1可以看出1-23有信號(hào)肽， CTA

12、-CC D=0.701 ，D-cutoff=0.450而23或者24為信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)。6. 對(duì)OsSsr1進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。如圖7結(jié)果所示由圖7中的sequence預(yù)測(cè)可能的值是葉綠體，即序列包含CTP，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽; 線粒體，即序列包含MTP，靶向肽線粒體; 分泌途徑，即該序列含有SP信號(hào)肽;7. 螺旋和折疊的含量分析。結(jié)果如圖8.表2：蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 2: The composition of the protein secondary structureSec str typeHelixshEetLoop% in protein63.272.5534.18 從表二可以

13、看出蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)占最高的含量，其次是環(huán)的含量，而折疊結(jié)構(gòu)的含量最少，達(dá)到了2.55%， 上圖中紅色的表示Helix，螺旋結(jié)構(gòu)； 藍(lán)色表示shEet，折疊結(jié)構(gòu)；綠色表示Loop，環(huán)(轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲)。8. 分析OsSsr1啟動(dòng)子元件如圖9，在框內(nèi)輸入FASTA序列，得到圖10所示的結(jié)果。從圖10中可以看出啟動(dòng)子預(yù)測(cè)有兩種，而從2299到2349的序列的得分最高，達(dá)到0.97（最高分為1），所以它有可能是啟動(dòng)子序列：TATGGAAGGTTTAAAAGTCTCGAGAGCTCAACTGGAGATCACTACAAGAA而另一個(gè)的得分是0.93，相比第一個(gè)要小一些，排除其他因素的干擾，也有可能是啟

14、動(dòng)子元件，序列為：TGCCAGCCCCTATATATATCCCAGATTTTCTCCTTCCTTTTCTCTTGACT9. 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。根據(jù)SWISS-MODEL在線建模分析得到有三種可能的模型，分別如下圖11,圖12、圖13.從圖14中可以看出，這三個(gè)模型大部分都是一樣的，只是中間的綠色部分存在較大的差異，而model #1和model # 3中的綠色部分的相似度又極高。10. 系統(tǒng)發(fā)育樹分析；使用MEGA4.0軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。得到如下結(jié)果在利用MEGA4.0軟件中的Neibor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)，發(fā)現(xiàn)OsSsr1與0s01g0343100、0s05g0324

15、300. 0s08g0216000與另外三個(gè)功能未知的蛋白處于同一子分支上。11. 蛋白質(zhì)的潛在跨膜區(qū)分析。通過TMHMM Server v2.0在線分析得到如下圖15的結(jié)果。從圖中我們可以看出跨膜（transmembrane）只有在0-100這個(gè)位置里面有一點(diǎn)，而其他地方都沒有，在膜外的是最多的，由此可以看出此蛋白質(zhì)的潛在跨膜區(qū)的可信度是相對(duì)較低的。12. OsSsr1基因的啟動(dòng)子序列分析在plantCARE中輸入FATSTA序列，如圖16得到如圖17所示的結(jié)果；經(jīng)整理得如表3所示的結(jié)果表3 OsSsr1基因啟動(dòng)子順式元件預(yù)測(cè)Table3 Predicting cis-acting elem

16、ents of the OsSsr1 gene promoter調(diào)控序列名稱核心序列作用Name of regulatory sequencesCore sequenceFunctionTATA-boxTAATAcore promoterAAGAA-motifGTAAAGAAAnoABREACGTGGCcis-acting element involved in the abscisic acid responsivenessACEACGTGGAcis-acting element involved in light responsivenessCAAT-boxCAATcommon cis-a

17、cting element in promoter and enhancer regionsCAT-boxGCCACTcis-acting regulatory element related to meristem expressionbox SAGCCACCnoLAMP-elementCTTTATCApart of a light responsive elementTGACG-motifTACGGTCCis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsivenessG-boxCACGACcis-acting regulato

18、ry element involved in light responsivenessEIRETTCGACCelicitor-responsive elementE2Fa TTTCCCGCnoSkn-1_motifGTCATcis-acting regulatory element required for endosperm expressionO2-siteGATGACATGGcis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulationGARE-motifAAACAGAgibberellin-responsive

19、element根據(jù)NCBI上公布的日本晴全基因組序列,選取CDS區(qū)上游約1200 bp的核苷酸序列作為啟動(dòng)子進(jìn)行PlantCARE在線分析, 發(fā)現(xiàn)除含基本啟動(dòng)子元件TATA-box和CAAT-box外,還含有多個(gè)與脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,包括MeJA響應(yīng)元件TGACG-motif,光響應(yīng)MYB結(jié)合位點(diǎn)MRE;脫落酸響應(yīng)元件ABRE,水楊酸響應(yīng)元件TCA-element,真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件Box-Wl,抗病響應(yīng)兀件W box和激發(fā)子、傷、病原菌響應(yīng)兀件Box S。這些結(jié)果表明:OsSsr1基因可能正是通過這些順式作用元件參與了水稻對(duì)脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑的應(yīng)答,在植物響應(yīng)脅迫過程中發(fā)揮作用。討論水稻

20、是中國主要的糧食作物，然而高溫、低溫、干旱、病害和土壤鹽漬化等不良環(huán)境因素每年都會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)量造成極大影響，因此，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)研究其抗逆機(jī)制顯得尤為重要。其上游約1 200 bp的啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)與逆境相關(guān)的順式作用元件，當(dāng)外界存在刺激時(shí)，脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控這些誘導(dǎo)元件，可以迅速激活 OsSsr1 的表達(dá)，提高其蛋白質(zhì)表達(dá)量，為 OsSsr1 應(yīng)答逆境信號(hào)提供了依據(jù)。SingalP 預(yù)測(cè)分析顯示， OsSSR1 蛋白質(zhì) N 端有一個(gè)27個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，OsSSR1- GFP融合表達(dá)結(jié)果表明其定位于細(xì)胞膜上，推測(cè)OsSSR1可能是一個(gè)分泌蛋白質(zhì)。植物在逆境條件下， 體內(nèi)會(huì)發(fā)生

21、一系列變化以適應(yīng)脅迫環(huán)境， 如可溶性蛋白質(zhì)的增加， 細(xì)胞膜組分的改變，可溶性糖與脯氨酸含量的積累以及活性氧清除能力的增強(qiáng)等。OsSsr1 啟動(dòng)子中含有逆境相關(guān)誘導(dǎo)元件，表明了OsSsr1 基因可能在水稻脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。參考文獻(xiàn)：1. 汪宗立,劉曉忠,王志霞. 水稻耐鹽性的生理研究: 鹽逆境下水稻品種間水分和滲透調(diào)節(jié)的差異J江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1986，2( 3) : 1-102. 郭巖,陳少麟,張耕耘等. 應(yīng)用細(xì)胞工程獲得受主效基因控制的水稻耐鹽突變系J. 遺傳學(xué)報(bào)，1997，24( 2) : 122-1263. ZENG L H，SHANNON M CEffects of salinity

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