生化技術：補充1吸收光譜分析法1

1、 補充補充1 1 光譜檢驗技術光譜檢驗技術 概念及分類概念及分類u概念概念 利用各種化學物質(zhì)具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系利用各種化學物質(zhì)具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，來確定物質(zhì)性質(zhì)、結構或含量的技術的特征，來確定物質(zhì)性質(zhì)、結構或含量的技術u分類分類（根據(jù)物質(zhì)對光譜響應特征的不同，可將其分為）（根據(jù)物質(zhì)對光譜響應特征的不同，可將其分為）發(fā)射光譜分析技術發(fā)射光譜分析技術吸收光譜分析技術吸收光譜分析技術散射光譜分析技術散射光譜分析技術 在生化技術方面，光譜分析是一類十分重要的技術，應在生化技術方面，光譜分析是一類十分重要的技術，應用極為廣泛；它既可以研究物質(zhì)的結構，也可以對特定物質(zhì)用極為廣泛；

2、它既可以研究物質(zhì)的結構，也可以對特定物質(zhì)進行定性或定量分析進行定性或定量分析 一、吸收光譜分析法一、吸收光譜分析法 吸收光譜吸收光譜 是指波長連續(xù)分布的光透過物質(zhì)時，某些波是指波長連續(xù)分布的光透過物質(zhì)時，某些波長的光被物質(zhì)吸收而產(chǎn)生暗線或暗帶組成的光譜長的光被物質(zhì)吸收而產(chǎn)生暗線或暗帶組成的光譜吸收光譜分析法吸收光譜分析法 利用吸收光譜對物質(zhì)進行定量的技術稱利用吸收光譜對物質(zhì)進行定量的技術稱為吸收光譜分析法，是實驗室最常用的分析技術之一為吸收光譜分析法，是實驗室最常用的分析技術之一特點特點 它操作簡便、快速，線性范圍較寬，應用廣泛它操作簡便、快速，線性范圍較寬，應用廣泛分類分類 目前最常應用的技

3、術有目前最常應用的技術有可見可見紫外分光光度法紫外分光光度法和和原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 ( (一一) )可見可見- -紫外分光光度法紫外分光光度法 1.1.原理原理 L-BL-B爾定律爾定律 （可見（可見- -紫外光區(qū)波長為紫外光區(qū)波長為200200760nm760nm，其中，其中200200400nm400nm為紫外光）為紫外光）2.2.方法方法 對比法對比法 標準曲線法標準曲線法lCEAcm%113.3.排除干擾的方法排除干擾的方法 當兩種或兩種以上的組分共存時，可出現(xiàn)吸收光譜重疊當兩種或兩種以上的組分共存時，可出現(xiàn)吸收光譜重疊的情況；測定某一組分時，其他組分對它會有不同程度

4、的的情況；測定某一組分時，其他組分對它會有不同程度的干擾，此時可采用干擾，此時可采用雙波長法雙波長法排除雜質(zhì)的干擾排除雜質(zhì)的干擾 吸收光譜相互重疊的吸收光譜相互重疊的a a、b b兩組分。選擇各自的測得波長兩組分。選擇各自的測得波長1 1和和2 2，使干擾組分在這兩個波長處的吸光系數(shù)相同，而，使干擾組分在這兩個波長處的吸光系數(shù)相同，而欲測組分在兩波長處的吸光系數(shù)有顯著的區(qū)別。用這樣兩欲測組分在兩波長處的吸光系數(shù)有顯著的區(qū)別。用這樣兩個波長測得混合物溶液的個波長測得混合物溶液的吸光度差值吸光度差值AA，只與欲測組分的，只與欲測組分的濃度成正比，而不受共存組分的影響濃度成正比，而不受共存組分的影響

5、 在測得波長在測得波長1 1和和2 2處測得混合物的吸光度分別是處測得混合物的吸光度分別是A A1a+b1a+b和和A A2a+b2a+b，則則AAa+ba+b=A=A1 1a+b a+b - A- A2 2a+b a+b = A= A1 1a a + A A1 1b bAA2 2a aAA2 2b b =A =Aa a +A +Ab b 因組分因組分a a在在1 1和和2 2處的吸光系數(shù)相等，即處的吸光系數(shù)相等，即 欲測組分欲測組分b b在兩波長處的吸光系數(shù)相差愈大，則靈敏度愈高。在兩波長處的吸光系數(shù)相差愈大，則靈敏度愈高。用雙波長法還能消除樣品溶液背景吸收的干擾和混濁的干擾，提用雙波長法還

6、能消除樣品溶液背景吸收的干擾和混濁的干擾，提高測定的準確性。近年來由于新的、靈敏度高、選擇性好的顯色高測定的準確性。近年來由于新的、靈敏度高、選擇性好的顯色劑和掩蔽劑不斷出現(xiàn)，一般不經(jīng)分離過程即可直接比色測定；還劑和掩蔽劑不斷出現(xiàn)，一般不經(jīng)分離過程即可直接比色測定；還可采用聯(lián)立方程法、等吸收點法等解決定量中的干擾問題可采用聯(lián)立方程法、等吸收點法等解決定量中的干擾問題bbbbbbbaaaaabaCCAACA)(, 0)(212121因此上式可寫成，故 3.3.分光光度計的光源檢查和波長校正分光光度計的光源檢查和波長校正 (1)(1)光源檢查即波長的初步檢查光源檢查即波長的初步檢查 不論何種分光光

7、度計在校正之前都要先檢查光源。檢查不論何種分光光度計在校正之前都要先檢查光源。檢查方法是將波長選定在方法是將波長選定在580nm580nm處，將狹縫開到最大處，將狹縫開到最大( (或打開光或打開光門門) )，打開鎢燈，在比色皿內(nèi)插一白紙片。光源正常時，應，打開鎢燈，在比色皿內(nèi)插一白紙片。光源正常時，應看到看到均勻的黃色光斑均勻的黃色光斑，邊緣清晰整齊；如果明暗不勻，形狀，邊緣清晰整齊；如果明暗不勻，形狀異常，則應調(diào)節(jié)光源燈的位置異常，則應調(diào)節(jié)光源燈的位置常用的方法有常用的方法有用含某些特定元素的玻璃來較正用含某些特定元素的玻璃來較正 最常用的有最常用的有鐠釹玻璃鐠釹玻璃、鈥、鈥玻璃等。校正時將

8、這種玻璃放在比色皿座上，以空氣調(diào)玻璃等。校正時將這種玻璃放在比色皿座上，以空氣調(diào)0 0，測，測定幾個吸收峰值的波長是否相符。如最常用的測定定幾個吸收峰值的波長是否相符。如最常用的測定鐠釹濾光片鐠釹濾光片在在585nm585nm的雜光水平應在的雜光水平應在5%5%以內(nèi)以內(nèi)可利用某些標準溶液進行校正可利用某些標準溶液進行校正 如標準重鉻酸鉀溶液如標準重鉻酸鉀溶液( (在在1000ml1000ml的的0.05mol0.05molL L的的KOHKOH溶液中溶解溶液中溶解0.0400g0.0400g純重鉻酸純重鉻酸鉀鉀(K(K2 2CrOCrO4 4)，在，在2525以以1cm1cm比色皿在各波長測定

9、其標準吸光比色皿在各波長測定其標準吸光度，如表度，如表2 21 1。重鉻酸鉀溶液的優(yōu)點是在紫外區(qū)。重鉻酸鉀溶液的優(yōu)點是在紫外區(qū)270nm270nm及及370nm370nm處有兩個最大吸收處有兩個最大吸收(2)(2)波長校正波長校正( (二二) )原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法1.1.原理原理 基于光源輻射出具有待測元素特征譜線的光，通過原子化基于光源輻射出具有待測元素特征譜線的光，通過原子化器被其中待測元素的基態(tài)原子所吸收，根據(jù)吸收而導致輻射特器被其中待測元素的基態(tài)原子所吸收，根據(jù)吸收而導致輻射特征譜線光被減弱的程度來測定待測元素的含量征譜線光被減弱的程度來測定待測元素的含量2.2.方法

10、方法 標準曲標準曲 線法、直接比較法和標準加入法線法、直接比較法和標準加入法 主要用于鈣、鎂、銅、鉛、鋅等微量元素的測定主要用于鈣、鎂、銅、鉛、鋅等微量元素的測定3.3.原子吸收分光光度計結構特點原子吸收分光光度計結構特點 有單光束型和雙光束型兩類。主要由光源、原子化器、單有單光束型和雙光束型兩類。主要由光源、原子化器、單色器和檢測系統(tǒng)組成色器和檢測系統(tǒng)組成 在微量元素測定中，首先根據(jù)有關資料了解儀器待測元素的靈敏度在微量元素測定中，首先根據(jù)有關資料了解儀器待測元素的靈敏度和檢出限和檢出限 對靈敏度達不到要求的可以選擇最靈敏的吸收線，選用小的狹縫對靈敏度達不到要求的可以選擇最靈敏的吸收線，選用

11、小的狹縫寬度，采用較小的燈電流和最佳火焰類型及狀態(tài)等來提高靈敏度寬度，采用較小的燈電流和最佳火焰類型及狀態(tài)等來提高靈敏度 測定物質(zhì)溶解后干擾要小，易于噴霧和原子化，稀釋后測定結果測定物質(zhì)溶解后干擾要小，易于噴霧和原子化，稀釋后測定結果應在線性范圍內(nèi)應在線性范圍內(nèi) 儀器通電后要預熱儀器通電后要預熱30min30min，使光源的發(fā)射穩(wěn)定。狹縫的寬度影響，使光源的發(fā)射穩(wěn)定。狹縫的寬度影響光的譜帶寬度與檢測器的接受能量，使用較寬的狹縫可以增加光強度，光的譜帶寬度與檢測器的接受能量，使用較寬的狹縫可以增加光強度，提高信噪比，改善檢出限提高信噪比，改善檢出限 當吸收線附近有干擾譜線與非吸收光存在時，使用較

12、寬的狹縫會當吸收線附近有干擾譜線與非吸收光存在時，使用較寬的狹縫會降低靈敏度。在火焰化法中，火焰的類型是影響原子化效率的主要因降低靈敏度。在火焰化法中，火焰的類型是影響原子化效率的主要因素。因此，需通過調(diào)節(jié)燃氣與助燃氣的流量獲得最佳原子化條件，以素。因此，需通過調(diào)節(jié)燃氣與助燃氣的流量獲得最佳原子化條件，以達到最高的測定靈敏度達到最高的測定靈敏度 總之，一種元素的原子吸收法測定需要考慮儀器工作的各種條件，總之，一種元素的原子吸收法測定需要考慮儀器工作的各種條件，以期達到實驗的最佳結果以期達到實驗的最佳結果 二、發(fā)射光譜分析法二、發(fā)射光譜分析法基本概念基本概念熒光熒光 某些物質(zhì)吸收了一定波長的光能

13、后，獨自從基態(tài)躍遷到激發(fā)某些物質(zhì)吸收了一定波長的光能后，獨自從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，此類分子經(jīng)與同類或其他類分子相互碰撞，消耗相當，而下態(tài)，此類分子經(jīng)與同類或其他類分子相互碰撞，消耗相當，而下降至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能階。最低能階下降到基態(tài)，同降至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能階。最低能階下降到基態(tài)，同時發(fā)射出較原來所吸收的頻率低、波長長的光能，稱為熒光時發(fā)射出較原來所吸收的頻率低、波長長的光能，稱為熒光熒光分析法熒光分析法 對熒光物質(zhì)進行定量測定的方法對熒光物質(zhì)進行定量測定的方法發(fā)射光譜分析法分類發(fā)射光譜分析法分類 熒光分析法熒光分析法 火焰光譜法火焰光譜法( (一一) )熒光分析的基本原理熒光

14、分析的基本原理 1.1.原理原理 利用元素的原子所發(fā)射的共振熒光波長的差異，可確定元利用元素的原子所發(fā)射的共振熒光波長的差異，可確定元素的種類或物質(zhì)分子中某種結構，據(jù)熒光的強弱可以測定物質(zhì)素的種類或物質(zhì)分子中某種結構，據(jù)熒光的強弱可以測定物質(zhì)的含量的含量2.2.方法方法 熒光分析定量是基于熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定的溫度下，熒光分析定量是基于熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定的溫度下，當激發(fā)光的波長、強度、熒光測定波長以及液層厚度一定時，當激發(fā)光的波長、強度、熒光測定波長以及液層厚度一定時，所測得的熒光強度所測得的熒光強度F F與該溶液中熒光物質(zhì)的濃度與該溶液中熒光物質(zhì)的濃度C C成正比，即成正比，即F=

15、kCF=kC。采用。采用標準曲線法標準曲線法或或標準對照法標準對照法，對熒光物質(zhì)進行定量。，對熒光物質(zhì)進行定量。在一定條件下，熒光物質(zhì)的濃度愈大，發(fā)射的熒光強度也愈強在一定條件下，熒光物質(zhì)的濃度愈大，發(fā)射的熒光強度也愈強（熒光分析的靈敏度比分光度法高，通常可達（熒光分析的靈敏度比分光度法高，通常可達1010-13-13g gL L，對特，對特定物質(zhì)甚至可達到定物質(zhì)甚至可達到1010-15-15g gL L ）( (二二) )影響熒光分析的因素影響熒光分析的因素1.溶劑溶劑 配制溶液的溶劑除水外，常用的乙醇、環(huán)己烷、四氯化碳、氯仿、丙配制溶液的溶劑除水外，常用的乙醇、環(huán)己烷、四氯化碳、氯仿、丙酮

16、等溶劑中常含有熒光雜質(zhì)，影響測定，必須經(jīng)過重蒸餾等凈化處理才能酮等溶劑中常含有熒光雜質(zhì)，影響測定，必須經(jīng)過重蒸餾等凈化處理才能使用使用2.熒光物質(zhì)的濃度熒光物質(zhì)的濃度 熒光強度與溶液的線性關系熒光強度與溶液的線性關系只限于很稀的溶液只限于很稀的溶液，符合下列方程：，符合下列方程：F=kCI0，式中，式中F為熒光強度，為熒光強度，C為溶液的濃度，為溶液的濃度，I0為激發(fā)光強度，為激發(fā)光強度，k為熒為熒光效率。對于較濃的溶液，熒光強度并不隨濃度增大而增加，相反，卻隨光效率。對于較濃的溶液，熒光強度并不隨濃度增大而增加，相反，卻隨溶液濃度增大而下降。溶液濃度增大而下降。當熒光物質(zhì)濃度高時，分子間碰撞

17、增加，使熒光當熒光物質(zhì)濃度高時，分子間碰撞增加，使熒光強度減弱強度減弱；另外，；另外，濃度較大時，激發(fā)光被表面的熒光物質(zhì)所吸收，產(chǎn)生濃度較大時，激發(fā)光被表面的熒光物質(zhì)所吸收，產(chǎn)生強烈的熒光，以致使后面的溶液不易受照射而不發(fā)光強烈的熒光，以致使后面的溶液不易受照射而不發(fā)光3.溫度溫度 大多數(shù)情況下，溫度升高，分子間碰撞次數(shù)便增加，消耗分子的內(nèi)部大多數(shù)情況下，溫度升高，分子間碰撞次數(shù)便增加，消耗分子的內(nèi)部能量而產(chǎn)生自熄滅現(xiàn)象；溫度降低時，則熒光強度增大能量而產(chǎn)生自熄滅現(xiàn)象；溫度降低時，則熒光強度增大 ( (三三) )熒光分析技術的應用熒光分析技術的應用 熒光分析法靈敏度高、取樣量少，廣泛應用于各領

18、域，在熒光分析法靈敏度高、取樣量少，廣泛應用于各領域，在生化技術領域主要用于糖類、胺類、甾族化合物、生化技術領域主要用于糖類、胺類、甾族化合物、DNADNA與與RNARNA、酶與輔酶、維生素等物質(zhì)的分析酶與輔酶、維生素等物質(zhì)的分析 測定熒光強度常用熒光分光光度計，它主要包括激發(fā)光源、測定熒光強度常用熒光分光光度計，它主要包括激發(fā)光源、一對單色器、比色杯和檢測器等部件一對單色器、比色杯和檢測器等部件 熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜 激發(fā)光譜與熒光光譜激發(fā)光譜與熒光光譜激發(fā)光譜（吸收光譜）激發(fā)光譜（吸收光譜） 熒光物質(zhì)吸收紫外光后被激發(fā)出熒光，如果將激發(fā)光的熒光物質(zhì)吸收紫

19、外光后被激發(fā)出熒光，如果將激發(fā)光的光源用單色器使其分光后，測定在每一波長的激發(fā)光照射光源用單色器使其分光后，測定在每一波長的激發(fā)光照射下，物質(zhì)發(fā)射的熒光，以熒光強度對激發(fā)光波長作圖，得下，物質(zhì)發(fā)射的熒光，以熒光強度對激發(fā)光波長作圖，得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜熒光光譜（發(fā)射光譜）熒光光譜（發(fā)射光譜） 如果使激發(fā)光的波長和強度保持不變，而讓物質(zhì)所發(fā)生如果使激發(fā)光的波長和強度保持不變，而讓物質(zhì)所發(fā)生的熒光通過單色器色散，依次將不同波長的熒光照射到單的熒光通過單色器色散，依次將不同波長的熒光照射到單色器上，并依次測定其熒光強度，然后以熒光強度對相應色器上，并依次測定其熒光強度，然后以熒

20、光強度對相應的熒光作圖，得到該物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜的熒光作圖，得到該物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜三、散射光譜分析法三、散射光譜分析法散射光譜分析法散射光譜分析法 測定光通過溶液混懸顆粒后的吸光度或光散射程度的一類定量方法測定光通過溶液混懸顆粒后的吸光度或光散射程度的一類定量方法散射比濁法散射比濁法 是指一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液時遇到是指一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液時遇到抗原抗體復合物抗原抗體復合物粒子，光線被粒子顆粒粒子，光線被粒子顆粒折射折射，發(fā)生，發(fā)生偏轉偏轉，光線偏轉的角度與發(fā)射光的波，光線偏轉的角度與發(fā)射光的波長以及抗原抗體復合物顆粒大小、數(shù)目密切相關。長以及抗原抗體復合物顆粒大小

21、、數(shù)目密切相關。散射光的強度與復合散射光的強度與復合物的含量成正比物的含量成正比透射比濁法透射比濁法 是測定一定體積的溶液通過的光線量是測定一定體積的溶液通過的光線量( (光通量光通量) )，當光線通過時，由，當光線通過時，由于溶液中存在于溶液中存在抗原抗原抗體復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光抗體復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光的減少的減少，測得的，測得的光通量和抗原抗體復合物的量成反比光通量和抗原抗體復合物的量成反比發(fā)射光譜分析法發(fā)射光譜分析法 ( (一一) )散射免疫比濁分析散射免疫比濁分析1 1散射顆粒與散射光的關系散射顆粒與散射光的關系 懸浮在反應溶液中的分子，懸浮在反應