免疫檢驗(yàn)第十四章細(xì)胞因子的檢查

1、第十四章第十四章 細(xì)胞因子與細(xì)胞粘附細(xì)胞因子與細(xì)胞粘附因子檢測(cè)及應(yīng)用因子檢測(cè)及應(yīng)用由活化的免疫細(xì)胞及部分基質(zhì)細(xì)胞分泌的、主要由活化的免疫細(xì)胞及部分基質(zhì)細(xì)胞分泌的、主要介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的具有高活性、介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的具有高活性、多功能的小分子蛋白質(zhì)。多功能的小分子蛋白質(zhì)。CKs的共同特性的共同特性1.1.高效性：高效性： 靶細(xì)胞靶細(xì)胞- -受體；高親和力結(jié)合受體；高親和力結(jié)合2.2.多效性：多效性： 一一CKCK多靶多效多靶多效3.3.重疊性：重疊性： 多多CKCK一靶一效一靶一效4.4.協(xié)同性：協(xié)同性： 一一CKCK強(qiáng)化它強(qiáng)化它CKCK5.5.拮抗性：拮抗性： 一一CK

2、CK抑制它抑制它CKCK6.6.肥大細(xì)胞肥大細(xì)胞胸腺細(xì)胞胸腺細(xì)胞BIL-4 多效性多效性pleiotropy活化、活化、增殖、增殖、分化分化增殖增殖增殖增殖IL-2、 IL-4、 IL-5IL-4 + IL-5B細(xì)胞細(xì)胞IL-4IFN-g g 拮抗性拮抗性antagonism 重疊性重疊性redundancy協(xié)同性協(xié)同性synergy均有刺激均有刺激B細(xì)胞細(xì)胞增殖的功能增殖的功能更有效地誘導(dǎo)更有效地誘導(dǎo)IgE類別轉(zhuǎn)換類別轉(zhuǎn)換IFN-g g 阻斷阻斷IL-4誘導(dǎo)誘導(dǎo)類別轉(zhuǎn)化的類別轉(zhuǎn)化的作用，作用，IL-4抑制抑制IFN-g g BBB三、三、T T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子與功能細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子與功能（一

3、）（一）TH1型細(xì)胞因子：介導(dǎo)細(xì)胞免疫型細(xì)胞因子：介導(dǎo)細(xì)胞免疫 1. IFN- 2. IL-12 3. IL-18 4. IL-2（二）（二）TH2型細(xì)胞因子：介導(dǎo)體液免疫型細(xì)胞因子：介導(dǎo)體液免疫 主要分泌IL-4、IL-5等等（三）（三）TH3型細(xì)胞因子：免疫調(diào)節(jié)與免疫抑制型細(xì)胞因子：免疫調(diào)節(jié)與免疫抑制 1. TGF- : 腫瘤早晚期腫瘤早晚期 2. IL-10（四）（四） TH17型細(xì)胞因子：介導(dǎo)炎癥反應(yīng)型細(xì)胞因子：介導(dǎo)炎癥反應(yīng) 1. IL-17 2. TNF 3. IL-23第二節(jié)第二節(jié) 趨化因子及趨化因子受體的特性與功趨化因子及趨化因子受體的特性與功能能趨化因子：趨化因子：n 8 8

4、12kD12kDn 已發(fā)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)5050余個(gè)成員余個(gè)成員n 根據(jù)結(jié)構(gòu)中根據(jù)結(jié)構(gòu)中C C的位置、排列方式和數(shù)量的位置、排列方式和數(shù)量, ,分分C C、CCCC、CXCCXC、CXXXCCXXXC四類。是細(xì)胞因子中唯一作用于四類。是細(xì)胞因子中唯一作用于G G蛋白偶聯(lián)受體的超家蛋白偶聯(lián)受體的超家族成員。族成員。n 由白細(xì)胞與造血微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞分泌，具有對(duì)中性粒細(xì)由白細(xì)胞與造血微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞分泌，具有對(duì)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的趨化胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的趨化和激活活性。和激活活性。趨化因子的生物學(xué)特性趨化因子的生物學(xué)特性1 1、趨化移行效

5、應(yīng)：趨化單核細(xì)胞向炎癥部位移行、趨化移行效應(yīng)：趨化單核細(xì)胞向炎癥部位移行2 2、不但能使免疫細(xì)胞向感染部位移行，也可促使天、不但能使免疫細(xì)胞向感染部位移行，也可促使天然免疫應(yīng)答向獲得性免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)變。然免疫應(yīng)答向獲得性免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)變。3 3、趨化因子及其受體在、趨化因子及其受體在T T、B B細(xì)胞的分化發(fā)育中起重細(xì)胞的分化發(fā)育中起重要作用。要作用。4 4、不同極化的、不同極化的T T淋巴細(xì)胞表達(dá)不同的趨化因子受體。淋巴細(xì)胞表達(dá)不同的趨化因子受體。第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞粘附分子與細(xì)胞粘附分子受體的細(xì)胞粘附分子與細(xì)胞粘附分子受體的特性與功能特性與功能整合素家族最初是因此類粘附分子主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞整合

6、素家族最初是因此類粘附分子主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，使細(xì)胞得以附著而形成整體而得名。外基質(zhì)的粘附，使細(xì)胞得以附著而形成整體而得名。 1、整合素家族、整合素家族 免疫系統(tǒng)以及神經(jīng)系免疫系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)和其它生物學(xué)系統(tǒng)中，統(tǒng)和其它生物學(xué)系統(tǒng)中，許多參與抗原識(shí)別或細(xì)許多參與抗原識(shí)別或細(xì)胞間相互作用的分子，胞間相互作用的分子，具有與具有與IgIg相似的結(jié)構(gòu)特相似的結(jié)構(gòu)特征，征，即具有即具有1 1個(gè)或多個(gè)個(gè)或多個(gè)IgIg樣或樣結(jié)構(gòu)域。這些樣或樣結(jié)構(gòu)域。這些種類繁多、分布廣泛、種類繁多、分布廣泛、識(shí)別功能多樣的分子稱識(shí)別功能多樣的分子稱之為之為免疫球蛋白超家族。免疫球蛋白超家族。 2、免疫球蛋白超家

7、族、免疫球蛋白超家族選擇素家族最初被稱為外源凝集素細(xì)胞粘附分子家族（LEC-CAM家族）。 3、選擇素家族、選擇素家族 鈣粘蛋白是一類鈣離子依賴的粘附分子家族。鈣粘蛋白是一類鈣離子依賴的粘附分子家族。鈣粘蛋白在維持實(shí)體組織的形成以及在生長(zhǎng)發(fā)鈣粘蛋白在維持實(shí)體組織的形成以及在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞選擇性的育過(guò)程中細(xì)胞選擇性的相互聚集、重排相互聚集、重排有重要有重要作用。作用。4、鈣粘蛋白家族、鈣粘蛋白家族5、可溶性粘附分子、可溶性粘附分子 輔助受體和輔助活化信號(hào)輔助受體和輔助活化信號(hào)是指免疫細(xì)胞在接受抗原刺是指免疫細(xì)胞在接受抗原刺激的同時(shí)，還必須有輔助的受體接受輔助活化信號(hào)才能被激的同時(shí)，還必須有輔

8、助的受體接受輔助活化信號(hào)才能被活化?；罨?最為常見的提供輔助刺激信號(hào)的最為常見的提供輔助刺激信號(hào)的T T細(xì)胞上粘附分子結(jié)細(xì)胞上粘附分子結(jié)合抗原提呈細(xì)胞（合抗原提呈細(xì)胞（APCAPC）上相應(yīng)粘附分子有：）上相應(yīng)粘附分子有：CDCD4 4/MHC/MHC類類分子、分子、CDCD8 8/MHC/MHC類分子、類分子、CDCD2828/CD/CD8080及及CDCD8686、CDCD2 2/CD/CD5858、LFA-LFA-1/ICAM-11/ICAM-1等。等。T T細(xì)胞識(shí)別細(xì)胞識(shí)別APCAPC細(xì)胞提呈的抗原后，如缺乏粘細(xì)胞提呈的抗原后，如缺乏粘附分子提供的輔助刺激信號(hào)，則附分子提供的輔助刺激信

9、號(hào)，則T T細(xì)胞的應(yīng)答處于無(wú)能狀細(xì)胞的應(yīng)答處于無(wú)能狀態(tài)。態(tài)。 第四節(jié)第四節(jié) 臨床常用的測(cè)定方法臨床常用的測(cè)定方法生物學(xué)測(cè)定法免疫學(xué)測(cè)定法 1.1.基于基于DNADNA檢測(cè)的分子生物學(xué)測(cè)定法：檢測(cè)的分子生物學(xué)測(cè)定法： DNADNA擴(kuò)增法擴(kuò)增法 RNARNA印跡法印跡法 原位雜交法原位雜交法 核酸酶保護(hù)分析核酸酶保護(hù)分析 2.2.生物活性測(cè)定法生物活性測(cè)定法 生物學(xué)測(cè)定法分類生物學(xué)測(cè)定法分類根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性, ,應(yīng)用相應(yīng)的應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng)指示系統(tǒng), ,同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比測(cè)定同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比測(cè)定, ,從而得知從而得知樣品中細(xì)胞因子的活性水平樣品中細(xì)胞因子的活性

10、水平, ,一般以活性單位一般以活性單位(U/ml)(U/ml)表示表示生物活性測(cè)定法原理生物活性測(cè)定法原理有助于細(xì)胞因有助于細(xì)胞因子檢測(cè)的活性子檢測(cè)的活性作用作用刺激細(xì)胞增殖或集落形成的活刺激細(xì)胞增殖或集落形成的活性維持細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的特性性維持細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的特性抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或破壞細(xì)胞的效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或破壞細(xì)胞的效應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞趨化或抗病毒作用應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞趨化或抗病毒作用敏感性較高敏感性較高特異性不高特異性不高操作繁瑣操作繁瑣易受干擾易受干擾生物學(xué)活性測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)生物學(xué)活性測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)免疫學(xué)測(cè)定法免疫學(xué)測(cè)定法ELISA流式細(xì)胞分析法流式細(xì)胞分析法酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme

11、 linked enzyme linked immunospot, ELISPOTimmunospot, ELISPOT）1. 1. 雙抗體夾心法雙抗體夾心法2. 2. 雙位點(diǎn)一步法雙位點(diǎn)一步法 一、一、ELISAELISA方法方法標(biāo)本：標(biāo)本：1.1.血清、血漿、關(guān)節(jié)液、胸腔液、腦脊液、腹腔液血清、血漿、關(guān)節(jié)液、胸腔液、腦脊液、腹腔液2.2.細(xì)胞體外培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清液細(xì)胞體外培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清液敏感性偏低敏感性偏低不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。ELISAELISA特異、簡(jiǎn)便特異、簡(jiǎn)便易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)可同時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處可同

12、時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處理理細(xì)胞因子測(cè)定的首選方法細(xì)胞因子測(cè)定的首選方法二、流式細(xì)胞分析法二、流式細(xì)胞分析法1 1分離和培養(yǎng)待檢細(xì)分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞胞 2 2細(xì)胞固定、破膜細(xì)胞固定、破膜 3 3封閉非特異性結(jié)合封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)位點(diǎn) 4 4染色與分析染色與分析 基本步驟基本步驟細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測(cè)定：細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測(cè)定：細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體？區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群：區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群： Th1Th1細(xì)胞細(xì)胞 IFN-IFN- Th2 Th2細(xì)胞細(xì)胞 IL-4IL-4 三、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)三、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme lin

13、ked immunospot, ELISPOT) (enzyme linked immunospot, ELISPOT) 1 1個(gè)斑點(diǎn)代表個(gè)斑點(diǎn)代表1 1個(gè)細(xì)胞因子個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，分泌細(xì)胞，斑點(diǎn)的顏色斑點(diǎn)的顏色深淺程度與深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量細(xì)胞因子量相關(guān)。相關(guān)。基基本本原原理理ELISPOTELISPOTELISPOT方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 特異性高特異性高 操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需依賴細(xì)胞株操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需依賴細(xì)胞株 影響因素較少且易控制，重復(fù)性好，方法容易影響因素較少且易控制，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 所測(cè)定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，

14、所測(cè)定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物與其生物活性不一定呈正比活性不一定呈正比 結(jié)果與所用的抗體來(lái)源及親和力有很大的關(guān)系結(jié)果與所用的抗體來(lái)源及親和力有很大的關(guān)系 敏感性相對(duì)較低敏感性相對(duì)較低 標(biāo)本中細(xì)胞因子的可溶性受體，會(huì)影響特異性標(biāo)本中細(xì)胞因子的可溶性受體，會(huì)影響特異性抗體對(duì)細(xì)胞因子的結(jié)合抗體對(duì)細(xì)胞因子的結(jié)合四、其他檢測(cè)技術(shù)四、其他檢測(cè)技術(shù)偏振熒光檢測(cè)技術(shù)偏振熒光檢測(cè)技術(shù)激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡發(fā)光技術(shù)發(fā)光技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 細(xì)胞因子與細(xì)胞粘附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用細(xì)胞因子與細(xì)胞粘附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用細(xì)胞因子的測(cè)定主要應(yīng)用于：細(xì)胞因子的測(cè)定主要應(yīng)用于：特定

15、疾病的輔助診斷特定疾病的輔助診斷機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)估臨床疾病治療效果的監(jiān)測(cè)和指臨床疾病治療效果的監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)用藥導(dǎo)用藥疾病預(yù)防疾病預(yù)防一、臨床應(yīng)用原則一、臨床應(yīng)用原則 細(xì)胞因子和粘附分子的細(xì)胞因子和粘附分子的異質(zhì)性異質(zhì)性、功能交叉功能交叉性性和和多樣性、來(lái)源的復(fù)雜性多樣性、來(lái)源的復(fù)雜性和和組織細(xì)胞的非特組織細(xì)胞的非特異性異性，決定了在進(jìn)行這些分子檢測(cè)時(shí)，必須對(duì)，決定了在進(jìn)行這些分子檢測(cè)時(shí)，必須對(duì)方法選擇和結(jié)果判斷作出綜合考慮。方法選擇和結(jié)果判斷作出綜合考慮。 細(xì)胞因子的檢測(cè)方法多種多樣，各有利弊。細(xì)胞因子的檢測(cè)方法多種多樣，各有利弊。 高敏感性方法：特異性的降低、廢棄物難處理高敏

16、感性方法：特異性的降低、廢棄物難處理 活性測(cè)定方法：定性試驗(yàn)活性測(cè)定方法：定性試驗(yàn) 基因分析法：利于細(xì)胞內(nèi)定位分析、操作煩瑣基因分析法：利于細(xì)胞內(nèi)定位分析、操作煩瑣（一）方法的聯(lián)合應(yīng)用（一）方法的聯(lián)合應(yīng)用常用臨床標(biāo)本：抗凝全血并分離獲得單個(gè)核細(xì)胞。血清或血漿常用臨床標(biāo)本：抗凝全血并分離獲得單個(gè)核細(xì)胞。血清或血漿炎癥局部細(xì)胞因子的水平：局部分泌液炎癥局部細(xì)胞因子的水平：局部分泌液細(xì)胞因子或粘附分子的細(xì)胞內(nèi)定位檢測(cè)：相應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞因子或粘附分子的細(xì)胞內(nèi)定位檢測(cè)：相應(yīng)細(xì)胞相應(yīng)細(xì)胞因子的基因和相應(yīng)細(xì)胞因子的基因和mRNAmRNA表達(dá)：相應(yīng)細(xì)胞表達(dá)：相應(yīng)細(xì)胞療效觀察和預(yù)后判斷：疾病急性期和恢復(fù)期雙份標(biāo)本進(jìn)

17、行動(dòng)態(tài)觀療效觀察和預(yù)后判斷：疾病急性期和恢復(fù)期雙份標(biāo)本進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)測(cè)免疫熒光染色和流式細(xì)胞分析：注意待檢細(xì)胞的活性和狀態(tài)，以免疫熒光染色和流式細(xì)胞分析：注意待檢細(xì)胞的活性和狀態(tài)，以保保 證結(jié)果的特異性證結(jié)果的特異性（二）標(biāo)本的適當(dāng)選?。ǘ?biāo)本的適當(dāng)選取意義：意義：舉例：舉例： T T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞分泌相應(yīng)細(xì)胞因細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的子的 功能：功能：IL-1IL-1、 IL-2IL-2、IFN-IFN-和和GM-CSFGM-CSF Th1/Th2 Th1/Th2細(xì)胞平衡狀態(tài)：細(xì)胞平衡狀態(tài)：IL-2IL-2、IL-4IL-4、IL-10IL-10和和IFN-I

18、FN-（三）細(xì)胞因子的聯(lián)合檢測(cè)（三）細(xì)胞因子的聯(lián)合檢測(cè)二、特定疾病診斷的輔助指標(biāo)二、特定疾病診斷的輔助指標(biāo) （一）細(xì)胞因子檢測(cè)在特定疾病診斷中的意義（一）細(xì)胞因子檢測(cè)在特定疾病診斷中的意義感染性疾病、免疫炎癥、移植排斥反應(yīng)：感染性疾病、免疫炎癥、移植排斥反應(yīng)：TNFTNF、IL-1IL-1、IL-6IL-6、IFN-IFN-肝臟損傷的兩種炎癥介質(zhì)：肝臟損傷的兩種炎癥介質(zhì)：TNFTNF、IL-6IL-6活動(dòng)性結(jié)核：活動(dòng)性結(jié)核：IL-4 IL-4 ，IFN-IFN-及及IL-2 IL-2 結(jié)核性胸膜炎：結(jié)核性胸膜炎： IFN- IFN-及及IL-2 ,IL-4 IL-2 ,IL-4 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：

19、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎： TNFTNF、IL-1IL-1、 IL-6IL-6、IL-8IL-8、MCP-1MCP-1 潰瘍性結(jié)腸炎：潰瘍性結(jié)腸炎：IL-15IL-15 哮喘：哮喘：IL-5IL-5 （二）粘附分子檢測(cè)在特定疾病診斷中的意義（二）粘附分子檢測(cè)在特定疾病診斷中的意義E-E-鈣粘素：鈣粘素：表達(dá)缺失，提示胃腺癌表達(dá)缺失，提示胃腺癌及其分化程度的早期輔助診斷；突變及其分化程度的早期輔助診斷；突變與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。CD44CD44：高表達(dá)，提示腫瘤轉(zhuǎn)移：高表達(dá)，提示腫瘤轉(zhuǎn)移三、評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)、判斷治療效果及預(yù)后三、評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)、判斷治療效果及預(yù)后 TNF-：自身免疫性疾