FCM原理研究生PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1FCM原理研究生原理研究生FCM HistoryFCM History1934 Moldavanl first try1934 Moldavanl first try（從固定式細(xì)胞分析（從固定式細(xì)胞分析- -流動(dòng)式）流動(dòng)式）1953 1953 Crosland-Taylor:laminar flowCrosland-Taylor:laminar flow（解決難題）（解決難題）1956 Coulter1956 Coulter（初次應(yīng)用（初次應(yīng)用 ）1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho1965 Kamentsky: spectromet

2、er principle(Ortho（開拓）（開拓）1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen,1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen, DNA Histogram DNA Histogram（完善）（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（發(fā)展）（發(fā)展）1979 SSMU: FCM Devel

3、oping1979 SSMU: FCM Developing（推廣）（推廣）1980 BJNU: First FCM (FACS III) in China1980 BJNU: First FCM (FACS III) in ChinaAbout 800 FCMs in ChinaAbout 800 FCMs in China第1頁/共126頁第2頁/共126頁FCM HistoryFCM History1934 Moldavanl first try1934 Moldavanl first try（從固定式細(xì)胞分析（從固定式細(xì)胞分析- -流動(dòng)式）流動(dòng)式）1953 1953 Crosland-

4、Taylor:laminar flowCrosland-Taylor:laminar flow（解決難題）（解決難題）1956 Coulter1956 Coulter（初次應(yīng)用（初次應(yīng)用 ）1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho（開拓）（開拓）1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen,1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen, DNA Histogram DNA Hist

5、ogram（完善）（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（發(fā)展）（發(fā)展）1979 SSMU: FCM Developing1979 SSMU: FCM Developing（推廣）（推廣）1980 BJNU: First FCM (FACS III) in China1980 BJNU: First FCM (FACS III) in ChinaAbout 800 FCMs in

6、 ChinaAbout 800 FCMs in China第3頁/共126頁COULTERCOULTER效應(yīng)原理效應(yīng)原理+電極板電極板導(dǎo)電液體導(dǎo)電液體第4頁/共126頁FCM HistoryFCM History1934Moldavanl first try1934Moldavanl first try（從固定式細(xì)胞分析（從固定式細(xì)胞分析- -流動(dòng)式）流動(dòng)式）1953 1953 Crosland-Taylor:laminar flowCrosland-Taylor:laminar flow（解決難題）（解決難題）1956 Coulter1956 Coulter（初次應(yīng)用（初次應(yīng)用 ）1965

7、Kamentsky: spectrometer principle(Ortho1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho（開拓）（開拓）1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen,1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen, DNA Histogram DNA Histogram（完善）（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS

8、I1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（發(fā)展）（發(fā)展）1979 SSMU: FCM Developing1979 SSMU: FCM Developing（推廣）（推廣）1980 BJNU: First FCM (FACS III) in China1980 BJNU: First FCM (FACS III) in ChinaAbout 800 FCMs in ChinaAbout 800 FCMs in China第5頁/共126頁第6頁/共126頁FCM HistoryFCM History1934Moldavanl first try1934Mold

9、avanl first try（從固定式細(xì)胞分析（從固定式細(xì)胞分析- -流動(dòng)式）流動(dòng)式）1953 1953 Crosland-Taylor:laminar flowCrosland-Taylor:laminar flow（解決難題）（解決難題）1956 Coulter1956 Coulter（初次應(yīng)用（初次應(yīng)用 ）1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho（開拓）（開拓）1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen,196

10、7 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen, DNA Histogram DNA Histogram（完善）（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（發(fā)展）（發(fā)展）1979 SSMU: FCM Developing1979 SSMU: FCM Developing（推廣）（推廣）1980 BJNU: First FCM (FACS III) in

11、 China1980 BJNU: First FCM (FACS III) in ChinaAbout 800 FCMs in ChinaAbout 800 FCMs in China第7頁/共126頁19791979年年 國家科委重點(diǎn)項(xiàng)目：國家科委重點(diǎn)項(xiàng)目： 研制國內(nèi)第一臺(tái)激光流研制國內(nèi)第一臺(tái)激光流式細(xì)胞儀式細(xì)胞儀19821982年年 國內(nèi)第一臺(tái)三參數(shù)激光流式細(xì)胞儀誕生國內(nèi)第一臺(tái)三參數(shù)激光流式細(xì)胞儀誕生19841984年國家科委組織科研成果的鑒定驗(yàn)收年國家科委組織科研成果的鑒定驗(yàn)收19851985年年 獲國家衛(wèi)生部科技成果乙等獎(jiǎng)獲國家衛(wèi)生部科技成果乙等獎(jiǎng)19851985年年-1990-199

12、0年年 靈敏度、信噪比、更多參數(shù)靈敏度、信噪比、更多參數(shù) 流式分選儀研制開發(fā)流式分選儀研制開發(fā) 計(jì)算機(jī)四參數(shù)軟件計(jì)算機(jī)四參數(shù)軟件 樣品制備、醫(yī)學(xué)生物學(xué)應(yīng)用樣品制備、醫(yī)學(xué)生物學(xué)應(yīng)用第8頁/共126頁BD公司不同型號(hào)流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto第9頁/共126頁Coulter公司公司不同型號(hào)流式細(xì)胞儀不同型號(hào)流式細(xì)胞儀EPICS XL/XL-MCL 臺(tái)式機(jī) CytomicsTM FC 500系列 最新型EPICS Altra細(xì)胞分選儀 大型科研型 第10頁/共126頁 FCM是以流式細(xì)胞儀為檢

13、測手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。FALS SensorLaser第11頁/共126頁 流動(dòng)的 可以是活細(xì)胞的 定量的 多參數(shù)的 高統(tǒng)計(jì)學(xué)精度的 分選細(xì)胞第12頁/共126頁第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的原理流式細(xì)胞術(shù)的原理 一一 工作原理：工作原理： FCMFCM是一種在計(jì)算機(jī)技術(shù)支持下的高度是一種在計(jì)算機(jī)技術(shù)支持下的高度自動(dòng)化的細(xì)胞顯微熒光脈沖分光光度儀。自動(dòng)化的細(xì)胞顯微熒光脈沖分光光度儀。第13頁/共126頁一一、 FCMFCM儀器的一般儀器的一般結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)( (一一) )流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)( (二二) )激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)激

14、發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)( (三三) )細(xì)胞信號(hào)檢測與分析處理系統(tǒng)細(xì)胞信號(hào)檢測與分析處理系統(tǒng) 第14頁/共126頁 基本工作原理基本工作原理速度速度 軌跡軌跡第15頁/共126頁 層流是液體穩(wěn)定流動(dòng)的必要條件層流是液體穩(wěn)定流動(dòng)的必要條件,管道中管道中層流的形成要滿足雷諾數(shù)層流的形成要滿足雷諾數(shù) dV Re = 2300， 式中式中、分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d d和和V V分別為管道的直徑和液體的平均流速。分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCMFCM利用層流技術(shù)利用層流技術(shù), ,使細(xì)胞流動(dòng)穩(wěn)定使細(xì)胞流動(dòng)穩(wěn)定, ,并具有并具有自聚焦作用自聚焦作用, ,為細(xì)胞分析分選提

15、供技術(shù)保證為細(xì)胞分析分選提供技術(shù)保證. . ( (一一) )流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 層流技術(shù)層流技術(shù)第16頁/共126頁第17頁/共126頁Injector TipSheath fluid流動(dòng)室流動(dòng)室 2-3mm方形石英方形石英內(nèi)徑內(nèi)徑200-300 m m 流速慢流速慢,細(xì)胞信號(hào)大細(xì)胞信號(hào)大,提高檢測靈敏度和精提高檢測靈敏度和精度度,小型化。小型化。通過流動(dòng)室后細(xì)通過流動(dòng)室后細(xì)胞一個(gè)一個(gè)排列胞一個(gè)一個(gè)排列成單行成單行,依次通過依次通過檢測區(qū)檢測區(qū).把流動(dòng)室把流動(dòng)室稱為稱為單細(xì)胞流單細(xì)胞流發(fā)生器發(fā)生器.第18頁/共126頁流動(dòng)室流動(dòng)室Laser Flow Cell孔徑孔徑50

16、-20050-200 m m 檢測區(qū)離噴口檢測區(qū)離噴口200200 m m有分選功能有分選功能 第19頁/共126頁第20頁/共126頁第21頁/共126頁液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（示意圖）（示意圖）流速與壓力的關(guān)系服從流速與壓力的關(guān)系服從BernoulliBernoulli方程，即方程，即 P=(1/2)P=(1/2) V V2 2 ( (忽略高度的變化忽略高度的變化) )。改變氣壓。改變氣壓, ,就可獲得不同的流速。就可獲得不同的流速。 流體動(dòng)力自聚焦流體動(dòng)力自聚焦排氣泡排氣泡第22頁/共126頁 FACSVantage Fluid System第23頁/共126頁激光（激光（Laser,

17、light amplification by stimulatedemission of radiation)是一是一種相干光源。種相干光源。單譜線，高強(qiáng)度單譜線，高強(qiáng)度. （二）激發(fā)（二）激發(fā)光源與光束光源與光束成形系統(tǒng)成形系統(tǒng)1-2us第24頁/共126頁E0E0E0E1E1E1 吸收吸收自發(fā)輻射自發(fā)輻射受激輻射受激輻射hvhvhvhvhv 當(dāng)物質(zhì)受到強(qiáng)烈激勵(lì)當(dāng)物質(zhì)受到強(qiáng)烈激勵(lì),使某一能級(jí)的粒子數(shù)大量積聚使某一能級(jí)的粒子數(shù)大量積聚,發(fā)生粒子數(shù)反分布發(fā)生粒子數(shù)反分布.如有光束入射如有光束入射,入射光子與粒子發(fā)生入射光子與粒子發(fā)生完全彈性碰撞完全彈性碰撞,使粒子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)同時(shí)發(fā)生一使粒

18、子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)同時(shí)發(fā)生一個(gè)光子個(gè)光子.光子的能量與入射光子能量相同光子的能量與入射光子能量相同,有一致的方向有一致的方向和恒定的位相關(guān)系和恒定的位相關(guān)系,這種發(fā)射稱受激發(fā)射這種發(fā)射稱受激發(fā)射.第25頁/共126頁 球透鏡和柱面透鏡球透鏡和柱面透鏡 ：20200 m 橢圓形光斑，短軸和細(xì)胞流平行，長橢圓形光斑，短軸和細(xì)胞流平行，長軸與細(xì)胞流垂直。軸與細(xì)胞流垂直。 光束成形與細(xì)胞受照方式光束成形與細(xì)胞受照方式第26頁/共126頁 激發(fā)光焦斑這種橢圓形光斑的檢測區(qū)保證每個(gè)細(xì)胞分別受到光照且受檢時(shí)受到一致的光照 光束成形與細(xì)胞受照方式光束成形與細(xì)胞受照方式第27頁/共126頁低速低速 高速高速不

19、同樣本速率形成的樣本流不同樣本速率形成的樣本流第28頁/共126頁P(yáng)MTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234Flow cell （三）細(xì)胞信號(hào)檢測與分析處理系統(tǒng)（三）細(xì)胞信號(hào)檢測與分析處理系統(tǒng)光電光電管管細(xì)胞散色光的波長是與激發(fā)光波長一致的細(xì)胞散色光的波長是與激發(fā)光波長一致的. .前向散色光信號(hào)前向散色光信號(hào): :光電二極管光電二極管側(cè)向及熒光信號(hào)用光電倍增管側(cè)向及熒光信號(hào)用光電倍增管PMT可將可將散色光及熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電脈沖信號(hào)散色光及熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電脈沖信號(hào), ,電脈電脈沖信號(hào)通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器沖信號(hào)通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器(ADC)(ADC

20、)量化為數(shù)字信號(hào)量化為數(shù)字信號(hào). .第29頁/共126頁Longpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系統(tǒng)：濾光片第30頁/共126頁第31頁/共126頁信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng): :光光 電電 數(shù)字信號(hào)數(shù)字信號(hào)第32頁/共126頁( (四四)FCM)FCM細(xì)胞分選裝置細(xì)胞分選裝置488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFSC SensorFluorescence detector 超聲振蕩器超聲振蕩器:20-40KC液流斷離點(diǎn)液流

21、斷離點(diǎn):離噴口離噴口5-8mmf=v/4.5d液滴沖電液滴沖電:幅度荷電多少幅度荷電多少,寬寬度多少液滴帶同時(shí)帶電度多少液滴帶同時(shí)帶電.靜電高壓偏轉(zhuǎn)板靜電高壓偏轉(zhuǎn)板:幾千伏電壓幾千伏電壓分選細(xì)胞的收集裝置分選細(xì)胞的收集裝置: :9696孔板孔板, ,載玻片或試管載玻片或試管第33頁/共126頁通道式分選電荷式分選細(xì)胞分選系細(xì)胞分選系統(tǒng)統(tǒng)第34頁/共126頁二二、細(xì)胞信號(hào)的檢測與分析細(xì)胞信號(hào)的檢測與分析 制備好的單細(xì)胞懸液經(jīng)儀器檢測區(qū)時(shí)受到制備好的單細(xì)胞懸液經(jīng)儀器檢測區(qū)時(shí)受到激發(fā)光的照射激發(fā)光的照射. .激光照射在細(xì)胞上時(shí)可產(chǎn)生激光照射在細(xì)胞上時(shí)可產(chǎn)生散色光信號(hào)和熒光信號(hào)散色光信號(hào)和熒光信號(hào).

22、.第35頁/共126頁FALS SensorLaserForward Angle Light Scatter (FSC)( (一一) )細(xì)胞散色光信號(hào)細(xì)胞散色光信號(hào)細(xì)胞對(duì)光的散色現(xiàn)象與細(xì)胞樣品制備無關(guān)細(xì)胞對(duì)光的散色現(xiàn)象與細(xì)胞樣品制備無關(guān). .第36頁/共126頁90 Degree Light Scatter (SSC)FALS Sensor90LS SensorLaser細(xì)胞對(duì)光的散色現(xiàn)象與細(xì)胞樣品制備無關(guān)細(xì)胞對(duì)光的散色現(xiàn)象與細(xì)胞樣品制備無關(guān). .第37頁/共126頁FSC第38頁/共126頁SSC第39頁/共126頁細(xì)胞散色光信號(hào)細(xì)胞散色光信號(hào)第40頁/共126頁( (二二) )細(xì)胞熒光測量

23、細(xì)胞熒光測量 未經(jīng)染色的樣品細(xì)胞 在激發(fā)光的照射下可測到有微弱的熒 光信號(hào). 經(jīng)過各種特異染色的細(xì)胞在激 發(fā)光的照射下可測到較強(qiáng)的熒光信號(hào).第41頁/共126頁自發(fā)熒光信號(hào)與特異染色的熒光信號(hào)分析圖自發(fā)熒光信號(hào)與特異染色的熒光信號(hào)分析圖自發(fā)熒光信號(hào)自發(fā)熒光信號(hào)第42頁/共126頁特異染色的熒光信號(hào)特異染色的熒光信號(hào)第43頁/共126頁細(xì)胞熒光信細(xì)胞熒光信號(hào)號(hào)AMPAMP 經(jīng)過經(jīng)過PMTPMT將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖信號(hào)，并增加將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖信號(hào)，并增加PMTPMT的電壓及的電壓及增益，可將脈沖信號(hào)進(jìn)行放大。放大方式有兩種：增益，可將脈沖信號(hào)進(jìn)行放大。放大方式有兩種： 線性放大線性放大(L

24、in):(Lin):對(duì)數(shù)放大對(duì)數(shù)放大(Log):(Log):熒光熒光信號(hào)的測量：信號(hào)的測量：第44頁/共126頁 熒光檢測器檢測特定熒光的特定發(fā)射波長熒光檢測器檢測特定熒光的特定發(fā)射波長 線性放大線性放大 對(duì)數(shù)放大對(duì)數(shù)放大細(xì)胞熒光信號(hào)細(xì)胞熒光信號(hào)第45頁/共126頁熒光光譜重疊熒光光譜重疊 FITC和PE熒光光譜重疊第46頁/共126頁Uncompensated vs CompensatedFL1FL2 利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱“”熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償?shù)?7頁/共126頁熒光補(bǔ)熒光補(bǔ)償償?shù)?8頁/共126頁三三、FCMFCM測量數(shù)據(jù)的存貯、測量數(shù)據(jù)的存

25、貯、 顯示和分析顯示和分析（一）（一）FCMFCM數(shù)據(jù)的存貯數(shù)據(jù)的存貯（二）（二）FCMFCM數(shù)據(jù)的顯示方式數(shù)據(jù)的顯示方式（三）（三）FCMFCM數(shù)據(jù)的分析數(shù)據(jù)的分析第49頁/共126頁（一）（一）FCMFCM數(shù)據(jù)的存貯數(shù)據(jù)的存貯 List ModeList Mode方式就是用表格的方式方式就是用表格的方式將每一個(gè)被測細(xì)胞的眾多原始測量數(shù)將每一個(gè)被測細(xì)胞的眾多原始測量數(shù)據(jù)全部記錄下來，成為一個(gè)數(shù)據(jù)文件據(jù)全部記錄下來，成為一個(gè)數(shù)據(jù)文件。第50頁/共126頁1.1.單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖（HistogramHistogram）2.2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示：雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示： 二維點(diǎn)圖二維點(diǎn)圖(Dot

26、Plot)(Dot Plot) 等高線圖等高線圖(Contour Plot)(Contour Plot) 二維密度圖二維密度圖(Density Plot)(Density Plot) 假三維圖假三維圖(Pseudo 3D Plot)(Pseudo 3D Plot)3.3.三維圖三維圖(3D Plot)(3D Plot)（二）（二）FCMFCM數(shù)據(jù)的顯示方式數(shù)據(jù)的顯示方式第51頁/共126頁. . 單參數(shù)直方圖的顯單參數(shù)直方圖的顯示示 以分布直方圖以分布直方圖( distribution ( distribution histogram )histogram )來顯示，橫軸為該參數(shù)測量強(qiáng)來顯示，

27、橫軸為該參數(shù)測量強(qiáng)度相對(duì)值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以是線度相對(duì)值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的?？v軸一般是細(xì)胞數(shù)性的，也可以是對(duì)數(shù)的。縱軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。Single-Parameter Histogram Displays第52頁/共126頁單參數(shù)直方圖的顯示單參數(shù)直方圖的顯示第53頁/共126頁. .雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示 細(xì)胞雙參數(shù)測定不僅能提供二個(gè)參數(shù)各細(xì)胞雙參數(shù)測定不僅能提供二個(gè)參數(shù)各自與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，更重要的是獲得了自與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，更重要的是獲得了這二參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，其中包含了更這二參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，其中包含了

28、更多的生物學(xué)信息。多的生物學(xué)信息。雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示最常用雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示最常用的是二維的散點(diǎn)圖的是二維的散點(diǎn)圖( Dot Plot )( Dot Plot )。在二維。在二維圖上，圖上，X X軸代表第一個(gè)測量參數(shù)，軸代表第一個(gè)測量參數(shù)，Y Y軸代表軸代表第二個(gè)測量參數(shù)。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞第二個(gè)測量參數(shù)。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞. .Two-Parameter Data Displays第54頁/共126頁點(diǎn)圖點(diǎn)圖(dot plot)第55頁/共126頁第56頁/共126頁 用等高線來表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，用等高線來表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。不同的等高

29、線上細(xì)胞數(shù)不同。二維等高圖二維等高圖第57頁/共126頁 縱軸與橫軸分別代表被測細(xì)胞的兩個(gè)測量參縱軸與橫軸分別代表被測細(xì)胞的兩個(gè)測量參數(shù)數(shù),Z,Z軸為細(xì)胞數(shù)。軸為細(xì)胞數(shù)。假三維等高圖假三維等高圖第58頁/共126頁. .多參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示多參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示 在單一圖上同時(shí)顯示多參數(shù)是不可能的。在單一圖上同時(shí)顯示多參數(shù)是不可能的。實(shí)際工作中是實(shí)際工作中是用若干個(gè)單參數(shù)直方圖和各種用若干個(gè)單參數(shù)直方圖和各種不同組合的雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示來反映各種信息不同組合的雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示來反映各種信息的。的。多參數(shù)測量另一重要意義是通過有關(guān)參多參數(shù)測量另一重要意義是通過有關(guān)參數(shù)進(jìn)行數(shù)進(jìn)行“設(shè)門設(shè)門”分析分析 ( gati

30、ng analysis )( gating analysis )可以是單參數(shù)設(shè)門，也可以是雙參數(shù)設(shè)門可以是單參數(shù)設(shè)門，也可以是雙參數(shù)設(shè)門。單參數(shù)設(shè)門調(diào)出雙參數(shù)顯示簡稱單參數(shù)設(shè)門調(diào)出雙參數(shù)顯示簡稱“一調(diào)二一調(diào)二”。不難理解也有不難理解也有“一調(diào)一一調(diào)一”和和“二調(diào)一二調(diào)一”和和“二調(diào)二二調(diào)二”等。等。Multiple-Parameter Data Displays第59頁/共126頁 三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù)（散射光或熒光）而三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。非細(xì)胞數(shù)。多參數(shù)直方圖多參數(shù)直方圖第60頁/共126頁 一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門（一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門（Ga

31、te)技術(shù)，來分析參數(shù)之間的相互關(guān)系。技術(shù)，來分析參數(shù)之間的相互關(guān)系。多參數(shù)顯示多參數(shù)顯示第61頁/共126頁P(yáng)seudo 3D Plot3D Plot多參數(shù)顯示多參數(shù)顯示第62頁/共126頁通過雙參數(shù)調(diào)閱單參數(shù)通過雙參數(shù)調(diào)閱單參數(shù)第63頁/共126頁通過單參數(shù)調(diào)閱雙通過單參數(shù)調(diào)閱雙參數(shù)參數(shù)第64頁/共126頁. . 單參數(shù)分布直方圖的設(shè)區(qū)分析單參數(shù)分布直方圖的設(shè)區(qū)分析. . 細(xì)胞細(xì)胞DNADNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析. . 雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設(shè)門分區(qū)分析雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設(shè)門分區(qū)分析. . 多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析（三）（三）FCMFCM數(shù)據(jù)的分析數(shù)據(jù)的分析第65頁/共

32、126頁. .單參數(shù)分布直方圖的設(shè)區(qū)分析單參數(shù)分布直方圖的設(shè)區(qū)分析 這是單參數(shù)數(shù)據(jù)分析中最簡單的一種這是單參數(shù)數(shù)據(jù)分析中最簡單的一種方法。由于方法。由于FCMFCM一次測量的細(xì)胞數(shù)多，配一次測量的細(xì)胞數(shù)多，配合設(shè)門和調(diào)用等手段獲得感興趣的細(xì)胞參合設(shè)門和調(diào)用等手段獲得感興趣的細(xì)胞參數(shù)分布直方圖。這種統(tǒng)計(jì)分布直方圖一般數(shù)分布直方圖。這種統(tǒng)計(jì)分布直方圖一般可直觀地反映出眾多有用的信息可直觀地反映出眾多有用的信息。第66頁/共126頁. .單參數(shù)分布直方圖的設(shè)區(qū)分析單參數(shù)分布直方圖的設(shè)區(qū)分析第67頁/共126頁 通過細(xì)胞通過細(xì)胞DNADNA含量測定，了解細(xì)胞增殖含量測定，了解細(xì)胞增殖群體中群體中G G

33、0 0/G/G1 1、S S、G G2 2/M/M細(xì)胞各占的比例，進(jìn)細(xì)胞各占的比例，進(jìn)而分析其細(xì)胞動(dòng)力學(xué)各參數(shù)。這是而分析其細(xì)胞動(dòng)力學(xué)各參數(shù)。這是FCMFCM的重的重要應(yīng)用之一。要應(yīng)用之一。細(xì)胞細(xì)胞DNADNA含量分布直方圖的數(shù)含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析通常有兩種方法，據(jù)分析通常有兩種方法， 作圖分析法和計(jì)作圖分析法和計(jì)算機(jī)擬合法算機(jī)擬合法( ( Curve fittingCurve fitting ) )。. .細(xì)胞細(xì)胞DNADNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析第68頁/共126頁細(xì)胞細(xì)胞DNADNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析第69頁/共126頁細(xì)胞細(xì)胞

34、DNADNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析第70頁/共126頁第71頁/共126頁計(jì)算機(jī)擬合法適用范大，應(yīng)用中要注意以計(jì)算機(jī)擬合法適用范大，應(yīng)用中要注意以下一些方面：下一些方面：1 1）FCMFCM儀器儀器CVCV值與細(xì)胞熒光染色的好壞會(huì)值與細(xì)胞熒光染色的好壞會(huì) 直接影響曲線擬合的結(jié)果。直接影響曲線擬合的結(jié)果。2 2）在細(xì)胞群體中數(shù)量較少的細(xì)胞亞群，）在細(xì)胞群體中數(shù)量較少的細(xì)胞亞群， 如如G G2 2/M/M細(xì)胞群的分析誤差一般大于細(xì)細(xì)胞群的分析誤差一般大于細(xì) 胞數(shù)量多的亞群。胞數(shù)量多的亞群。3 3）曲線擬合有時(shí)會(huì)出現(xiàn)偏離生物學(xué)意義的）曲線擬合有時(shí)會(huì)出現(xiàn)偏離生物學(xué)意義的 分析

35、結(jié)果。這種情況下，可改變參量或分析結(jié)果。這種情況下，可改變參量或 選用其他數(shù)學(xué)模型重新分析選用其他數(shù)學(xué)模型重新分析。第72頁/共126頁. .雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設(shè)門分區(qū)分析雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設(shè)門分區(qū)分析 在雙參數(shù)的顯示圖上，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)在雙參數(shù)的顯示圖上，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能相同的細(xì)胞亞群總表現(xiàn)為集中分布胞功能相同的細(xì)胞亞群總表現(xiàn)為集中分布的趨勢，不同細(xì)胞亞群有其各自的分布區(qū)的趨勢，不同細(xì)胞亞群有其各自的分布區(qū)域。設(shè)門分區(qū)可以是方形、矩形、圓形、域。設(shè)門分區(qū)可以是方形、矩形、圓形、橢園形甚至各種不規(guī)則圖形，按細(xì)胞亞群橢園形甚至各種不規(guī)則圖形，按細(xì)胞亞群實(shí)際的分布情況而定。實(shí)際的分布情況而定。 第73頁/共1

36、26頁點(diǎn)圖點(diǎn)圖 縱軸與橫軸分別代表被測細(xì)胞的兩個(gè)測量參數(shù),在圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞第74頁/共126頁雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設(shè)門分區(qū)分析雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設(shè)門分區(qū)分析第75頁/共126頁 多參數(shù)數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵在于如何正確通過設(shè)多參數(shù)數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵在于如何正確通過設(shè)門和調(diào)用獲取有價(jià)值的單參數(shù)顯示和門和調(diào)用獲取有價(jià)值的單參數(shù)顯示和/ /或雙參或雙參數(shù)顯示。由于多參數(shù)相關(guān)測量包含的信息量數(shù)顯示。由于多參數(shù)相關(guān)測量包含的信息量大，故經(jīng)常會(huì)用多個(gè)單參數(shù)和大，故經(jīng)常會(huì)用多個(gè)單參數(shù)和/ /或雙參數(shù)顯示或雙參數(shù)顯示來全面反映其中的各種信息。來全面反映其中的各種信息。由于樣品細(xì)胞由于樣品細(xì)胞的種類、處理過程、染色方法等的差異

37、，不的種類、處理過程、染色方法等的差異，不可能規(guī)定不變的數(shù)據(jù)處理步驟。細(xì)致認(rèn)真的可能規(guī)定不變的數(shù)據(jù)處理步驟。細(xì)致認(rèn)真的數(shù)據(jù)處理可獲得大量的正確結(jié)果。數(shù)據(jù)處理可獲得大量的正確結(jié)果。. .多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析第76頁/共126頁第77頁/共126頁流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) FCM如何采用層流技術(shù)？如何采用層流技術(shù)？FCM細(xì)胞散色光信號(hào)細(xì)胞散色光信號(hào)FCM的熒光補(bǔ)償?shù)臒晒庋a(bǔ)償FCM的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存方式的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存方式FCM的不同顯示方式的不同顯示方式 第78頁/共126頁 流式細(xì)胞術(shù)樣品制備流式細(xì)胞術(shù)樣品制備 Flow Cytometry Sample Preparation第79頁/共126頁第8

38、0頁/共126頁第81頁/共126頁流式細(xì)胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液制備熒光抗體標(biāo)記上機(jī)檢測表型測定細(xì)胞分選繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析第82頁/共126頁FCMFCM的細(xì)胞樣品制備技術(shù)三個(gè)部分：的細(xì)胞樣品制備技術(shù)三個(gè)部分：一、單分散細(xì)胞懸液制備一、單分散細(xì)胞懸液制備二、選擇性分離細(xì)胞亞群二、選擇性分離細(xì)胞亞群三、細(xì)胞熒光染色三、細(xì)胞熒光染色第83頁/共126頁 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的分析檢測流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的分析檢測 必須必須 基于基于單個(gè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，這是的基礎(chǔ)上，這是 流式細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)帶來的特殊要求術(shù)帶來的特殊要求。一、單個(gè)分散細(xì)胞懸液的

39、制備技術(shù)一、單個(gè)分散細(xì)胞懸液的制備技術(shù)（一）（一）實(shí)體組織實(shí)體組織的單細(xì)胞懸液的制備的單細(xì)胞懸液的制備（二）石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備（二）石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備第84頁/共126頁 常用的分散細(xì)胞的方法如下常用的分散細(xì)胞的方法如下 1 1、酶消化法、酶消化法 2 2、機(jī)械法、機(jī)械法 3 3、化學(xué)試劑處理法、化學(xué)試劑處理法（一）實(shí)體組織的單細(xì)胞懸液的制備（一）實(shí)體組織的單細(xì)胞懸液的制備第85頁/共126頁（1 1）原理原理（2 2）常用的酶類試劑）常用的酶類試劑（3 3）酶反應(yīng)的條件酶反應(yīng)的條件（4 4）酶消化法的一般步驟酶消化法的一般步驟1 1、酶消化法、酶消化法：第86頁/共126

40、頁（）（）原理原理：這種方法是利用：這種方法是利用酶酶的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)大分子大分子不能進(jìn)入活細(xì)胞膜不能進(jìn)入活細(xì)胞膜，但能夠，但能夠破壞破壞細(xì)細(xì)胞與細(xì)胞之間的胞與細(xì)胞之間的膠原纖維膠原纖維，水解細(xì)胞間的，水解細(xì)胞間的粘多糖粘多糖成分，分解細(xì)胞間的細(xì)胞成分，分解細(xì)胞間的細(xì)胞緊密連結(jié)緊密連結(jié)裝置裝置的蛋白性物質(zhì)，而使細(xì)胞能從組織塊的蛋白性物質(zhì)，而使細(xì)胞能從組織塊上游離到懸浮液中，制備成細(xì)胞懸液。上游離到懸浮液中，制備成細(xì)胞懸液。、酶消化法、酶消化法第87頁/共126頁A.A.蛋白酶類：蛋白酶類：如胃蛋白酶、胰蛋白酶、如胃蛋白酶、胰蛋白酶、鏈蛋白酶等，其中胰蛋白酶鏈蛋白酶等，其中胰蛋白酶( Tryps

41、in )( Trypsin )最常用。最常用。B.B.膠原酶膠原酶( Collagenase( Collagenase）：膠原酶能降解幾種）：膠原酶能降解幾種分子類型的膠原。分子類型的膠原。 其它常用的酶還有彈性蛋白酶，透明質(zhì)酸酶其它常用的酶還有彈性蛋白酶，透明質(zhì)酸酶和木瓜蛋白酶等。和木瓜蛋白酶等。 不同類型的組織其化學(xué)組成不相同使用不同類型的組織其化學(xué)組成不相同使用不同種類的酶，見表不同種類的酶，見表1-11-1。（）常用的酶類劑（）常用的酶類劑第88頁/共126頁表表1-1 1-1 酶種類的選擇酶種類的選擇胰蛋白酶胰蛋白酶 鏈蛋白酶鏈蛋白酶 膠元酶膠元酶人結(jié)腸肉瘤人結(jié)腸肉瘤 人前列腺人前列

42、腺 小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤大鼠腎臟大鼠腎臟 人瘤腮腺人瘤腮腺 小鼠乳腺腫小鼠乳腺腫瘤瘤人扁桃體人扁桃體 大鼠乳腺大鼠乳腺 小鼠睪丸小鼠睪丸倉鼠前列腺倉鼠前列腺 倉鼠腎臟倉鼠腎臟 大鼠睪丸大鼠睪丸小鼠肝臟小鼠肝臟 倉鼠胰腺倉鼠胰腺 人脾臟人脾臟倉鼠腮腺倉鼠腮腺 人何杰金氏腫瘤人何杰金氏腫瘤大鼠大鼠結(jié)腸肉瘤結(jié)腸肉瘤第89頁/共126頁 為使組織細(xì)胞分散下來，須注意為使組織細(xì)胞分散下來，須注意條件條件的選擇和影響因素：的選擇和影響因素： A.A. 配制酶溶液試劑時(shí)要兼顧酶反應(yīng)的配制酶溶液試劑時(shí)要兼顧酶反應(yīng)的適宜條件與活細(xì)胞要求的生理環(huán)境，適宜條件與活細(xì)胞要求的生理環(huán)境，其中其中包括包括滲透壓，滲透壓，

43、pHpH值值( (緩沖液緩沖液) )，各種各種離子濃離子濃度，酶激動(dòng)劑等。度，酶激動(dòng)劑等。 B.B. 酶溶液的適用濃度：酶溶液的適用濃度：胃蛋白酶胃蛋白酶 0.5% 0.5% 膠原酶膠原酶 0.1%0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶 0.25%( 0.25%( 含含1-10g/ml DNase )1-10g/ml DNase )（）酶反應(yīng)的條件（）酶反應(yīng)的條件第90頁/共126頁 C. C. 酶消化過程的最佳酶消化過程的最佳溫度溫度與持續(xù)與持續(xù)時(shí)間時(shí)間：37,15-2037,15-20分鐘，分鐘，不同組織不同酶而異。不同組織不同酶而異。二次消化二次消化反復(fù)數(shù)次反復(fù)數(shù)次, ,直至組織塊完全消失。直至組織塊

44、完全消失。每克組織每克組織10-15ml10-15ml。 （）酶反應(yīng)的條件（）酶反應(yīng)的條件第91頁/共126頁D. 終止酶消化反應(yīng)的方法和措施：加酶抑制劑（如大豆胰蛋白酶抑制劑等）；降低酶反應(yīng)溫度，將細(xì)胞懸液管移至冰水浴中；對(duì)于蛋白酶，加入少量血清以減弱酶對(duì)細(xì)胞的不利影響。通過反復(fù)離心漂洗，移去酶消化液，徹底終止酶消化過程等。（）酶反應(yīng)的條件（）酶反應(yīng)的條件第92頁/共126頁 A. A. 新鮮組織塊放入冰冷的培養(yǎng)液（或生理鹽水）。新鮮組織塊放入冰冷的培養(yǎng)液（或生理鹽水）。 B. B. 壞死部分，纖維、脂肪及血管等剔除。壞死部分，纖維、脂肪及血管等剔除。 C. C. 剪為剪為1.0mm1.0m

45、m3 3大小于冰冷的培養(yǎng)液大小于冰冷的培養(yǎng)液( ( 或生理鹽水或生理鹽水 ) )。 D. D. 漂洗剪碎的組織塊，以洗去剪碎的細(xì)胞碎片。漂洗剪碎的組織塊，以洗去剪碎的細(xì)胞碎片。 E. E. 加入酶消化液（一般加入酶消化液（一般g g組織加消化液組織加消化液10-15ml )10-15ml )。 F. F. 消化消化15-2015-20分鐘分鐘( 37( 37，間斷振蕩或吹打，間斷振蕩或吹打) )，消化，消化 時(shí)間視不同組織，不同種類的酶而異。時(shí)間視不同組織，不同種類的酶而異。 G. G. 終止消化，收集、過濾、低速離心除去碎片。終止消化，收集、過濾、低速離心除去碎片。 H. H. 單細(xì)胞懸液進(jìn)

46、行熒光染色，上機(jī)檢測或保存?zhèn)溆?。單?xì)胞懸液進(jìn)行熒光染色，上機(jī)檢測或保存?zhèn)溆?。（）酶消化法的一般程序和步驟：（）酶消化法的一般程序和步驟：第93頁/共126頁 有剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法等有剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法等 它是利用機(jī)械方法，物理方法給予組織它是利用機(jī)械方法，物理方法給予組織 較大的壓力或用超聲振蕩使細(xì)胞從組織間較大的壓力或用超聲振蕩使細(xì)胞從組織間 分散開來。分散開來。. . 機(jī)械法：機(jī)械法：第94頁/共126頁貼壁粘連貼壁粘連作用作用鈣鎂離子鈣鎂離子結(jié)合掉，從而使細(xì)結(jié)合掉，從而使細(xì)胞分散。胞分散。常用試劑有常用試劑有EDTAEDTA、EGTAEGTA、TPBTPB等。等。 . . 化學(xué)試

47、劑處理法：化學(xué)試劑處理法： EDTAEDTA是一種螯合劑。實(shí)際運(yùn)用時(shí)采用是一種螯合劑。實(shí)際運(yùn)用時(shí)采用螯合劑加酶學(xué)法（主要是采用胰蛋白酶）。螯合劑加酶學(xué)法（主要是采用胰蛋白酶）。這樣的分散細(xì)胞方法效果要比單獨(dú)采用化這樣的分散細(xì)胞方法效果要比單獨(dú)采用化學(xué)試劑法好。學(xué)試劑法好。其他常用的化學(xué)試劑還有其他常用的化學(xué)試劑還有Triton-x-100Triton-x-100，四苯硼等。四苯硼等。第95頁/共126頁機(jī)械法往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較機(jī)械法往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞產(chǎn)量。低的細(xì)胞產(chǎn)量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團(tuán)塊等，如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團(tuán)塊等，

48、也可利用電子學(xué)技術(shù)處理的方法排除團(tuán)塊和碎片也可利用電子學(xué)技術(shù)處理的方法排除團(tuán)塊和碎片的干擾。的干擾。 酶學(xué)法、化學(xué)法對(duì)實(shí)體組織的分散效果較理想，酶學(xué)法、化學(xué)法對(duì)實(shí)體組織的分散效果較理想，但會(huì)造成所測化學(xué)成份的不良影響。但會(huì)造成所測化學(xué)成份的不良影響。FCMFCM所測細(xì)胞所測細(xì)胞是單個(gè)分散狀態(tài)；對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡可能是單個(gè)分散狀態(tài)；對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡可能少；細(xì)胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光少；細(xì)胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光染色處理不受影響。染色處理不受影響。 小結(jié)小結(jié)第96頁/共126頁 檢測石臘包埋組織，對(duì)細(xì)胞成份及特性檢測石臘包埋組織，對(duì)細(xì)胞成份及特性進(jìn)行進(jìn)行定量定性分

49、析定量定性分析是近年來流式細(xì)胞術(shù)在臨是近年來流式細(xì)胞術(shù)在臨床腫瘤學(xué)的應(yīng)用和基礎(chǔ)生物學(xué)的應(yīng)用，因此，床腫瘤學(xué)的應(yīng)用和基礎(chǔ)生物學(xué)的應(yīng)用，因此，石臘包埋組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)的建立使石臘包埋組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)的建立使大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用，大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用，從而擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍從而擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍。（二）石臘包埋組織單細(xì)胞懸液的制備（二）石臘包埋組織單細(xì)胞懸液的制備第97頁/共126頁常用的方法有以下幾種：常用的方法有以下幾種：. .利用細(xì)胞之間密度或體積的差異分離利用細(xì)胞之間密度或體積的差異分離. .利用細(xì)胞的吸咐力特性分離利用細(xì)胞的吸咐力

50、特性分離. .利用單克隆抗體分離細(xì)胞亞群利用單克隆抗體分離細(xì)胞亞群. .利用選擇性破壞和保留一部分細(xì)胞亞群利用選擇性破壞和保留一部分細(xì)胞亞群. .利用利用FCMFCM分析技術(shù)區(qū)分細(xì)胞亞群分析技術(shù)區(qū)分細(xì)胞亞群. .利用流式細(xì)胞分選術(shù)分選細(xì)胞亞群利用流式細(xì)胞分選術(shù)分選細(xì)胞亞群二、選擇性分離細(xì)胞亞群二、選擇性分離細(xì)胞亞群第98頁/共126頁（1 1）自然沉降法）自然沉降法（2 2）密度梯度離心法，電泳法，離心鼓淘汰法。）密度梯度離心法，電泳法，離心鼓淘汰法。 用淋巴細(xì)胞分離液根據(jù)各細(xì)胞亞群的比重不用淋巴細(xì)胞分離液根據(jù)各細(xì)胞亞群的比重不 同可以分離出淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等。同可以分離出淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等。

51、. .利用細(xì)胞之間密度或體積的差異分離利用細(xì)胞之間密度或體積的差異分離第99頁/共126頁（1 1）玻璃和磁鐵吸咐法：純化淋巴胞）玻璃和磁鐵吸咐法：純化淋巴胞（2 2）花環(huán)沉降法：）花環(huán)沉降法：T T、B B淋巴細(xì)胞的化淋巴細(xì)胞的化（3 3）吸咐法：純化單核細(xì)胞）吸咐法：純化單核細(xì)胞. .利用細(xì)胞的吸咐力特性分離利用細(xì)胞的吸咐力特性分離第100頁/共126頁第101頁/共126頁. .利用單克隆抗體分離細(xì)胞亞群利用單克隆抗體分離細(xì)胞亞群陽性選擇陽性選擇陰性選擇陰性選擇MACS-Magnetic CellMACS-Magnetic CellSorting Sorting 磁珠磁珠分離分離第102

52、頁/共126頁 氯化銨選擇性破壞紅細(xì)胞氯化銨選擇性破壞紅細(xì)胞. .利用選擇性破壞和保留一部分細(xì)胞亞群利用選擇性破壞和保留一部分細(xì)胞亞群第103頁/共126頁用散射光信號(hào)用散射光信號(hào)區(qū)分淋巴、區(qū)分淋巴、粒、單核細(xì)胞粒、單核細(xì)胞. .利用利用FCMFCM分析技術(shù)區(qū)分細(xì)胞亞群分析技術(shù)區(qū)分細(xì)胞亞群第104頁/共126頁干細(xì)胞（干細(xì)胞（CD34CD34+ +）的分選）的分選. .利用流式細(xì)胞分選術(shù)分選細(xì)胞亞群利用流式細(xì)胞分選術(shù)分選細(xì)胞亞群488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescenc

53、e detector第105頁/共126頁分離結(jié)果的驗(yàn)證指標(biāo)有兩方面：分離結(jié)果的驗(yàn)證指標(biāo)有兩方面：收獲率和純度收獲率和純度 收獲率收獲率 是指分離后所得的細(xì)胞亞群數(shù)是指分離后所得的細(xì)胞亞群數(shù)占原細(xì)胞樣品中該亞群細(xì)胞數(shù)的百分比。占原細(xì)胞樣品中該亞群細(xì)胞數(shù)的百分比。 純度純度 是指分離后的樣品中該亞群細(xì)胞是指分離后的樣品中該亞群細(xì)胞所占的百分比所占的百分比。小結(jié)小結(jié)第106頁/共126頁三、細(xì)胞熒光染色技術(shù)三、細(xì)胞熒光染色技術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)快速分析單細(xì)胞快速分析單細(xì)胞的各種生物學(xué)的各種生物學(xué)特性和各種生化成份并特性和各種生化成份并定量測定定量測定這些參數(shù)是這些參數(shù)是通過熒光細(xì)胞化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)

54、的通過熒光細(xì)胞化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)的。第107頁/共126頁（一）細(xì)胞化學(xué)的定義和原則（一）細(xì)胞化學(xué)的定義和原則（二）細(xì)胞懸液中熒光細(xì)胞化學(xué)方法的特點(diǎn)（二）細(xì)胞懸液中熒光細(xì)胞化學(xué)方法的特點(diǎn)（三）熒光細(xì)胞化學(xué)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（三）熒光細(xì)胞化學(xué)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（四）（四）FCM熒光細(xì)胞化學(xué)的分類熒光細(xì)胞化學(xué)的分類（五）細(xì)胞（五）細(xì)胞DNA熒光熒光染色染色（六）細(xì)胞（六）細(xì)胞RNA熒光熒光染色染色（七）細(xì)胞蛋白質(zhì)（七）細(xì)胞蛋白質(zhì)熒光熒光染色染色（八）其它（八）其它熒光熒光染色方法染色方法三、細(xì)胞熒光染色技術(shù)三、細(xì)胞熒光染色技術(shù)第108頁/共126頁. . 熒光細(xì)胞化學(xué)過程的特異性熒光細(xì)胞化學(xué)過程的特異性 FCMFCM的

55、熒光細(xì)胞化學(xué)過程要求有足夠的的熒光細(xì)胞化學(xué)過程要求有足夠的 特異性，熒光染料與細(xì)胞成分是否為特異特異性，熒光染料與細(xì)胞成分是否為特異 性結(jié)合。嚴(yán)格控制各種反應(yīng)條件是保證反性結(jié)合。嚴(yán)格控制各種反應(yīng)條件是保證反 應(yīng)特異性的重要因素。應(yīng)特異性的重要因素。 （三）熒光細(xì)胞化學(xué)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（三）熒光細(xì)胞化學(xué)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn). . 熒光細(xì)胞化學(xué)的化學(xué)定量關(guān)系熒光細(xì)胞化學(xué)的化學(xué)定量關(guān)系 在相同的條件下，熒光反應(yīng)產(chǎn)物（熒光在相同的條件下，熒光反應(yīng)產(chǎn)物（熒光強(qiáng)度）與所研究的生化成份的含量或活性之強(qiáng)度）與所研究的生化成份的含量或活性之間有嚴(yán)格的化學(xué)定量關(guān)系間有嚴(yán)格的化學(xué)定量關(guān)系。第109頁/共126頁熒光熒光染色染色定量

56、關(guān)系定量關(guān)系熒光染色的特異性熒光染色的特異性第110頁/共126頁1. 1. 共價(jià)結(jié)合的反應(yīng)過程共價(jià)結(jié)合的反應(yīng)過程 FeulgenFeulgen反應(yīng)，反應(yīng)，F(xiàn)ITCFITC與蛋白質(zhì)分子中的與蛋白質(zhì)分子中的 自由氨基形成的硫碳氨基鍵等。自由氨基形成的硫碳氨基鍵等。2. 2. 插入性結(jié)合方式的反應(yīng)過程插入性結(jié)合方式的反應(yīng)過程 EBEB，PIPI，7-7-氨基放線菌素氨基放線菌素D( 7-AAD )D( 7-AAD )等。等。 結(jié)合緊密、穩(wěn)定，染料不會(huì)丟失脫落，結(jié)合緊密、穩(wěn)定，染料不會(huì)丟失脫落， 簡便，特異性較高，被廣泛應(yīng)用簡便，特異性較高，被廣泛應(yīng)用。3. 3. 結(jié)構(gòu)親合方式的反應(yīng)過程結(jié)構(gòu)親合方式

57、的反應(yīng)過程 吖啶橙與核酸單鏈結(jié)合，派若寧吖啶橙與核酸單鏈結(jié)合，派若寧Y Y與單與單 鏈核酸結(jié)合等。反應(yīng)過程易受溶液鏈核酸結(jié)合等。反應(yīng)過程易受溶液pHpH的的 影響。結(jié)合極弱影響。結(jié)合極弱, ,易丟失易丟失。（四）（四）FCMFCM熒光細(xì)胞化學(xué)的分類熒光細(xì)胞化學(xué)的分類第111頁/共126頁表表1-2 1-2 常用熒光探針的光譜特性常用熒光探針的光譜特性 分類分類 染料染料 激發(fā)譜激發(fā)譜 發(fā)射譜發(fā)射譜 FITC 紫紫 藍(lán)藍(lán) 綠綠 TRITC TRITC 藍(lán)藍(lán) 綠綠 紅紅 XRITC XRITC 綠綠 黃黃 紅紅 Texas Red Texas Red 綠綠 黃黃 紅紅 Phycocyanin Ph

58、ycocyanin 綠綠 黃黃 紅紅 Allophycocyanin Allophycocyanin 紅紅 紅紅細(xì)胞表面標(biāo)記染料第112頁/共126頁 Propidium Iodide 藍(lán)藍(lán)- -綠綠 紅紅 Acridine Orange 藍(lán)藍(lán) 綠綠 Ethidium Bromide 藍(lán)藍(lán)- -綠綠 紅紅 Hoechst33258/33342 紫外紫外 藍(lán)藍(lán) DAPI 紫外紫外 藍(lán)藍(lán) DIPI 紫外紫外 藍(lán)藍(lán) Mithramycin 紫紫- -藍(lán)藍(lán) 綠綠 Chromomycin A3 紫紫- -藍(lán)藍(lán) 綠綠 Acriflavine 藍(lán)藍(lán) 綠綠- -黃黃分類 染料 激發(fā)譜 發(fā)射譜細(xì)胞DNA染料第113頁/共126頁 細(xì)胞細(xì)胞RNA AcridineAcridine OrangeOrange 藍(lán)藍(lán) 綠綠 染料染料 Pyronine YPyronine Y 藍(lán)藍(lán)- -綠綠 紅紅 FITCFITC 紫紫- -藍(lán)藍(lán) 綠綠 TRITCTRITC 藍(lán)藍(lán)- -綠綠 紅紅 細(xì)胞蛋細(xì)胞蛋 Sulforhodamin