免疫膠體金銀技術(shù)

1、第六章第六章 免疫金銀及鐵標(biāo)記技術(shù)免疫金銀及鐵標(biāo)記技術(shù) 免疫金技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史免疫金技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史v19711971年年 膠體金應(yīng)用于免疫組化膠體金應(yīng)用于免疫組化v19781978年免疫金技術(shù)檢測(cè)年免疫金技術(shù)檢測(cè)B B淋巴細(xì)胞表面抗原淋巴細(xì)胞表面抗原v19811981年免疫金銀法年免疫金銀法v19861986年彩色免疫金銀法年彩色免疫金銀法免疫膠體金銀技術(shù)免疫膠體金銀技術(shù) 一、免疫金技術(shù)一、免疫金技術(shù)二、免疫金銀法二、免疫金銀法三、彩色免疫金銀法三、彩色免疫金銀法四、免疫金和免疫金銀法的優(yōu)點(diǎn)四、免疫金和免疫金銀法的優(yōu)點(diǎn)五、免疫金銀法染色中常見(jiàn)的問(wèn)題及對(duì)策五、免疫金銀法染色中常見(jiàn)的問(wèn)題及對(duì)策六、免疫膠

2、體鐵技術(shù)六、免疫膠體鐵技術(shù)一、免疫金技術(shù)一、免疫金技術(shù)膠體金：膠體金：金的水溶液，具有一般溶膠特性。金的水溶液，具有一般溶膠特性。膠體金制備：膠體金制備：化學(xué)還原法；在一定濃度的金溶液中加入一定量的還原劑化學(xué)還原法；在一定濃度的金溶液中加入一定量的還原劑使金離子變成金原子（使金離子變成金原子（氯金酸在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，氯金酸在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)）。形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)）。膠體金顏色：膠體金顏色：用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是用還原法可以方便地從

3、氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。不同顏色的膠體金顆粒。5-20nm 5-20nm 葡萄酒紅葡萄酒紅 20-40nm 20-40nm 深紅色深紅色 60nm 60nm 橙黃色橙黃色還原劑：還原劑：白磷、乙醇、過(guò)氧化氫、枸櫞酸鈉、鞣酸等白磷、乙醇、過(guò)氧化氫、枸櫞酸鈉、鞣酸等膠體金標(biāo)記：膠體金標(biāo)記：實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。膠體金顆粒與蛋白質(zhì)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。此外，還可與葡過(guò)程。膠體金顆粒與蛋白質(zhì)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。此外，還可與葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛

4、血清萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合。白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合。(2)(2)試劑試劑 容器容器: : 酸處理洗凈酸處理洗凈配制試劑配制試劑: : 雙蒸餾水或三蒸餾水雙蒸餾水或三蒸餾水氯化金水溶液的配制：氯化金水溶液的配制：1g1g的氯化金溶解于雙蒸水中配成的氯化金溶解于雙蒸水中配成l l的水溶液；的水溶液；4 4冰箱冰箱內(nèi)保存。內(nèi)保存。白磷配制：白磷配制：在雙蒸水中切塊，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密閉保存在雙蒸水中切塊，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密閉保存 不需硅化處理可直接制備膠體金。不需硅化處理可直接制備膠體金。為了減

5、少了金顆粒的吸附作用，也可用已制備的同等大小顆粒的膠體金溶液為了減少了金顆粒的吸附作用，也可用已制備的同等大小顆粒的膠體金溶液包被玻璃器皿表面，棄去，再用雙蒸水洗凈包被玻璃器皿表面，棄去，再用雙蒸水洗凈。流水沖洗；清潔液浸泡流水沖洗；清潔液浸泡24h24h；自來(lái)水洗凈清潔液；洗潔劑洗；自來(lái)水洗凈清潔液；洗潔劑洗3 34 4次；自來(lái)次；自來(lái)水沖洗；蒸餾水洗水沖洗；蒸餾水洗3 34 4次；雙蒸水把每個(gè)器皿洗次；雙蒸水把每個(gè)器皿洗3 34 4次；烤箱干燥后備用。次；烤箱干燥后備用。1 1 制備膠體金的準(zhǔn)備制備膠體金的準(zhǔn)備（1 1）玻璃器皿的清潔）玻璃器皿的清潔2 2 膠體金的制備膠體金的制備白磷還原

6、法、抗壞血酸還原法、白磷還原法、抗壞血酸還原法、檸檬酸三鈉還原法、檸檬酸鈉檸檬酸三鈉還原法、檸檬酸鈉鞣酸還原鞣酸還原法、法、乙醇超聲波還原法、硼氫化鈉還原法、放射性膠體金制備法乙醇超聲波還原法、硼氫化鈉還原法、放射性膠體金制備法常用的方法常用的方法:2:2種種(1)(1)檸檬酸三鈉還原法檸檬酸三鈉還原法制備程序很簡(jiǎn)單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。制備程序很簡(jiǎn)單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。制備膠體金時(shí)金顆粒的大小與檸檬酸三鈉用量成反比。制備膠體金時(shí)金顆粒的大小與檸檬酸三鈉用量成反比。操作步驟：操作步驟：1 1）1ml 1ml l l氯化金加入氯化金加入100ml100ml蒸餾水中，

7、煮沸。蒸餾水中，煮沸。2 2）迅速加入）迅速加入4mll4mll檸檬酸鈉，保持沸騰狀態(tài)，攪動(dòng)至出現(xiàn)透明的橙紅色。檸檬酸鈉，保持沸騰狀態(tài)，攪動(dòng)至出現(xiàn)透明的橙紅色。3 3）自來(lái)水沖洗燒瓶，冷卻。）自來(lái)水沖洗燒瓶，冷卻。(2)(2)檸檬酸鈉檸檬酸鈉鞣酸還原法鞣酸還原法特點(diǎn)：特點(diǎn)：通過(guò)改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金，通過(guò)改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金， 且顆粒的直徑均勻一致，適合于雙標(biāo)及多標(biāo)研究。且顆粒的直徑均勻一致，適合于雙標(biāo)及多標(biāo)研究。 操作步驟：操作步驟：1 1）根據(jù)所需的膠體金顆粒分別配制）根據(jù)所需的膠體金顆粒分別配制A A液和液和B B液。液。2 2）將配制好的）將配制好

8、的A A、B B兩液在水浴內(nèi)加熱到兩液在水浴內(nèi)加熱到6060，保持溫度穩(wěn)定。，保持溫度穩(wěn)定。3 3）在電磁攪拌器上攪拌）在電磁攪拌器上攪拌A A液迅速加入液迅速加入B B液，加熱液，加熱7 710min10min至膠體至膠體 金變成葡萄酒色。金變成葡萄酒色。4) 4) 用自來(lái)水沖洗燒瓶，使之迅速冷卻。用自來(lái)水沖洗燒瓶，使之迅速冷卻。原理：原理：檸檬酸三鈉檸檬酸三鈉 主要為還原劑。主要為還原劑。 鞣酸鞣酸 還原、保護(hù)作用，決定膠體金顆粒大小形成還原、保護(hù)作用，決定膠體金顆粒大小形成。 制備膠體金時(shí)都應(yīng)注意以下各點(diǎn)：制備膠體金時(shí)都應(yīng)注意以下各點(diǎn)： 所有溶液均應(yīng)用雙蒸水配制所有溶液均應(yīng)用雙蒸水配制

9、檸檬酸鈉與鞣酸溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配檸檬酸鈉與鞣酸溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配 用于制備膠體金的燒瓶硅化需處理用于制備膠體金的燒瓶硅化需處理 在清潔干燥的燒瓶中加入少許在清潔干燥的燒瓶中加入少許1 1硅油，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶，硅油，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶， 使硅油均勻鋪展于燒瓶?jī)?nèi)壁，傾出多余硅油。使硅油均勻鋪展于燒瓶?jī)?nèi)壁，傾出多余硅油。 燒瓶置烤箱內(nèi)烘干。燒瓶置烤箱內(nèi)烘干。 上述步驟可重復(fù)上述步驟可重復(fù)2 23 3次次 3 3 蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記v原理：原理： PHPH值等于或稍偏堿性的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈值等于或稍偏堿性的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈中性中性，此，此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，

10、但蛋白時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)表面張力最大，處于微弱的水化狀態(tài)，能牢固質(zhì)表面張力最大，處于微弱的水化狀態(tài)，能牢固吸附吸附于金顆于金顆粒表面，形成蛋白層，阻止膠體金顆粒相互接觸，而使膠體粒表面，形成蛋白層，阻止膠體金顆粒相互接觸，而使膠體金處于金處于穩(wěn)定穩(wěn)定狀態(tài)；狀態(tài)； PHPH值高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶值高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷負(fù)電荷，與膠體金顆粒，與膠體金顆粒負(fù)電荷相互負(fù)電荷相互排斥排斥不能結(jié)合。不能結(jié)合。 穩(wěn)定劑：穩(wěn)定劑：牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇、明膠牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇、明膠（1 1）待標(biāo)記蛋白質(zhì)準(zhǔn)備）待標(biāo)記蛋白質(zhì)準(zhǔn)備透析除

11、鹽透析除鹽除去蛋白質(zhì)內(nèi)多余電解質(zhì)，過(guò)高的鹽類物質(zhì)會(huì)降低膠體金顆粒的電位，影除去蛋白質(zhì)內(nèi)多余電解質(zhì)，過(guò)高的鹽類物質(zhì)會(huì)降低膠體金顆粒的電位，影響蛋白質(zhì)吸附。響蛋白質(zhì)吸附。方法方法:蛋白質(zhì)置于透析袋直接放入雙蒸水或極低濃度鹽水透析蛋白質(zhì)置于透析袋直接放入雙蒸水或極低濃度鹽水透析去除蛋白沉淀去除蛋白沉淀低溫保存的蛋白質(zhì)或抗體易形成聚合物，聚合物對(duì)標(biāo)記過(guò)程及免疫金探針低溫保存的蛋白質(zhì)或抗體易形成聚合物，聚合物對(duì)標(biāo)記過(guò)程及免疫金探針的穩(wěn)定性有影響，標(biāo)記前離心除去聚合物。的穩(wěn)定性有影響，標(biāo)記前離心除去聚合物。待標(biāo)記蛋白質(zhì)最適穩(wěn)定量的測(cè)定待標(biāo)記蛋白質(zhì)最適穩(wěn)定量的測(cè)定光電比色法、目測(cè)法光電比色法、目測(cè)法（2 2

12、）膠體金）膠體金PHPH值調(diào)整值調(diào)整 標(biāo)記前將膠體金溶液的標(biāo)記前將膠體金溶液的PHPH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿 （3 3）蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記）蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記 （1 1）根據(jù)標(biāo)記膠體金的總量計(jì)算所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。）根據(jù)標(biāo)記膠體金的總量計(jì)算所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。（2 2）在電磁攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中（）在電磁攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中（pHpH已調(diào)至已調(diào)至PIPI超過(guò)超過(guò)0.5pH0.5pH），逐滴加入蛋白質(zhì)，），逐滴加入蛋白質(zhì)，1mg1mg的蛋白質(zhì)大約的蛋白質(zhì)大約5min5min加完。加完。（3 3）加入）加入5%5%的

13、牛血清白蛋白使其終濃度為的牛血清白蛋白使其終濃度為1%1%，或加入，或加入3%3%聚乙二聚乙二醇使其終濃度為醇使其終濃度為0.05%, 0.05%, 前者前者穩(wěn)定膠體金的效果好于后者。穩(wěn)定膠體金的效果好于后者。（4 4）將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋，扎緊，放入蔗糖或硅膠中）將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋，扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮到原體積的濃縮到原體積的1/101/10量，后純化。量，后純化。 離心法純化時(shí)，不要濃縮。離心法純化時(shí)，不要濃縮。 （4 4） 膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化 目的：目的：除去未標(biāo)記蛋白、未標(biāo)價(jià)膠體金、聚合物。除去未標(biāo)記蛋白、未標(biāo)價(jià)膠體金、聚合物。 方法：方法

14、：高速與超速離心法、凝膠過(guò)濾法高速與超速離心法、凝膠過(guò)濾法 1 1）高速與超速離心法）高速與超速離心法 1 1）將標(biāo)記的大于）將標(biāo)記的大于10nm10nm的膠體金溶液的膠體金溶液高速高速離心機(jī)離心離心機(jī)離心15min15min，吸上清，棄沉淀，去除大的聚合物。吸上清，棄沉淀，去除大的聚合物。 2 2）小于）小于10nm10nm顆粒的膠體金用顆粒的膠體金用超速超速離心機(jī)離心，在離心機(jī)離心，在44離心離心1h1h左左右，棄上清，將沉淀以右，棄上清，將沉淀以TBSTBS溶解，重復(fù)離心溶解，重復(fù)離心2 23 3次，沉淀溶于次，沉淀溶于TBSTBS中中。44保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?為了得到顆粒均勻一致的免

15、疫金試劑，上述粗提制劑可用為了得到顆粒均勻一致的免疫金試劑，上述粗提制劑可用1010- -30%30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集。蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集。 2) 2) 凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法 特點(diǎn)：特點(diǎn)：簡(jiǎn)便，顆粒比較均勻，簡(jiǎn)便，顆粒比較均勻，不易凝集，克服了離心不易凝集，克服了離心方法膠體金顆粒易凝集方法膠體金顆粒易凝集的弱點(diǎn)。必須用牛血清的弱點(diǎn)。必須用牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。白蛋白作穩(wěn)定劑。操作過(guò)程：操作過(guò)程：1 1）濃縮的膠體金離心取上清）濃縮的膠體金離心取上清2 2）加樣體積為柱狀體積的）加樣體積為柱狀體積的1/101/103) 3) 丙烯葡萄糖丙烯葡萄糖S-4

16、00S-400裝柱，裝柱，TBSTBS平平 衡層析柱衡層析柱4 4）TBSTBS洗脫，注意顏色變化。洗脫，注意顏色變化。 （5 5） 免疫金染色法免疫金染色法19781978年，首次應(yīng)用免疫金探針檢測(cè)年，首次應(yīng)用免疫金探針檢測(cè)B B淋巴細(xì)胞表面抗原，建淋巴細(xì)胞表面抗原，建立了用于光鏡水平的立了用于光鏡水平的免疫金法（免疫金法（IGSIGS）。）。特點(diǎn)：特點(diǎn)：染色程序簡(jiǎn)便，不要顯色染色程序簡(jiǎn)便，不要顯色; ;能檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原。能檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原。要求要求: :金顆粒的直徑大于金顆粒的直徑大于20nm20nm，且濃度較高。，且濃度較高。一般都采用間接法。一般都采用間接法。（1 1

17、）石蠟切片）石蠟切片脫蠟至水。脫蠟至水。（2 2）胰蛋白酶消化或尿素消化。）胰蛋白酶消化或尿素消化。（3 3）用雙蒸水振洗）用雙蒸水振洗5 52 2。（4 4）用）用0.02mol/l TBS pH8.20.02mol/l TBS pH8.2振洗振洗10102 2。（5 5）1% 1% 卵蛋白（卵蛋白（EAEA）封閉）封閉10min10min。（6 6）稀釋）稀釋鼠抗鼠抗HBsAgHBsAg單克隆抗體單克隆抗體（TBS TBS ），），44過(guò)夜。過(guò)夜。（7 7）0.02mol/l TBSpH8.20.02mol/l TBSpH8.2振洗振洗10102 2。（8 8）1% EA1% EA封閉封閉

18、10min10min。 IGSIGS的步驟（人肝組織的步驟（人肝組織HBsAgHBsAg的定位為例的定位為例) )：（9 9）TBS TBS 稀釋稀釋兔抗鼠金標(biāo)抗體。兔抗鼠金標(biāo)抗體。（1010）TBS TBS 振洗振洗. .（1111）雙蒸水振洗）雙蒸水振洗5 5 2 2。（1212）1%1%戊二醛，戊二醛，10min10min。（1313）雙蒸水）雙蒸水5min 5min 。（1414）用蘇木素襯染核，甘油封片。）用蘇木素襯染核，甘油封片。結(jié)果：結(jié)果：光鏡下部分肝細(xì)胞漿內(nèi)有金顆粒聚集呈紅色，光鏡下部分肝細(xì)胞漿內(nèi)有金顆粒聚集呈紅色， 表明有表明有HBsAgHBsAg定位在細(xì)胞漿內(nèi)。定位在細(xì)胞漿

19、內(nèi)。 ( (6)6) 蛋白蛋白A-A-金（金（PAGPAG）放大法）放大法 在在IGSIGS方法定位細(xì)胞抗原時(shí)可用搭橋法，使方法定位細(xì)胞抗原時(shí)可用搭橋法，使IGSIGS得到放大得到放大. . 抗抗A A蛋白抗體作橋的蛋白抗體作橋的PAGPAG放大法放大法( (以以5-5-羥色胺定位為例羥色胺定位為例): ): （1 1）石蠟切片）石蠟切片脫蠟至水。脫蠟至水。 （2 2）胰蛋白酶消化或尿素消化。）胰蛋白酶消化或尿素消化。 （3 3）TBSTBS洗洗5 52 2。 （4 4）1% EA1% EA封閉組織。封閉組織。 （5 5）用）用TBS TBS 稀釋稀釋兔抗兔抗5-5-羥色胺抗體羥色胺抗體, ,

20、44過(guò)夜，或者過(guò)夜，或者371h371h。 （6 6）TBSTBS振洗振洗5 52 2。（7 7）1% EA1% EA封閉封閉10min10min。（8 8）用）用0.05mol/l pH7.4 TBS 0.05mol/l pH7.4 TBS 稀釋稀釋PAGPAG. .（9 9）0.05mol/l pH7.4 TBS0.05mol/l pH7.4 TBS振洗振洗10102 2。（1010）1% EA1% EA封閉封閉10min10min。（1111）抗抗A A蛋白抗體蛋白抗體（1 1：100100）3745min3745min。（1212）0.05mol/l pH7.4 tbs0.05mol/

21、l pH7.4 tbs振洗振洗10102 2。（1313）加）加0.05mol/l pH7.4 TBS0.05mol/l pH7.4 TBS稀釋稀釋PAGPAG（1 1：4040）。）。（1414）0.05mol/l pH7.4 TBS0.05mol/l pH7.4 TBS振洗振洗10102 2。（1515）雙蒸水振洗）雙蒸水振洗5min5min。（1616）1%1%戊二醛戊二醛10min10min。（1717）雙蒸水振洗）雙蒸水振洗5min5min。（1818）0.01% 0.01% 伊文思藍(lán)伊文思藍(lán)2min2min，甘油封片。，甘油封片。結(jié)果：結(jié)果：光鏡下觀察，小腸粘膜內(nèi)含有嗜銀顆粒的細(xì)胞

22、胞漿光鏡下觀察，小腸粘膜內(nèi)含有嗜銀顆粒的細(xì)胞胞漿呈紅色，陽(yáng)性顆粒位于細(xì)胞核底部，比單純用呈紅色，陽(yáng)性顆粒位于細(xì)胞核底部，比單純用PAGPAG染色深度染色深度得到加深，陽(yáng)性結(jié)果得到放大。得到加深，陽(yáng)性結(jié)果得到放大。原理：原理：抗抗A A蛋白抗體蛋白抗體FabFab段、段、FcFc段均可與段均可與PAGPAG上的上的A A蛋白結(jié)合，蛋白結(jié)合，因此，聚集更多的膠體金顆粒。因此，聚集更多的膠體金顆粒。PAGPAG放大法的優(yōu)點(diǎn)：放大法的優(yōu)點(diǎn)： 使用試劑單一；使用試劑單一； 敏感性高；敏感性高； 背景干凈。背景干凈。 二、免疫金銀法（二、免疫金銀法（IGSSIGSS）原理原理: :將將1GS1GS與銀顯影

23、方法相結(jié)合與銀顯影方法相結(jié)合, , 沉積在抗原位置的膠體金顆沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著催化劑的作用，使顯影液中的銀離子在還原劑粒起著催化劑的作用，使顯影液中的銀離子在還原劑( (對(duì)苯二酚對(duì)苯二酚) )存在的情況下被還原為銀原子，在金顆粒周圍形成一個(gè)存在的情況下被還原為銀原子，在金顆粒周圍形成一個(gè)“銀殼銀殼”，由于金顆粒的液化作用，使更多的銀離子被還原，由于金顆粒的液化作用，使更多的銀離子被還原，“銀殼銀殼”增大，最后使抗原位置得以放大。增大，最后使抗原位置得以放大。 1 1 硝酸銀顯影液的配制硝酸銀顯影液的配制 (1) 10(1) 10明膠液明膠液 + + 枸櫞酸緩沖液枸櫞酸緩沖液 + +

24、 對(duì)苯二酚對(duì)苯二酚+ +蒸餾水，蒸餾水， 混合，磁力攪拌均勻混合，磁力攪拌均勻( (注意避光注意避光) ) ，用前加入硝酸銀水溶液，用前加入硝酸銀水溶液 (2) Ph(2) Ph3.5 枸櫞酸緩沖液：枸櫞酸枸櫞酸緩沖液：枸櫞酸+ +枸櫞酸三鈉枸櫞酸三鈉+ +雙蒸水雙蒸水2 2 操作步驟操作步驟(1) (1) 組織固定后，組織固定后，5 5、1010和和2020系列濃度的蔗糖處理，制作系列濃度的蔗糖處理，制作冰凍切片，厚冰凍切片，厚101030gm30gm；(2)(2)含含l l正常羊血清或正常羊血清或1 1BSABSA的的PBSPBS室溫孵育室溫孵育2020分鐘，封閉抗體分鐘，封閉抗體非特異性

25、結(jié)合部位；非特異性結(jié)合部位；(3)(3)含含1 1氫硼化鈉的氫硼化鈉的PBSPBS孵育孵育2020分鐘；分鐘；(4)(4)第一抗體第一抗體孵育，可先置孵育，可先置4 4度，度，12121818小時(shí)，然后室溫小時(shí)，然后室溫1 1小時(shí)，小時(shí)，使抗體充分滲透并結(jié)合；使抗體充分滲透并結(jié)合； (5) PBS(5) PBS漂洗漂洗3 3次，每次次，每次5 5分鐘；分鐘； (6) 0.1 (6) 0.1BSABSAPBSPBS液液(pH 8(pH 82)2)漂洗漂洗5 5分鐘，為膠體金結(jié)合分鐘，為膠體金結(jié)合提供堿性環(huán)境；提供堿性環(huán)境； (7) (7) 膠體金標(biāo)記的第二抗體膠體金標(biāo)記的第二抗體(pH 8.2)

26、(pH 8.2)室溫孵育室溫孵育30304545分鐘，分鐘，摸索最佳稀釋摸索最佳稀釋 (8) (8) 硝酸銀液避光處理硝酸銀液避光處理2 21010分鐘，顯影時(shí)間最好根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)分鐘，顯影時(shí)間最好根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定；果確定； (9) (9) 解剖顯微鏡下選取免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位。解剖顯微鏡下選取免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位。1 1Os04Os04后固定后固定3030分鐘，雙蒸水漂洗；分鐘，雙蒸水漂洗； (10) (10) 組織標(biāo)本的脫水、樹(shù)脂包埋、超薄切片制作及電鏡觀組織標(biāo)本的脫水、樹(shù)脂包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等方法同前述。察等方法同前述。結(jié)果：結(jié)果：光鏡下見(jiàn)陽(yáng)性黑色狀顆粒，背景干凈。光鏡下見(jiàn)陽(yáng)性黑色狀顆粒，

27、背景干凈。v5nm SPA5nm SPA膠體金電鏡觀察膠體金電鏡觀察SPASPA膠體金標(biāo)記膠體金標(biāo)記I I型單純皰疹病毒型單純皰疹病毒(HSV-1)(HSV-1)抗原免疫電鏡抗原免疫電鏡人胚肺細(xì)胞人胚肺細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞漿中病毒囊膜及其鄰近的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的病細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞漿中病毒囊膜及其鄰近的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的病毒抗原結(jié)合，在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金顆粒，他們的外周區(qū)域可毒抗原結(jié)合，在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金顆粒，他們的外周區(qū)域可見(jiàn)大量的金顆粒聚集見(jiàn)大量的金顆粒聚集 三、彩色免疫金銀法（三、彩色免疫金銀法（CIGSS） 基本原理：基本原理： 是在是在IGSSIGSS基礎(chǔ)上發(fā)展起

28、來(lái)的新方法，與彩色顯影相似?；A(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新方法，與彩色顯影相似。 IGSSIGSS方法染色在抗原位點(diǎn)處生成銀顆粒被氧化成溴化銀方法染色在抗原位點(diǎn)處生成銀顆粒被氧化成溴化銀，后者被彩色顯影劑還原成金屬銀，而彩色顯影劑本身則，后者被彩色顯影劑還原成金屬銀，而彩色顯影劑本身則被氧化，其產(chǎn)物變成有色的染料沉積在銀顆粒的部位。由被氧化，其產(chǎn)物變成有色的染料沉積在銀顆粒的部位。由于染料只能通過(guò)彩色顯影劑沉積在有銀的部位，所以不與于染料只能通過(guò)彩色顯影劑沉積在有銀的部位，所以不與組織發(fā)生非特異性吸附。組織發(fā)生非特異性吸附。 1 1 操作步驟操作步驟 (1)(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，依次用胰蛋白酶，石

29、蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，依次用胰蛋白酶，LugolLugols s碘液，硫代硫碘液，硫代硫酸酸 鈉處理，鈉處理，TBSTBS漂洗。漂洗。 (2)1(2)1卵蛋白卵蛋白10min10min。 (3) (3) 適當(dāng)稀釋的適當(dāng)稀釋的特異性抗體，特異性抗體，3737孵育或孵育或4 4過(guò)夜。過(guò)夜。 (4) TBS(4) TBS漂洗后，與漂洗后，與1 1卵蛋白作用卵蛋白作用 10min10min。 (5) (5) 適當(dāng)稀釋的適當(dāng)稀釋的金標(biāo)二抗金標(biāo)二抗，37lh37lh。 (6) TBS(6) TBS漂洗漂洗5min5min；雙蒸水漂洗；雙蒸水漂洗5min5min。 (7) (7) 物理顯影。物理顯影。 (8

30、) (8) 自來(lái)水沖洗后，雙蒸水漂洗自來(lái)水沖洗后，雙蒸水漂洗5min5min。(9) 2(9) 2鐵氰化鉀和鐵氰化鉀和1 1溴化鉀溴化鉀作用作用IminImin，雙蒸水漂洗。，雙蒸水漂洗。(10) (10) 彩色顯影液顯影彩色顯影液顯影，雙蒸水漂洗。，雙蒸水漂洗。(11) (11) 依次加入依次加入2 2鐵氰化鉀和鐵氰化鉀和1 1溴化鉀溶液作用溴化鉀溶液作用lminlmin。(12) 2(12) 2硫代硫酸鈉和硫代硫酸鈉和1 1弧硫酸鈉溶液作用弧硫酸鈉溶液作用5min5min。(13) (13) 自來(lái)水沖洗后，緩沖甘油封片。自來(lái)水沖洗后，緩沖甘油封片。陽(yáng)性物質(zhì)呈藍(lán)色陽(yáng)性物質(zhì)呈藍(lán)色(-(-萘酚為

31、成色劑萘酚為成色劑) )或綠色或綠色( (菲尼酮為成色劑菲尼酮為成色劑) )四、免疫金法和免疫金銀法四、免疫金法和免疫金銀法的優(yōu)點(diǎn)：的優(yōu)點(diǎn)： 制備簡(jiǎn)單；制備簡(jiǎn)單； 標(biāo)記簡(jiǎn)單：標(biāo)記簡(jiǎn)單：抗體、凝集素、酶、抗體、凝集素、酶、SPASPA、激素等易通過(guò)物理吸附作用與膠、激素等易通過(guò)物理吸附作用與膠體金顆粒相結(jié)合形成穩(wěn)定的金標(biāo)復(fù)合物。標(biāo)記過(guò)程不需要任何化學(xué)方法交體金顆粒相結(jié)合形成穩(wěn)定的金標(biāo)復(fù)合物。標(biāo)記過(guò)程不需要任何化學(xué)方法交聯(lián)，抗體的生物活性可保持不變，標(biāo)記過(guò)程容易；聯(lián)，抗體的生物活性可保持不變，標(biāo)記過(guò)程容易； 適用范圍：適用范圍：光鏡、熒光顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡、光鏡、熒光顯微鏡、透射電鏡、掃描

32、電鏡、X X線能譜分析線能譜分析; ; 特異性強(qiáng)：特異性強(qiáng)：免疫金探針的非特異性吸附作用小，較少受生物組織背景免疫金探針的非特異性吸附作用小，較少受生物組織背景因素影響；因素影響； 敏感性高：敏感性高：金顆粒電子密度大金顆粒電子密度大適合電鏡，檢測(cè)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)酶反應(yīng)物，提高分辨率適合電鏡，檢測(cè)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)酶反應(yīng)物，提高分辨率金顆粒經(jīng)過(guò)銀顯影后得到放的，檢測(cè)抗原的敏感性比金顆粒經(jīng)過(guò)銀顯影后得到放的，檢測(cè)抗原的敏感性比PAPPAP高高200200倍倍適合檢測(cè)石蠟切片標(biāo)本中的微弱抗原適合檢測(cè)石蠟切片標(biāo)本中的微弱抗原五、免疫金銀法染色中常見(jiàn)的問(wèn)題及對(duì)策五、免疫金銀法染色中常見(jiàn)的問(wèn)題及對(duì)策（一）背景染色產(chǎn)生

33、的原因（一）背景染色產(chǎn)生的原因1 1 一抗或金標(biāo)抗體濃度過(guò)高，降低其濃度一抗或金標(biāo)抗體濃度過(guò)高，降低其濃度2 2 使用正常血清封閉和在抗體稀釋液中加入使用正常血清封閉和在抗體稀釋液中加入BSABSA，可減少非特異吸附；，可減少非特異吸附；3 3 顯色器皿必須徹底清洗，化學(xué)試劑須用三蒸水配置；顯色器皿必須徹底清洗，化學(xué)試劑須用三蒸水配置；4 4 乳酸銀和硝酸銀的顯色在避光環(huán)境，醋酸銀則在有光的環(huán)境中顯色；乳酸銀和硝酸銀的顯色在避光環(huán)境，醋酸銀則在有光的環(huán)境中顯色；5 5 顯色時(shí)切片應(yīng)垂直放置在銀顯影液中；顯色時(shí)切片應(yīng)垂直放置在銀顯影液中；6 6 控制反應(yīng)時(shí)間，顯影液中加入適量的阿拉伯膠或明膠可延

34、緩反應(yīng)速度，控制反應(yīng)時(shí)間，顯影液中加入適量的阿拉伯膠或明膠可延緩反應(yīng)速度，避免過(guò)度的還原銀非特異吸附在切片上。避免過(guò)度的還原銀非特異吸附在切片上。25 10-1525 10-15分，分，20 20-3020 20-30分分7 7 洗滌：使用洗滌：使用TBSTBS時(shí)最好加入時(shí)最好加入Triton XTriton X或或TweenTween 80 80，可洗脫非特異吸附的污，可洗脫非特異吸附的污染蛋白質(zhì)染蛋白質(zhì)（二）背景染色已發(fā)生如何消除（二）背景染色已發(fā)生如何消除 1 2%1 2%硫代硫酸鈉、硫代硫酸鈉、1%1%鐵氰化鉀對(duì)半混合，加在切片上至背景無(wú)鐵氰化鉀對(duì)半混合，加在切片上至背景無(wú)色為止；色為

35、止；2 2 2%2%鐵氰化鉀、鐵氰化鉀、 1%1%溴化鉀混合作用溴化鉀混合作用1min1min水沖洗，然后加水沖洗，然后加2%2%硫代硫代硫酸鈉和硫酸鈉和1%1%亞硫酸鈉脫色，至背景干凈為止；亞硫酸鈉脫色，至背景干凈為止；3 0.1%3 0.1%重鉻酸鉀加入重鉻酸鉀加入0.25%0.25%濃硫酸，在顯微鏡下控制脫色時(shí)間，濃硫酸，在顯微鏡下控制脫色時(shí)間，至陽(yáng)性結(jié)果清楚，無(wú)背景止。然后用至陽(yáng)性結(jié)果清楚，無(wú)背景止。然后用5%5%硫代硫酸鈉漂白。硫代硫酸鈉漂白。4 4 用用0.3-1%0.3-1%的的H H2 2O O2 2處理切片可消除背景的銀顆粒。處理切片可消除背景的銀顆粒。（三）彩色顯影背景過(guò)的

36、處理方法（三）彩色顯影背景過(guò)的處理方法 1 1 純酒精滴到切片上純酒精滴到切片上3-5s3-5s，立即沖掉，水洗徹底，否則造成陽(yáng)，立即沖掉，水洗徹底，否則造成陽(yáng)性結(jié)果脫色；性結(jié)果脫色；2 2 75%75%酒精滴到切片上酒精滴到切片上1min,1min,立即沖掉立即沖掉； 六、免疫膠體鐵技術(shù)六、免疫膠體鐵技術(shù) 膠體鐵膠體鐵陽(yáng)離子膠體，普魯士藍(lán)反應(yīng)成色，顆粒有一定大小及電子密度；陽(yáng)離子膠體，普魯士藍(lán)反應(yīng)成色，顆粒有一定大小及電子密度；1946-19861946-1986年：光鏡及電鏡定位組織中的陰離子部位年：光鏡及電鏡定位組織中的陰離子部位19891989年：抗體分子上標(biāo)記膠體鐵（日本），將膠體鐵

37、引入免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)年：抗體分子上標(biāo)記膠體鐵（日本），將膠體鐵引入免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中國(guó)楊守京對(duì)膠體鐵的制備及標(biāo)記物純化等方面進(jìn)行改進(jìn)，用于流行性出血中國(guó)楊守京對(duì)膠體鐵的制備及標(biāo)記物純化等方面進(jìn)行改進(jìn)，用于流行性出血熱病毒檢測(cè)熱病毒檢測(cè) 免疫膠體鐵技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：免疫膠體鐵技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：該方法具有較高的特異性與敏感性，背景染色干凈。該方法具有較高的特異性與敏感性，背景染色干凈。 （一）（一）膠體鐵的制備膠體鐵的制備通過(guò)通過(guò)FeClFeCl3 3的煮沸完成的煮沸完成19461946年年-FeCl-FeCl3 3直接煮沸法直接煮沸法19511951年年-FeCl-FeCl3 3溶于甘氨酸和氨水的混合液中溶

38、于甘氨酸和氨水的混合液中19831983年年-FeCl-FeCl3 3倒入煮沸的二甲砷酸鈉溶液或倒入煮沸的二甲砷酸鈉溶液或FeClFeCl3 3與二甲砷酸鈉溶液一起煮沸與二甲砷酸鈉溶液一起煮沸19861986年年-水合聯(lián)胺水合聯(lián)胺- -二甲砷酸二甲砷酸- FeClFeCl3 3煮沸法煮沸法 也可用二甲砷酸代替二甲砷酸鈉也可用二甲砷酸代替二甲砷酸鈉具體步驟：具體步驟： 二甲砷酸鈉溶液二甲砷酸鈉溶液+ +濃鹽酸濃鹽酸+ +水合聯(lián)胺水合聯(lián)胺+ +FeClFeCl3 3將混合物加熱煮沸至變成深棕色的膠體砷酸鐵，室溫冷卻將混合物加熱煮沸至變成深棕色的膠體砷酸鐵，室溫冷卻 再以二倍體積的二甲砷酸鈉緩沖液稀釋即可標(biāo)記再以二倍體積的二甲砷酸鈉緩沖液稀釋即可標(biāo)記 該法制備的鐵膠體呈深棕紅色，顆粒該法制備的鐵膠體呈深棕紅色，顆粒1nm1nm左右，左右，pH4-8pH4-8穩(wěn)定，穩(wěn)定，4 4貯存?zhèn)溆觅A存?zhèn)溆谩?（二）抗體的標(biāo)記和純化（二）抗體的標(biāo)記和純化 膠體鐵在膠體鐵